王皓南，范 晶，余坤子，陸靜嫻，劉軍玲，王 瑩*，金紅宇，馬雙成*

霍山石斛多糖的結(jié)構(gòu)分析、生物活性研究進(jìn)展及與不同種間多糖成分差異性分析

王皓南1, 2，范 晶2，余坤子2，陸靜嫻3，劉軍玲4，王 瑩2*，金紅宇2，馬雙成2*

1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京 100005 2. 中國食品藥品檢定研究院，北京 100050 3. 浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310053 4. 安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051

霍山石斛作為一種名貴的滋補類中藥，收載于《中國藥典》2020年版。多糖為其主要活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、保肝、抗腫瘤、抗氧化和抗炎等藥理活性。通過查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，基于中國知網(wǎng)及PubMed等中英文文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫分析當(dāng)前研究現(xiàn)狀及研究熱點；總結(jié)霍山石斛多糖（polysaccharide，DHP）的提取分離、結(jié)構(gòu)解析及其生物活性；分析其多糖成分與其他常用石斛品種的差異性。以期更好地開發(fā)利用DHP，為DHP產(chǎn)品的深入開發(fā)與研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善提供參考和思路。

霍山石斛；多糖；可視化分析；結(jié)構(gòu)分析；生物活性；差異分析

霍山石斛C. Z. Tang et S. J. Cheng味甘，微寒，歸胃、腎經(jīng)，具有益胃生津、滋陰清熱等功效[1]。以“一名林蘭”始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為中藥上品[2]?；羯绞云湮陡省べ|(zhì)厚的上乘品質(zhì)成為石斛中的極品，倍受歷代醫(yī)家推崇，且冠有“中華仙草之最”之稱[3]。霍山石斛主產(chǎn)于安徽霍山鄰近地區(qū)，亦分布于河南境內(nèi)，是在歷代本草中具有明確記載的藥用石斛[4]?！吨袊幍洹?015年版石斛項下品種規(guī)定為金釵石斛、鼓槌石斛、流蘇石斛的栽培品及其同屬植物近似種的新鮮或干燥莖[5]，見圖1，《中國藥典》2020年版石斛項下[1]新增霍山石斛。

圖1 《中國藥典》2020年版中收錄石斛屬藥材品種

霍山石斛含有豐富的化學(xué)成分，包括有生物堿類、多糖類、酚類、甾體類及揮發(fā)油等[6]。其中多糖類成分作為石斛中的重要活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、保肝、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[7-9]?！吨袊幍洹?020年版中多糖是霍山石斛【含量測定】項下的質(zhì)控指標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)中采用紫外-可見分光光度法對霍山石斛多糖（polysaccharide，DHP）含量進(jìn)行測定，要求按干燥品計，不得少于17.0%?；羯绞械亩嗵穷惓煞志哂猩砘钚燥@著、不良反應(yīng)小等特點，已有研究對其結(jié)構(gòu)、生物活性等進(jìn)行研究。本文基于CiteSpace軟件對中英文文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫中DHP相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行可視化分析，概述當(dāng)前研究現(xiàn)狀及熱點。同時，對DHP的提取分離、結(jié)構(gòu)解析及其生物活性進(jìn)行總結(jié)，并將霍山石斛與其他常用石斛品種的多糖成分進(jìn)行差異性分析，為DHP產(chǎn)品的深入開發(fā)與研究提供參考，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善提供思路。

1 基于CiteSpace分析DHP的研究現(xiàn)狀

1.1 數(shù)據(jù)來源及處理

通過中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫（China National Knowledge Infrastructure，CNKI）及PubMed等中英文文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫中檢索與DHP相關(guān)的國內(nèi)外文獻(xiàn)。在CNKI以霍山石斛和多糖等為主題詞檢索中文文獻(xiàn)，PubMed中以和polysaccharide為主題詞檢索英文文獻(xiàn)。剔除無關(guān)、重復(fù)文獻(xiàn)，最終納入文獻(xiàn)168條，其中中文文獻(xiàn)113篇，英文文獻(xiàn)55篇。運用CiteSpace軟件進(jìn)行發(fā)文趨勢、關(guān)鍵詞、機(jī)構(gòu)合作網(wǎng)絡(luò)等可視化分析，部分知識圖譜見圖2。

1.2 結(jié)果及趨勢分析

關(guān)于DHP的報道首次見于2003年[10]，2003—2007年研究開始逐步呈遞增趨勢，2007—2022年發(fā)文數(shù)量在0～12篇呈現(xiàn)波浪式（圖2-A）。對DHP研究的關(guān)鍵詞進(jìn)行分析，有利于掌握該領(lǐng)域各時期的研究熱點及未來發(fā)展方向。DHP研究的中文文獻(xiàn)關(guān)鍵詞頻次大于等于5次的統(tǒng)計見圖2-A，研究主要集中在種源培養(yǎng)、結(jié)構(gòu)分析、生物活性等方面。DHP的英文文獻(xiàn)發(fā)表較少，依據(jù)研究熱點關(guān)鍵詞分析研究主要集中在生物活性上（圖2-B）。從圖2-C可知，2005—2010年主要研究霍山石斛的種源培養(yǎng)等對DHP合成的影響；隨著國內(nèi)藥理學(xué)研究的廣泛開展，自2010年起DHP的生物活性研究逐漸活躍，研究熱點為肝臟保護(hù)、抗衰老、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等生理活性；由于大分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜、解析難度大，自2014起才逐步開展DHP的結(jié)構(gòu)表征等研究。基于CiteSpace的關(guān)鍵詞突現(xiàn)分析，推測DHP的未來研究熱點應(yīng)是深入探索其結(jié)構(gòu)解析、生物活性機(jī)制等。

2 提取與分離

2.1 提取

多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且常與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等結(jié)合成多糖復(fù)合物，同時聚集體的形成不利于多糖的提取分離[11]。中藥中多糖成分常見的提取方法包括熱水浸提法、微波輔助法等，一般情況下多糖得率被作為評價多糖提取效率的重要指標(biāo)。霍山石斛作為大宗品種的名貴藥材，且多糖含量高，選擇適宜的提取方法對其產(chǎn)品開發(fā)具有重要意義。但霍山石斛中多糖成分的提取不同于其他中藥，有研究表明石斛屬藥用植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較密，其主要成分難以用常規(guī)方法提取[12]。本研究對目前已報道的DHP的提取方法進(jìn)行總結(jié)，主要分為傳統(tǒng)提取技術(shù)和新興提取方法，見表1。

A-2000—2022年DHP研究的中、英文發(fā)文情況 B-DHP相關(guān)研究熱點詞網(wǎng)絡(luò)圖（a-中文文獻(xiàn) b-英文文獻(xiàn)） C-CNKI中DHP研究的關(guān)鍵詞突現(xiàn)分析

2.1.1 傳統(tǒng)提取方法 DHP的傳統(tǒng)提取方法為熱水浸提法，此法因其操作簡單，是中藥多糖提取最廣泛使用的方法。但此法一般適用于提取胞壁外多糖，故采用此法DHP的多糖得率較低[13-18]。此外，有研究采用微波或超聲波輔助等方法提取DHP[12,19-20]，上述方法可以結(jié)合使用，且提取時間顯著縮短，但多糖經(jīng)超聲或微波處理后其糖鍵可能會發(fā)生斷裂[25]，是否會因結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而影響DHP的生物活性，仍有待探討。

2.1.2 新興提取技術(shù) 中藥的細(xì)胞壁主要由纖維素構(gòu)成，石斛多糖與纖維素含量呈反比[26]，推測細(xì)胞壁中的纖維素可能是制約DHP最大限度溶出的主要物質(zhì)。而特異性的降解纖維素破壞細(xì)胞壁，可使細(xì)胞內(nèi)多糖最大限度地溶出[21]。采用纖維素酶提取多糖是促進(jìn)多糖溶出細(xì)胞的方法之一，可提高得率且條件溫和，但多糖成分亦可能被纖維素酶降解[27]。近年來研究者提出使用半仿生方法提取DHP，利用模擬胃液、腸液，并通過單因素與正交實驗得到最佳提取條件[22]。Wang等[23]于2022年提出使用亞臨界水提法提取DHP，與傳統(tǒng)提取方法相比，該法可更快速、有效地提取多糖成分，得率達(dá)到19.52%。同時由于水是唯一的提取溶劑，亞臨界水提取法還具有環(huán)保和安全的特點[23]。有研究表明溫度升高會降低多糖得率和抗氧化性[28]，王升貴等[24]采用超微低溫萃取技術(shù)提取DHP，得率高達(dá)64.04%，該法避免了提取過程中高溫處理對多糖含量及活性的影響。總之，在選擇DHP提取方法時，需要綜合分析實驗?zāi)康?，并結(jié)合多糖的結(jié)構(gòu)特征和生物活性，進(jìn)而選擇合適的提取方法。

2.2 分離純化

在獲得粗多糖后，需對其進(jìn)行分離純化，去除色素、蛋白質(zhì)及小分子等雜質(zhì)，進(jìn)而獲得均一化的多糖成分[27,29]。對DHP的分離純化方法[8,18,30-44]進(jìn)行總結(jié)，見表2。

2.2.1 脫色 經(jīng)過前處理獲得的粗多糖一般也含有一定的顏色，需要進(jìn)行脫色。石斛常用的脫色方法有乙醇脫色法、H2O2脫色法、活性炭脫色法及DEAE-纖維素柱色譜法等。通過對4種方法的效果比較發(fā)現(xiàn)：DEAE-纖維素柱色譜法脫色效果最佳，多糖損失率較小，且DEAE-纖維素材料可再生使用[18,31]。其他3種方法在對多糖脫色時存在一定的局限性，乙醇脫色法利用相似相溶原理，使有機(jī)色素溶解于乙醇中，損失率最大，脫色效果最差[14]；H2O2脫色并不能使色素完全去除，且濃度過高易降解多糖；活性炭脫色存在色素與多糖同時被吸附的現(xiàn)象，從而造成多糖的損失。

2.2.2 脫蛋白 中藥粗多糖一般含有一定量的蛋白，常用蛋白去除方法包括：三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）法、鹽酸等電法、Sevag法及酶解法。前2種方法原理相似，即使蛋白質(zhì)變性形成沉淀后，離心或濾過去除。此法使用溶液濃度不宜過大，避免造成多糖的損失[18]。有報道針對性的對DHP脫蛋白的方法進(jìn)行研究，結(jié)果表明0.5% TCA脫蛋白效果較好且多糖損失率較低[30]，Sevag法脫蛋白效果優(yōu)于TCA法[32]，酶法與Sevag法聯(lián)用在蛋白脫除率及多糖得率上表現(xiàn)優(yōu)于單種方法[45]。因此可考慮2種方法聯(lián)合使用進(jìn)行脫蛋白，以提高DHP中蛋白的脫除率，同時降低多糖損失。此外，亦有采用陰離子交換樹脂脫蛋白，此法有機(jī)溶劑消耗小、多糖損失率低、環(huán)保經(jīng)濟(jì)[37]。

2.2.3 去除小分子雜質(zhì) 在進(jìn)行多糖的脫蛋白脫色后，仍有小分子雜質(zhì)的殘留，如單糖、低聚糖、無機(jī)鹽及殘留溶劑。DHP中去小分子雜質(zhì)的研究報道較少，但多糖中通常應(yīng)選擇合適的透析膜進(jìn)行透析。雖然透析膜具有一定的截留相對分子質(zhì)量范圍，但有些多糖分子是線性的，因此有時相對分子質(zhì)量較大的多糖分子也可能通過透析袋。

2.2.4 純化 在脫色、脫蛋白后，要得到均一的多糖成分，還需進(jìn)一步純化?，F(xiàn)有報道中DHP的純化多采用柱色譜分離法，即使用離子交換色譜法分離后，再使用凝膠濾過色譜獲得純化多糖。常用的陰離子交換材料包括：DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖、DEAE-瓊脂糖等，其中DEAE-52纖維素應(yīng)用最為廣泛。凝膠濾過法通常采用Sephadex G、Sephadex S等系列的凝膠柱，也有學(xué)者采用瓊脂糖CL-6B凝膠柱進(jìn)行純化[30-37]。

3 結(jié)構(gòu)分析

多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包括有4級結(jié)構(gòu)，但現(xiàn)有研究一般從糖含量、單糖組成、相對分子質(zhì)量、糖連接位置等方面對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，上述結(jié)構(gòu)與多糖活性亦有密切關(guān)聯(lián)[46]。除了經(jīng)典的多糖分析方法外，近些年亦有研究者提出糖譜法進(jìn)行多糖的質(zhì)量分析。本文從基本糖含量、相對分子質(zhì)量、單糖組成、糖連接位置、糖譜法5個方面對DHP的結(jié)構(gòu)分析研究情況進(jìn)行總結(jié)，見圖3。

3.1 多糖的糖含量及蛋白含量測定

DHP糖含量測定的方法為苯酚-硫酸比色法或蒽酮硫酸比色法，此法以葡萄糖為對照品，采用紫外分光光度計進(jìn)行測定。已有研究表明此法檢測的DHP含量為9.90%～46.35%[47-49]，《中國藥典》2020年版采用苯酚硫酸法測定霍山石斛中多糖含量，規(guī)定其含量不得少于17.0%。此外，Hao等[47]采用衰減全反射紅外光譜法（attenuated total reflection near infrared，ATR-NIR）測定DHP的糖含量。作為一種基于光學(xué)內(nèi)反射原理的快速檢測技術(shù)，ATR-NIR法無損、無標(biāo)記、綠色、環(huán)保，廣泛用于中藥的分析與表征[50]。與比色法、TMS-GC-MS法相比，ATR-NIR可大大減少分析步驟，降低分析成本[47]。DHP多采用BCA蛋白檢測試劑盒進(jìn)行蛋白測定，Li等[38]采用BCA法對提取的DHPW1中蛋白含量進(jìn)行分析，得出其蛋白含量為0.15%；田長城[39]使用福林酚法測得DHP1中蛋白含量為0.6%。

表2 霍山石斛的多糖類成分

HPTLC-高效薄層色譜法 PMP-HPLC-前衍生化法-高效液相色譜 GC-MS-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 NMR-核磁共振波譜法 HPSEC-MALLS-RID-高效分子排阻色譜-多角度激光散射法 HPGPC-高效凝膠滲透色譜技術(shù) PACE-糖凝膠電泳

3.2 相對分子質(zhì)量

多糖的相對分子質(zhì)量對其活性影響較大，一般認(rèn)為相對分子質(zhì)量越大其分子體積越大，不利于跨膜進(jìn)入生物體內(nèi)；多糖的相對分子量越小則容易與活性位點結(jié)合；而相對分子質(zhì)量過小又不利于形成聚合結(jié)構(gòu)[51]。目前DHP的相對分子量的常用測定方法包括：HPGPC法、HPSEC-MALLS-RID法等，現(xiàn)有研究中DHP的相對分子質(zhì)量測定結(jié)果見表2。從表2可看出，目前通過分離純化得到的多糖其相對分子質(zhì)量差異較大，這可能與提取分離方法及采用的相對分子質(zhì)量檢測方法相關(guān)。如使用超聲波輔助提取法和熱水提取法分別提取得到DHP-1A和UDHP-1A，2種多糖均為相對分子質(zhì)量均一體系，相對分子質(zhì)量分別為1.17×104和6.08×103[20]。郝杰等[13]使用40%、50%、60%、80%乙醇對霍山石斛總多糖分級沉淀，分別獲得4.79×105、3.16×105、3.07×105、8.59×104的多糖。

3.3 單糖組成

單糖作為多糖的重要結(jié)構(gòu)特征，可專屬性的反映多糖結(jié)構(gòu)特點，在中藥多糖研究中尤為重要[46]。單糖組成的分析方法主要有GC-MS法、PMP-HPLC法、薄層色譜法、高效陰離子交換色譜安培檢測法（high performance anion exchange chromatography- pulsed amperometric detecter，HPAEC-PAD）及毛細(xì)管電泳法等，DHP的單糖組成目前常用GC-MS和PMP-HPLC等方法進(jìn)行測定。DHP主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖等組成，還包括葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等成分[34,38-44,51-52]。Pan等[31]對霍山石斛采用石油醚和乙醇依次提取得到粗多糖后，使用DEAE纖維素陰離子交換柱、Sephacryl S-200柱進(jìn)一步分離純化得到霍山石斛純多糖DHPW2，通過GC-MS分析發(fā)現(xiàn)主要由葡萄糖、木糖和半乳糖組成，其摩爾比接近1∶1∶0.5。Li等[38]將霍山石斛在50%乙醇中脫水48 h，然后在95%乙醇中脫水48 h，并使用DEAE-52-纖維素柱和凝膠色譜自動純化系統(tǒng)進(jìn)一步純化后得到DHPW1，采用HPAEC-PAD法分析得到單糖組成，甘露糖-葡萄糖-半乳糖37.8∶21.9∶1。劉冰[53]采用水提醇沉和添加α-淀粉酶方法得到霍山石斛粗多糖cDHP，cDHP經(jīng)纖維素陰離子交換樹脂DEAE- cellulose進(jìn)一步純化，得到水洗脫的均一組分多糖cDHP-W，采用PMP-HPLC法檢測單糖組成得到甘露糖-葡萄糖3∶1。表明不同的提取分離方法所獲得的多糖，其單糖組成及物質(zhì)的量比存在較大差異。

3.4 糖連接位置

多糖的糖連接位置主要采用GC-MS、基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜、1D和2D NMR等技術(shù)進(jìn)行分析和推測。通常使用酸水解分析多糖主鏈和支鏈的單糖組成；高碘酸氧化-Smith降解后分析糖單元的鍵型構(gòu)成及連接部位分析；甲基化GC-MS用以分析糖單元鍵型、連接部位及比例確定；NMR法分析碳?xì)錃w屬及糖連接順序。研究表明DHP的糖連接位置與藥理作用密切相關(guān)。Li等[38]發(fā)現(xiàn)DHPW1成分的促成骨活性與主鏈結(jié)構(gòu)(1→4)-linked-β--Glcp直接相關(guān)。一種新發(fā)現(xiàn)的免疫刺激性多糖DHP-4A，其骨架由(1→6)-Glc、(1→6)-Man和(1→3,6)-Man組成，可有效促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和IL-10等[54]。此外，通過修飾DHP結(jié)構(gòu)，亦會對其生物活性產(chǎn)生影響，DHP硫酸化后，其抗糖基化活性顯著增強(qiáng)[42]。

3.5 糖譜法

糖譜法[55-56]是指通過系列定位酶切技術(shù)聯(lián)用各種色譜分析，結(jié)合多糖活性評價，可實現(xiàn)基于活性結(jié)構(gòu)特征的多糖定性、定量分析，并應(yīng)用于多種中藥多糖及其產(chǎn)品的質(zhì)量控制[46]。糖譜法的關(guān)鍵步驟在于確定酶的種類，并能通過酶解產(chǎn)生特異性的多糖片段，最終通過色譜法對特異性片段分析實現(xiàn)對不同多糖的鑒別。目前，有研究采用HPSEC- MALLS-RID、GC-MS、NMR和基于PACE、HPTLC多糖分析的糖圖譜，對DHP進(jìn)行定性定量分析[49]。其中，多糖部分酸水解和酶水解產(chǎn)物的PACE指紋圖譜與HPTLC指紋圖譜相似。

4 生物活性

4.1 免疫調(diào)節(jié)

DHP具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，研究表明其對于免疫細(xì)胞及腸道黏膜均可產(chǎn)生正向調(diào)節(jié)作用。王超群等[57]和徐海軍等[58]發(fā)現(xiàn)DHP具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用，改善環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能降低，緩解卡介苗誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能亢進(jìn)。同時發(fā)現(xiàn)其對腹腔巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的強(qiáng)弱與多糖結(jié)構(gòu)存在密切關(guān)聯(lián)，袁晨琳[44]研究發(fā)現(xiàn)DHP中具有各自的結(jié)構(gòu)特征的7種組分多糖（HPS1-A～G），其中，巨噬細(xì)胞分泌一氧化氮的影響與多糖1,4-linked-Glcp和1,3,6-linked-Manp含量呈正相關(guān)，與1-linked-Galp含量及相對分子質(zhì)量大小呈負(fù)相關(guān)；刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的活性與1,4,6-linked-Glcp和1,3,6-linked-Manp的含量呈正相關(guān)，而與相對分子質(zhì)量大小呈負(fù)相關(guān)。

DHP的免疫調(diào)節(jié)活性不僅與多糖結(jié)構(gòu)有關(guān)，還與給藥濃度、溫度相關(guān)。郝冉等[59]采用溴化氰活化法對DHP進(jìn)行熒光標(biāo)記，檢測其腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性，發(fā)現(xiàn)DHP 200 μg/mL作用最為顯著，為空白對照組的160.5%。DHP的提取量隨提取溫度的升高而增加，但其腸道黏膜免疫調(diào)節(jié)活性隨提取溫度的升高而下降[60]。Xie等[61]對DHP的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制進(jìn)行研究（圖4），發(fā)現(xiàn)DHP可通過Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）刺激腸上皮細(xì)胞，進(jìn)一步誘導(dǎo)固有層細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。同時，DHP對脾細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中c-干擾素和TNF-α的產(chǎn)生具有明顯的刺激作用，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌一氧化氮和TNF-α，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅細(xì)胞的能力[35,44,61-63]。此外，DHP具有腸黏膜免疫調(diào)節(jié)活性，被小腸吸收后分布于腸道固有層內(nèi)，并可通過Peyer’s結(jié)刺激骨髓細(xì)胞的增殖[59]。

4.2 保肝作用

DHP具有明顯的肝臟保護(hù)功能，且保肝作用與其抗氧化、抗炎和抗凋亡作用密切有關(guān)。黃靜等[64]和田長城等[65]通過研究DHP對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型保肝作用的影響，發(fā)現(xiàn)DHP可顯著降低小鼠血清中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平的升高，減輕四氯化碳對肝組織的病理損傷，降低肝勻漿中丙二醛含量，增強(qiáng)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性。同時，DHP各劑量組肝組織中TNF-α表達(dá)顯著降低，炎癥反應(yīng)減輕，肝細(xì)胞損傷得到明顯改善[64]。其中，DHP可刺激腸黏膜相關(guān)免疫系統(tǒng)分泌促進(jìn)骨髓細(xì)胞增殖細(xì)胞因子，并且DHP被三氟乙酸全水解為單糖后其免疫活性全部消失，表明DHP是以大分子的形式調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)[66]。

PI3K/Akt-磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B MAPKs-絲裂原活化蛋白激酶 NF-κB-核因子-κB CINC-1-中性粒細(xì)胞趨化因子-1 MCP-1-單核細(xì)胞趨化蛋白-1

DHP對肝損傷和肝纖維化有干預(yù)作用，可有效減少轉(zhuǎn)化生長因子-β1和肝臟內(nèi)膠原蛋白表達(dá)，阻止肝纖維化的形成，從而維持肝實質(zhì)細(xì)胞膜的正常流動性[67]。此外，DHP可改善酒精誘導(dǎo)的肝組織脂質(zhì)代謝異常，通過提高SOD和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的活性、谷胱甘肽的含量及降低丙二醛的水平。從而維持肝組織的抗氧化體系平衡狀態(tài)，加快酒精及其代謝產(chǎn)物的氧化、水解、排出，減輕并改善代謝產(chǎn)物乙醛對肝細(xì)胞的病理損傷[68-69]。在非酒精性脂肪性肝損傷中，DHP對肝組織內(nèi)總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白等生理生化指標(biāo)有一定的抑制作用，表明對脂質(zhì)代謝平衡具有一定調(diào)節(jié)功效，且具有降低患有心血管類疾病的風(fēng)險[70]。

4.3 抗炎

中藥多糖可通過調(diào)控炎性信號通路，活化轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放，從而發(fā)揮其抗炎作用[71-72]。研究表明DHP可抑制巨噬細(xì)胞炎性介質(zhì)的表達(dá)和分泌，減輕結(jié)腸黏膜損傷，改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎，抑制足腫脹小鼠環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）活性的作用（圖5）[73-74]。其作用機(jī)制主要通過與巨噬細(xì)胞表面的TLR4受體結(jié)合，抑制相關(guān)信號通路，有效阻斷NF-κB和激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）的DNA結(jié)合活性。同時，iNOS、COX-2等的激活受到抑制，和等mRNA表達(dá)降低，最終減少一氧化氮、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、TNF-α和IL-1β的釋放，從而緩解炎性[43,75-76]。此外，DHP可通過減少特應(yīng)性皮炎相關(guān)的細(xì)胞因子，從而較好的改善兒童特應(yīng)性皮炎癥狀，并且口服4周后暫無不良影響[77]。此外，DHP通過抗炎作用亦可對動脈粥樣硬化發(fā)揮具有治療作用，顯著改善高膽固醇飲食誘導(dǎo)的脂質(zhì)沉積、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，主要表現(xiàn)為SOD活性顯著提高，斑塊形成減少，中性粒細(xì)胞募集和總膽固醇、三酰甘油、丙二醛和活性氧水平等降低[78]。

4.4 抗氧化與抗衰老

氧化與衰老都與體內(nèi)自由基和氧化反應(yīng)相關(guān)，當(dāng)前研究表明DHP具有較好的抗氧化活性（圖5）。DHP可顯著改善衰老模型大鼠小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)[79]，并對FeCl2誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)具有明顯的抑制作用，可減輕其肝線粒體氧化損傷，有效提升-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞的活力[80-81]。同時，通過抑制衰老相關(guān)基因表達(dá)，使蛋白表達(dá)降低，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期，降低氧化應(yīng)激，從而維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境與機(jī)體組織器官穩(wěn)態(tài)，并發(fā)揮抗衰老作用[82-83]。此外，不同相對分子質(zhì)量的DHP成分均有抗氧化作用，其中組分S1（4.79×105）對H2O2、OH的清除作用強(qiáng)于其他多糖組分[13]。不同提取工藝的DHP抗氧化能力不同，超聲波輔助提取的DHP還原力和2,2-聯(lián)氮基雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基清除力比于熱水浸提工藝更強(qiáng)[20]。

圖5 DHP的抗炎、抗氧化作用

4.5 抗腫瘤

DHP對多種類型的惡性腫瘤細(xì)胞有一定的治療作用，并且具有久服厚腸胃的傳統(tǒng)功效。研究表明DHP對胃癌細(xì)胞生長有明顯的抑制作用，且抑制效果與劑量、時間呈正相關(guān)[84]。同時，DHP可抑制胃癌細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)其凋亡，其抗胃癌活性與有效上調(diào)腫瘤凋亡相關(guān)基因p53、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein- asparate protease-3，Caspase-3）和Caspase-9等表達(dá)相關(guān)，并且可下調(diào)血管生成相關(guān)基因和CD34表達(dá)與分泌、抑制腫瘤血管生成，增強(qiáng)腫瘤組織T細(xì)胞免疫功能[53]。此外，DHP可增加肺泡數(shù)量，增厚肺泡壁，抑制肺大皰形成，減少炎癥細(xì)胞浸潤，從而抵抗香煙誘導(dǎo)的肺部炎癥，抑制香煙誘導(dǎo)的血清和肺中TNF-α和IL-1β分泌的增強(qiáng)[76]。DHP對CT26-W結(jié)腸癌荷瘤小鼠具有顯著的抗腫瘤作用，可能在其抑制腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[85]。Liu等[8]通過對霍山石斛的莖、根、葉、花中多糖成分的抗胃癌活性進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)霍山石斛不同部位中的多糖成分均表現(xiàn)出抗腫瘤活性。其中，莖多糖（cDHPS）表現(xiàn)出最佳的抗胃癌活性，其抗胃癌活性的差異與其結(jié)構(gòu)特征差異有關(guān)。cDHPS結(jié)構(gòu)是由 (→4)-β--Manp-(1→和→4)-β--Glcp-(1→) 組成的-乙酰化多糖，乙?；B接在(→4)-β--Manp- (1→) 的-3位，與cDHPS相比，其他多糖均為支鏈多糖。

5 不同品種間及不同生長年限、生長模式下石斛屬藥材多糖差異性分析

《中國藥典》2020年版[1]石斛項下收錄的品種包括霍山石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、流蘇石斛；此外鐵皮石斛在《中國藥典》2020年版中作為單獨品種收錄。多糖作為霍山石斛中的重要活性成分，無論是從質(zhì)量評價還是產(chǎn)業(yè)發(fā)展來看，對其不同品種間、生長年限及生長模式下多糖的差異性進(jìn)行比較研究具有重要意義。

5.1 不同品種間石斛屬藥材多糖差異性分析

除鐵皮石斛多糖（21.8%）外，DHP（34.8%）的含量遠(yuǎn)高于《中國藥典》中其他石斛多糖的含量（金釵石斛：3.53%、鼓槌石斛：5.61%、流蘇石斛：2.43%）[86-87]。葉夢娟等[88]對8個品種石斛（霍山石斛、河南石斛、細(xì)莖石斛、紫皮石斛、鐵皮石斛、金釵石斛、鼓槌石斛、流蘇石斛）進(jìn)行單糖組成分析發(fā)現(xiàn)，均由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖組成，含量上存在一定的差異。其中，紫皮石斛中甘露糖占比達(dá)到84.35%，而葡萄糖含量僅2.36%，其單糖含量及組成摩爾比明顯區(qū)別于其他石斛，為鑒別紫皮石斛提供了新思路。此外，有研究對霍山石斛和其他4種藥典石斛粗多糖的降血糖活性效果綜合分析發(fā)現(xiàn)，霍山石斛粗多糖通過胰內(nèi)外2種作用機(jī)制協(xié)同干預(yù)糖尿病小鼠，降血糖效果最優(yōu)[89]。DHP表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，且顯著優(yōu)于鐵皮石斛多糖[90]，在對DHP與鐵皮石斛、金釵石斛、鼓槌石斛3種多糖比較后發(fā)現(xiàn)，DHP對四氧嘧啶所致的氧化損傷保護(hù)作用最強(qiáng)，且DHP抗氧化能力優(yōu)于其他石斛多糖[91]。同時，DHP在與其他品種多糖保肝作用比較研究中顯示出較好的保肝效果，這可能與多糖含量、相對分子質(zhì)量、單糖組成和糖苷鍵連接方式等相關(guān)聯(lián)[92-93]。

5.2 不同生長年限、采收季節(jié)的石斛屬藥材多糖差異性分析

一般認(rèn)為優(yōu)質(zhì)的霍山石斛生長年限較長，同時通過對不同生長年限的霍山石斛進(jìn)行代謝組學(xué)分析，得出最佳收獲時間為3年[94-95]，并且3年生的多糖含量優(yōu)于4年生[96]。在3年的生長期里，總糖含量先下降后增加，這些變化可能與其營養(yǎng)階段的自身轉(zhuǎn)化和能量代謝有關(guān)[93]。Hao等[47]通過對不同采收期的霍山石斛干燥莖多糖進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)多糖含量存在一定的季節(jié)性規(guī)律，這可能于不同月份的濕度和光照有關(guān)。在5～9月份（夏季）多糖主要表現(xiàn)為高相對分子質(zhì)量組分，低相對分子質(zhì)量組分基本消失[47]。有研究對不同生長年限的霍山石斛保肝作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)2年生霍山石斛保肝作用最佳，其多糖含量達(dá)到峰值，隨后逐漸下降[97]。

5.3 不同生長模式的石斛屬藥材多糖差異性分析

野生霍山石斛資源稀少，現(xiàn)有資源已不能滿足當(dāng)前市場需求。因此，通過栽培技術(shù)可實現(xiàn)霍山石斛的大規(guī)模種植，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。在對大棚栽培、林隙地栽培和活樹附生3種栽培模式下霍山石斛產(chǎn)量及品質(zhì)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)活樹附生栽培下霍山石斛活性成分積累較多，品質(zhì)更好，為實現(xiàn)高品質(zhì)栽培霍山石斛提供理論依據(jù)[98]。綜上，DHP無論是從多糖含量還是生物活性上都顯示出一定的優(yōu)勢。

市場流通霍山石斛價格高、商品規(guī)格復(fù)雜，導(dǎo)致很多其他種屬石斛植物混入藥材市場，假冒偽劣、以劣充好的問題屢見不鮮。傳統(tǒng)的質(zhì)量控制手段如性狀鑒別、薄層色譜鑒別等，難以對霍山石斛藥材進(jìn)行有效的質(zhì)量控制。因此，提高檢測方法專屬性、準(zhǔn)確性極具意義。多糖作為霍山石斛中的重要活性成分，應(yīng)作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制的重要指標(biāo)。此處，可運用新思路開發(fā)DHP測定方法，如采用生物活性檢測法評價其功效活性，進(jìn)而可全面反映藥材質(zhì)量。

6 結(jié)語與展望

霍山石斛作為上品中藥，既是中藥也是保健食品，富有極高的商業(yè)價值[99-100]。多糖作為霍山石斛中主要成分和重要功效成分，對產(chǎn)品開發(fā)和質(zhì)量評價具有重要意義。本文對DHP的研究現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)，認(rèn)為DHP研究仍存在幾個關(guān)鍵問題需要解決突破：（1）多糖結(jié)構(gòu)解析和構(gòu)效關(guān)系的研究仍不夠深入，大多只是提取了霍山石斛粗多糖，同時對其單糖組成、相對分子質(zhì)量進(jìn)行測定，鮮有研究對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入解析。故應(yīng)加強(qiáng)DHP的化學(xué)結(jié)構(gòu)研究，并在一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)層次上開展多糖的構(gòu)效關(guān)系研究，為深入開發(fā)DHP產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。（2）多糖作用機(jī)制研究仍不夠深入。盡管已有研究從細(xì)胞、動物模型證明其活性，但多糖作用途徑還未進(jìn)行深入探討。多糖的代謝研究是探索其作用途徑的關(guān)鍵部分，然而目前僅采用體外實驗考察口服DHP在胃中的代謝情況。多糖在人體內(nèi)的吸收、分布及代謝是一直以來的研究難點，后期應(yīng)采用多組學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等技術(shù)對其進(jìn)行深入探索。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Progress on structural analysis and bioactivity of polysaccharides ofand analysis of differences in polysaccharide composition between different species

WANG Hao-nan1, 2, FAN Jing2, YU Kun-zi2, LU Jing-xian3, LIU Jun-ling4, WANG Ying2, JIN Hong-yu2, MA Shuang-cheng2

1. Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100005, China 2. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China 3. Zhejiang Institute of Food and Drug Inspection, Hangzhou 310053, China 4. Anhui Institute of Food and Drug Inspection, Hefei 230051, China

Huoshan Shihu (), as a valuable tonic Chinese medicine, is included in the 2020 edition of. Polysaccharide is one of its main active ingredients, with pharmacological activities such as immunomodulation, hepatoprotection, antitumor, antioxidantion and anti-inflammation. By reviewing the domestic and overseas literatures, we analyzed the current research status and research hotspots based on Chinese and English literature databases such as China National Knowledge Infrastructure and PubMed. The extraction and isolation ofpolysaccharides (DHP), structural analysis and their biological activities were summarized, and the differences in polysaccharide compositions between commonly usedspecies were analyzed, with view to better developing and utilizing the components of DHP, and providing reference and ideas for the in-depth development and research and the improvement of quality standards of DHP products.

C. Z. Tang et S. J. Cheng; polysaccharides; visualization analysis; structural analysis; biological activity; differential analysis

R284

A

0253 - 2670(2023)15 - 5044 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.029

2023-03-01

國家自然基金青年資助項目（82204617）

王皓南，博士研究生，研究方向為中藥質(zhì)量與安全。E-mail: hanor312@163.com

通信作者：王 瑩，博士，副研究員，從事中藥質(zhì)量與安全研究。Tel: (010)53852484 E-mail: wayi_1986@163.com

馬雙成，博士生導(dǎo)師，研究員，從事中藥質(zhì)量與安全研究。Tel: (010)53852076 E-mail: masc@nifdc.org.cn

[責(zé)任編輯 趙慧亮]