谷 佳，石雅寧, 3，邱 韻，何 鵬，賀衛(wèi)和, 2，覃 麗, 2, 4*

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討雷公藤紅素抗血管重塑的作用機(jī)制

谷 佳1，石雅寧1, 3，邱 韻1，何 鵬1，賀衛(wèi)和1, 2，覃 麗1, 2, 4*

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 干細(xì)胞中藥調(diào)控與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，湖南 長(zhǎng)沙 410208 3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 科技創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410208 4. 血管生物學(xué)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討雷公藤紅素抗血管重塑的潛在靶點(diǎn)和作用機(jī)制。通過(guò)SwissTargetPrediction、PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出雷公藤紅素作用靶點(diǎn)。采用NCBI Gene、GeneCards及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)血管重塑相關(guān)靶點(diǎn)，聚焦共同靶標(biāo)，借助Cytoscape 3.8.1及STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）并篩選核心靶點(diǎn)。通過(guò)構(gòu)建體外血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）增殖模型和小鼠股動(dòng)脈拉傷模型，考察雷公藤紅素對(duì)VSMCs增殖、促炎細(xì)胞因子水平及關(guān)鍵靶點(diǎn)表達(dá)的影響。共獲得雷公藤紅素靶點(diǎn)56個(gè)，血管重塑靶點(diǎn)737個(gè)，藥物疾病共同靶點(diǎn)20個(gè)，核心靶點(diǎn)有細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、原癌基因c-Myc、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）等。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，雷公藤紅素顯著抑制A7r5血管平滑肌細(xì)胞增殖能力（＜0.01），顯著下調(diào)cyclin D1、c-Myc、NLRP3和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）的蛋白表達(dá)（＜0.05、0.01）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雷公藤紅素顯著抑制股動(dòng)脈拉傷小鼠模型股動(dòng)脈NLRP3和Caspase-1的蛋白表達(dá)水平（＜0.01、0.001），降低血清中白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β水平（＜0.01、0.001）。雷公藤紅素可抑制VSMCs增殖，減輕損傷血管的重塑，其作用機(jī)制可能與改善血管炎癥有關(guān)。

雷公藤紅素；血管重塑；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；增殖；炎癥

心血管疾病位居各種疾病死亡率之首，并且仍然處于上升的趨勢(shì)[1]。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療、支架植入和搭橋手術(shù)等，在心血管疾病治療中得到了廣泛應(yīng)用，但術(shù)后再狹窄仍然是最突出的臨床問(wèn)題[2]。血管重塑是指因損傷而引起血管壁結(jié)構(gòu)和功能的異常變化，是動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、肺動(dòng)脈高壓等疾病的主要病理改變[3]。其中血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）異常增殖導(dǎo)致的內(nèi)膜增生在血管重塑發(fā)病過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。因此，有效抑制VSMCs增殖是防止血管再狹窄發(fā)生的關(guān)鍵途徑。目前，臨床上用于防止血管再狹窄的藥物，主要有抗增殖藥物紫杉醇、西羅莫司等，但由于內(nèi)皮細(xì)胞毒性導(dǎo)致患者血管愈合不佳及預(yù)后不良[4]。

雷公藤紅素是從雷公藤Hook. f.根皮中分離出的五環(huán)三萜類化合物，具有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、消腫止痛的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，雷公藤紅素具有抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬的作用，可用于治療腫瘤、炎性相關(guān)疾病[5]。研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素可顯著抑制VSMCs增殖，在冠心病及再狹窄中具有潛在應(yīng)用價(jià)值[6]。課題組前期研究也證實(shí)雷公藤紅素通過(guò)激活無(wú)翅型MMTV整合位點(diǎn)家族成員5a（wingless-type MMTV integration site family member 5a，Wnt5a）/蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）/ 雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)通路促進(jìn)VSMCs自噬，抑制VSMCs增殖，從而改善內(nèi)膜增生，在抗動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。然而，目前關(guān)于雷公藤紅素在血管重塑中的研究仍處于初級(jí)階段，其潛在靶點(diǎn)及藥理學(xué)作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種基于系統(tǒng)生物學(xué)理論將藥物與疾病相關(guān)靶點(diǎn)聯(lián)系起來(lái)，初步預(yù)測(cè)藥物作用機(jī)制的新型藥物研發(fā)模式[8]?？朔艘酝耙粋€(gè)藥物、一個(gè)靶點(diǎn)、一種疾病”傳統(tǒng)藥物研究范式，通過(guò)多靶點(diǎn)和多途徑的方式闡明藥物治療疾病的潛在機(jī)制。對(duì)于中藥成分作用機(jī)制的研究、開發(fā)及應(yīng)用開辟了新道路[9]。目前，尚無(wú)雷公藤紅素抗血管重塑的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)研究。本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步預(yù)測(cè)藥物作用靶點(diǎn)，進(jìn)而通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，以期為雷公藤紅素抗血管重塑的機(jī)制研究提供新思路。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)ZS-202007280005。動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，溫度25 ℃，相對(duì)濕度（50±20）%，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)LLBH-202007220002）。

1.2 細(xì)胞

大鼠胸大動(dòng)脈平滑肌A7r5細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.3 藥品與試劑

雷公藤紅素（批號(hào)C0869，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號(hào)D2650）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB（platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB，批號(hào)315-18）購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)C11995500BT）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)CW0014）購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；EdU試劑盒（批號(hào)C6017）購(gòu)自美國(guó)US Everbright公司；二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒（批號(hào)PV-9005）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 ELISA試劑盒（批號(hào)分別為ab197742、ab222503）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；原癌基因c-Myc抗體（批號(hào)10828-1-AP）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體（批號(hào)26939-1-AP）、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）抗體（批號(hào)19771-1-AP）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cystein-asparate protease-1，Caspase-1）抗體（批號(hào)22915-1-AP）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（批號(hào)20536-1-AP）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)10494-1-AP）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（批號(hào)SA00001-2）均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.4 儀器

DENLEY DRAGON Wellscan MK型多功能酶標(biāo)儀、BB5060型CO2培養(yǎng)箱、ST8R型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；蛋白電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；5200型熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能有限公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 雷公藤紅素靶點(diǎn)和血管重塑靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 通過(guò)PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)采集雷公藤紅素的三維結(jié)構(gòu)并將其導(dǎo)入SwissTargetPrediction（http://www.swisstarget prediction.ch/）和PharmMapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)雷公藤紅素可能作用的靶點(diǎn)；以“vascular remodeling”為關(guān)鍵詞通過(guò)NCBI Gene（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、OMIM（https://omim.org/）、GeneCards（https://www. genecards.org/）等數(shù)據(jù)庫(kù)獲取血管重塑相關(guān)疾病的靶點(diǎn)。將雷公藤紅素靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)相互映射，得到共有靶點(diǎn)。

2.1.2 “雷公藤紅素-共有靶點(diǎn)-血管重塑”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)獲取 將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（https://STRING-db.org），物種選擇“Homo sapiens”，得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.1軟件進(jìn)行可視化分析，Network analyzer計(jì)算度值，獲得雷公藤紅素治療血管重塑的關(guān)鍵靶點(diǎn)，構(gòu)建“雷公藤紅素-共有靶點(diǎn)-血管重塑”網(wǎng)絡(luò)模型，并對(duì)該網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行深度分析。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 A7r5細(xì)胞用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)置對(duì)照組、模型組（30 ng/mL PDGF-BB）和雷公藤紅素低、中、高劑量組，各給藥組在模型組的基礎(chǔ)上，分別給予1.5、2.0、2.5 μmol/L雷公藤紅素處理，對(duì)照組加入0.1% DMSO溶液。

2.2.2 EdU法檢測(cè)雷公藤紅素對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞增殖的影響 A7r5細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，胰酶消化，以5×103個(gè)/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h使其貼壁。用含1% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基饑餓A7r5細(xì)胞24 h，按“2.2.1”項(xiàng)下方法處理24 h。每孔加入500 μL完全培養(yǎng)基和500 μL EdU工作液（20 nmol/L），在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h。棄去培養(yǎng)基，每孔加入1 mL的4%多聚甲醛，室溫放置15 min；棄去4%多聚甲醛，每孔加入1 mL PBS洗滌細(xì)胞，洗滌3次，每次3～5 min；棄去PBS，每孔加入1 mL通透液（含3% Triton X-100的PBS），室溫放置10～15 min。每孔加入1 mL PBS洗滌細(xì)胞，洗滌2次，每次3～5 min；每孔加入500 μL的Click反應(yīng)混合物，輕輕搖勻，室溫避光放置30 min；棄去Click反應(yīng)混合物，每孔加入1 mL PBS洗滌細(xì)胞3次。每孔加入1 mL稀釋后的Hoechst 33342，避光室溫孵育10 min。棄去Hoechst 33342，加入1 mL PBS洗滌細(xì)胞3次，棄去洗滌液。于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光情況。

2.2.3 Western blotting檢測(cè)細(xì)胞cyclin D1、c-Myc、NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá) 收集處理后的細(xì)胞，PBS洗滌3次，使用RIPA蛋白裂解液抽提總蛋白質(zhì)，采用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白樣品經(jīng)6%～15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉3 h；分別加入一抗，4 ℃孵育膜過(guò)夜；洗滌后，加入二抗，室溫孵育2 h。洗滌后采用化學(xué)發(fā)光試劑顯影，使用Image-Pro Plus軟件分析條帶灰度。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.3.1 動(dòng)物分組及給藥 將50只雄性C57BL/6小鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、DMSO組和雷公藤紅素低、高劑量（1、2 mg/kg）[7]組，每組10只，全部小鼠普通飼料喂養(yǎng)2周后，進(jìn)行小鼠股動(dòng)脈導(dǎo)絲拉傷實(shí)驗(yàn)。DMSO組小鼠在股動(dòng)脈手術(shù)后ip 200 μL溶劑，雷公藤紅素低、高劑量組ig相應(yīng)藥物，隔天給藥，30 d后，通過(guò)吸入CO2的方式處死小鼠，取損傷的股動(dòng)脈和血液進(jìn)行處理和后續(xù)檢測(cè)。

2.3.2 小鼠股動(dòng)脈拉傷實(shí)驗(yàn) 參照課題組前期研究造模[7]，3%異氟烷對(duì)小鼠進(jìn)行吸入性麻醉，將小鼠固定于無(wú)菌泡沫板上，手術(shù)脫毛膏局部去毛，碘伏局部消毒，置于顯微鏡下；高壓滅菌的手術(shù)剪刀沿左腿腹股中線剪開皮膚，分離切口處的局部粘膜和肌肉，找到動(dòng)脈分支并使其與靜脈分離，無(wú)菌手術(shù)線結(jié)扎遠(yuǎn)心端。無(wú)菌手術(shù)線結(jié)扎腹股叉大動(dòng)脈及小分支，暫時(shí)阻止血流。顯微手術(shù)剪在動(dòng)脈分支中打開一個(gè)小口，將導(dǎo)絲反復(fù)進(jìn)出一次后撤離導(dǎo)絲并結(jié)扎股動(dòng)脈。術(shù)后將小鼠置于無(wú)菌熱墊上，蘇醒后置入動(dòng)物房單籠喂養(yǎng)。

2.3.3 免疫組化染色檢測(cè)小鼠股動(dòng)脈中NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá) 取各組小鼠損傷的股動(dòng)脈，固定、脫水、透化、包埋后切片。按照二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，將石蠟切片脫蠟、水化、抗原修復(fù)、阻斷、封閉后，滴加一抗于37 ℃恒溫箱中孵育2 h，用PBS清洗3次，每次3 min。滴加反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫孵育20 min，PBS清洗3次，每次3 min。滴加增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，室溫孵育20 min，PBS清洗3次，每次3 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察、拍照。

2.3.4 ELISA檢測(cè)小鼠血清中炎癥因子IL-1β和IL-6水平 取各組小鼠血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明測(cè)定IL-1β和IL-6的含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.1.1 雷公藤紅素靶點(diǎn)和血管重塑靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 通過(guò)SwissTargetPrediction和PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)得到56個(gè)雷公藤紅素相關(guān)靶點(diǎn)。通過(guò)NCBI Gene、OMIM、GeneCards等數(shù)據(jù)庫(kù)刪除重復(fù)后最終得到血管重塑737個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。

3.1.2 “雷公藤紅素-血管重塑”共有靶點(diǎn) 通過(guò)構(gòu)建Venn圖預(yù)測(cè)“雷公藤紅素-血管重塑”共有靶點(diǎn)。結(jié)果顯示，雷公藤紅素對(duì)應(yīng)的56個(gè)靶基因與血管重塑相關(guān)的737個(gè)靶基因相互映射，得到交集基因20個(gè)（圖1）。

3.1.3 “雷公藤紅素-血管重塑”交集基因的PPI網(wǎng)絡(luò) 將獲得的20個(gè)交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2），利用Cytoscape對(duì)交集基因進(jìn)行可視化分析（圖3），這20個(gè)靶基因可能是雷公藤紅素抗血管重塑的關(guān)鍵基因。此外，20個(gè)靶蛋白相互作用，其中相互作用的連接邊有121條，平均局部聚類系數(shù)0.86，平均節(jié)點(diǎn)度值12.1（圖4）。其中，cyclin D1、c-Myc、NLRP3等蛋白與血管重塑中VSMCs增殖、炎癥等生物過(guò)程關(guān)系密切。

圖1 “雷公藤紅素-血管重塑”交集基因Venn圖

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 “雷公藤紅素-共有靶點(diǎn)-血管重塑”網(wǎng)絡(luò)

3.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

3.2.1 雷公藤紅素對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞增殖的影響 如圖5所示，與模型組比較，各給藥組增殖率明顯降低（＜0.01），表明雷公藤紅素對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用。

3.2.2 雷公藤紅素對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞c-Myc和cyclin D1蛋白表達(dá)的影響 如圖6所示，與模型組比較，雷公藤紅素各劑量組c-Myc蛋白表達(dá)水平明顯降低（＜0.01），雷公藤紅素中、高劑量組cyclin D1蛋白表達(dá)水平明顯降低（＜0.01）。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)分析

與對(duì)照組比較：#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，圖6、7同

圖6 雷公藤紅素對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞c-Myc和cyclin D1蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

3.2.3 雷公藤紅素對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)的影響 為了進(jìn)一步研究雷公藤紅素抑制A7r5細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，測(cè)定網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)關(guān)鍵靶點(diǎn)NLRP3及其下游Caspase-1蛋白表達(dá)。如圖7所示，與模型組比較，各給藥組NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)水平明顯降低（＜0.05、0.01）。提示雷公藤紅素可通過(guò)改善炎癥反應(yīng)抑制A7r5細(xì)胞增殖。

圖7 雷公藤紅素對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

3.3.1 雷公藤紅素對(duì)股動(dòng)脈拉傷模型小鼠股動(dòng)脈NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)的影響 如圖8所示，與DMSO組比較，各給藥組NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá)水平明顯降低（＜0.05、0.01、0.001），與“3.2.3”項(xiàng)下結(jié)果一致。

3.3.2 雷公藤紅素對(duì)股動(dòng)脈拉傷模型小鼠血清中IL-1β和IL-6水平的影響 如圖9所示，與對(duì)照組比較，模型組IL-1β和IL-6水平明顯升高（＜0.05、0.01）；與DMSO組比較，各給藥組IL-1β和IL-6水平明顯降低（＜0.05、0.01、0.001）。

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與DMSO組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，圖9同

圖9 雷公藤紅素對(duì)股動(dòng)脈拉傷模型小鼠血清中IL-1β和IL-6水平的影響(, n = 3)

4 討論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步預(yù)測(cè)雷公藤紅素抗血管重塑的作用靶點(diǎn)。最終篩選出cyclin D1、c-Myc、NLRP3等蛋白為雷公藤紅素調(diào)控血管重塑的重要靶蛋白。隨后采用VSMCs增殖模型和股動(dòng)脈拉傷小鼠模型作為研究對(duì)象，探討雷公藤紅素是否通過(guò)影響細(xì)胞增殖和炎癥進(jìn)而調(diào)控血管重塑病理進(jìn)程。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果均表明雷公藤紅素對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞增殖和股動(dòng)脈拉傷誘導(dǎo)的內(nèi)膜增生具有明顯的抑制作用，并呈劑量相關(guān)性。此外，雷公藤紅素在體外顯著抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs中c-Myc、cyclin D1的蛋白表達(dá)，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。c-Myc通常在血管損傷時(shí)被活化，與VSMCs異常增殖密切相關(guān)[10]。研究報(bào)道，microRNA let-7g可通過(guò)靶向抑制c-Myc，阻滯G0/G1細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制缺氧誘導(dǎo)的VSMCs增殖[11]。Cyclin D1主要參與調(diào)控細(xì)胞G1期的進(jìn)程，對(duì)細(xì)胞周期和增殖的調(diào)控至關(guān)重要。研究表明，白藜蘆醇可通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）/cyclin D1通路，抑制VSMCs的增殖，進(jìn)而改善野百合堿誘導(dǎo)的肺血管重塑及肺動(dòng)脈高壓[12]。這些結(jié)果表明雷公藤紅素可通過(guò)減少c-Myc、cyclin D1的表達(dá)抑制VSMCs增殖和血管重塑。

靜脈旁路移植失敗率很高的最重要原因——炎癥和內(nèi)皮細(xì)胞損傷促進(jìn)VSMCs快速遷移和增殖導(dǎo)致內(nèi)膜增厚[13]。慢性炎癥通常伴隨著血管生成，炎癥可促進(jìn)血管重塑性相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展[14]。NLRP3炎癥體是一種參與炎癥反應(yīng)的大分子復(fù)合物，由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）和Caspase-1組成[15]。NLRP3激活后，與其銜接子ASC形成復(fù)合物，促進(jìn)前體Caspase-1轉(zhuǎn)化為活性Caspase-1?；罨腃aspase-1將前IL-1β加工成其成熟形式IL-1β，從而觸發(fā)炎癥反應(yīng)[16]。已有研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明基因缺失可減輕血管緊張素II誘導(dǎo)的炎癥、VSMCs表型轉(zhuǎn)化、增殖進(jìn)而緩解血管重塑進(jìn)程[17]。反之，激活NLRP3炎性小體可促進(jìn)高血壓患者VSMCs表型轉(zhuǎn)化和增殖[18]。在高血壓的發(fā)病機(jī)制中，Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）通過(guò)觸發(fā)NLRP3炎癥體介導(dǎo)VSMCs增殖[19]。Fan等[20]研究表明microRNA-24的過(guò)表達(dá)可通過(guò)抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信號(hào)通路減輕糖尿病血管重塑。本研究結(jié)果表明，雷公藤紅素顯著抑制了PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs模型和小鼠股動(dòng)脈拉傷模型中NLRP3、Caspase-1表達(dá)。此外，ELISA結(jié)果表明，雷公藤紅素顯著減少了股動(dòng)脈拉傷模型小鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6水平。這些結(jié)果表明雷公藤紅素可能通過(guò)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)VSMCs增殖，從而在防止損傷引起的血管重塑中具有明顯作用?？傊?，NLRP3可作為干預(yù)VSMCs炎癥和增殖的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。探討VSMCs增殖和炎癥的關(guān)系也有利于為慢性疾病的抗炎和抗血管重塑治療提供新的思路和機(jī)遇。

綜上，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，探討了雷公藤紅素對(duì)血管重塑的作用及機(jī)制。雷公藤紅素可減輕VSMCs增殖，這一效應(yīng)可能與其抗炎作用相關(guān)。本研究拓展了雷公藤紅素抗血管重塑的機(jī)制，為血管重塑相關(guān)性疾病的治療和新藥研發(fā)提供了一種思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of celastrol against vascular remodeling based on network pharmacology and experimental validation

GU Jia1, SHI Ya-ning1, 3, QIU Yun1, HE Peng1, HE Wei-he1, 2, QIN Li1, 2, 4

1. Laboratory of Stem Cell Regulation with Chinese Medicine and Its Application, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. The department of Pharmacology, School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 3. Science and Technology Innovation Center, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 4. Hunan Key Laboratory of Vascular Biology and Translational Medicine, Changsha 410208, China

To explore the potential targets and mechanism of celastrol against vascular remodeling through network pharmacology and experimental verification.The targets of celastrol were mined by SwissTargetPrediction, Pharmmapper databases, and then the targets related to vascular remodeling were predicted by NCBI Gene, Genecards and OMIM databases. Protein-protein interaction (PPI) network was constructed to take the common targets of them, visualize and search core targets by Cytoscape 3.8.1 software and STRING database. The effects of celastrol on vascular smooth muscle cells (VSMCs) proliferation, levels of pro-inflammatory cytokines and expressions of core targets were investigated by constructing VSMCs proliferation modelsand a mouse model with femoral artery strain.A total of 56 targets of celastrol and 737 targets related to vascular remodeling were obtained, and 20 cross targets between celastrol and vascular remodeling were obtained. Key targets such as cyclin D1, proto-oncogene c-Myc, nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3 (NLRP3) were obtained.cell experiments showed that celastrol significantly inhibited the proliferation of A7r5 cells (< 0.01), significantly down-regulated the protein expressions of cyclin D1, c-Myc, NLRP3 and cystein-asparate protease-1 (Caspase-1) (< 0.05, 0.01). Animal experiment results showed that celastrol significantly inhibited the protein expressions of NLRP3 and Caspase-1 in femoral artery of mice with femoral artery strain (< 0.01, 0.001), decreased the levels of interleukin-6 (IL-6) and IL-1β in serum (< 0.01, 0.001).Celastrol can inhibit the proliferation of VSMCs and reduce the remodeling of injured vessels, and its mechanism may be related to the amelioration of vascular inflammation.

celastrol; vascular remodeling; network pharmacology; proliferation; inflammation

R285.5

A

0253 - 2670(2023)15 - 4874 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.013

2023-03-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目面上項(xiàng)目（82274159）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目面上項(xiàng)目（81973668）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目面上項(xiàng)目（81774130）；湖南省自然科學(xué)基金科藥聯(lián)合基金資助項(xiàng)目（2022JJ80088）；湖南省教育廳項(xiàng)目（20A375，22B0355）；湖南省衛(wèi)生健康委員會(huì)重點(diǎn)指導(dǎo)課題（202213055529）；長(zhǎng)沙市科技局科研項(xiàng)目（No.kq2004060）；中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地開放基金項(xiàng)目（21PTKF1004）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新課題立項(xiàng)項(xiàng)目（2022CX76）

谷 佳，碩士研究生，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治動(dòng)脈粥樣硬化。Tel: 18867355372 E-mail: 5837677211@qq.com

通信作者：覃 麗，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樾难芗膊〉陌l(fā)病機(jī)制及其中醫(yī)藥防治。Tel: 15173172436 E-mail: lqin@hnucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]