唐 浪，宋添力，吳廣陽(yáng)，王一民，石廷玉，劉 緒，黃 勝

? 藥理與臨床?

土家藥竹節(jié)參多糖通過(guò)Nrf2-ARE信號(hào)通路對(duì)四氯化碳致大鼠急性肝損傷的抗氧化保護(hù)作用

唐 浪，宋添力#，吳廣陽(yáng)，王一民，石廷玉，劉 緒，黃 勝*

湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北 恩施 445000

基于核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）-抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）信號(hào)通路研究竹節(jié)參多糖（polysaccharide）保護(hù)四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）所致大鼠急性肝損傷的作用機(jī)制。通過(guò)CCl4間隔誘導(dǎo)法建立急性肝損傷大鼠模型，給予水提醇沉法制備的竹節(jié)參多糖治療7 d后取材，通過(guò)蘇木素-伊紅（HE）染色觀察肝組織病理變化；全自動(dòng)生化儀檢測(cè)大鼠血清中肝功能相關(guān)指標(biāo)；ELISA法檢測(cè)肝組織氧化應(yīng)激水平；免疫組化法觀察大鼠肝組織Nrf2表達(dá)；Western blotting測(cè)定大鼠肝組織Nrf2-ARE通路相關(guān)蛋白表達(dá)。與模型組比較，竹節(jié)參多糖組大鼠血清中肝功能相關(guān)指標(biāo)呈不同程度的降低（＜0.05、0.01），肝組織中Nrf2-ARE信號(hào)通路明顯激活（＜0.01），肝臟中脂類過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平降低（＜0.01），抗氧化酶活性明顯升高（＜0.05、0.01），細(xì)胞質(zhì)中氧化應(yīng)激效應(yīng)物Nrf2陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)有所減少（＜0.01），大鼠肝臟損傷程度明顯減輕。竹節(jié)參多糖可激活Nrf2-ARE信號(hào)通路，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化酶系表達(dá)，減輕CCl4引起的氧化損傷。

竹節(jié)參多糖；急性肝損傷；Nrf2-ARE信號(hào)通路；氧化應(yīng)激；氧化損傷

急性肝損傷（acute liver injury，ALI）是指各種因素引起的突發(fā)性肝細(xì)胞大面積壞死或嚴(yán)重肝功能損害，出現(xiàn)以黃疸、腹水、凝血功能障礙或肝性腦病等為主要特征的一種臨床綜合征，部分患者可能進(jìn)一步發(fā)展為急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）[1]。ALI發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞纖維化和細(xì)胞凋亡等的進(jìn)程有關(guān)，在酒精、中毒、病毒性肝炎、免疫、血管障礙或藥物的影響下，肝臟氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡被打破，物質(zhì)傾向于被氧化，進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量的活性氧、活性氮等自由基[2-3]。大量自由基的產(chǎn)生引起蛋白質(zhì)、核酸和脂類等生物大分子被不同程度的氧化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、DNA斷裂、脂類過(guò)氧化等改變，引起脂類過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）的升高，進(jìn)而致使細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)結(jié)構(gòu)破壞及功能異常[4]。

核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）-抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）信號(hào)通路的激活是機(jī)體內(nèi)一種重要的細(xì)胞適應(yīng)性應(yīng)答抵制氧化應(yīng)激和其他類型應(yīng)激的抗氧化防御機(jī)制，參與細(xì)胞增殖、3大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、細(xì)胞衰老和凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程，是預(yù)防和治療機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥的一條重要途徑[5-8]。土家族藥用植物竹節(jié)參為五加科人參屬植物竹節(jié)參C. A. Mey.的干燥根莖，其性溫，味甘、微苦，有活血化瘀、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、祛風(fēng)除濕的功效[9-10]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，竹節(jié)參有保護(hù)肝損傷的作用，其多糖成分有減輕自由基損傷、提高過(guò)氧化物酶系統(tǒng)活力、減少炎癥相關(guān)因子表達(dá)等藥理學(xué)活性[11-13]。本研究通過(guò)建立四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）間隔誘導(dǎo)的急性肝損傷模型，探究竹節(jié)參多糖對(duì)肝損傷的保護(hù)作用，并基于Nrf2-ARE信號(hào)通路探討竹節(jié)參多糖改善肝損傷的作用機(jī)制，為竹節(jié)參多糖作為護(hù)肝藥物的藥理學(xué)機(jī)制研究和臨床防治ALI提供理論參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量（200±20）g，8周齡，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)No.210726210100500171，許可證號(hào)SCXK（遼）2020-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對(duì)濕度（55±5）%、明暗循環(huán)12 h的環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)號(hào)（2021）56。

1.2 藥材

竹節(jié)參購(gòu)自湖北省宣恩縣椿木營(yíng)竹節(jié)參培育種植基地，經(jīng)湖北民族大學(xué)文德鑒副教授鑒定為五加科植物竹節(jié)參C. A. Mey.的干燥根莖。

1.3 藥品與試劑

聯(lián)苯雙酯滴丸（批號(hào)H11020980）購(gòu)自北京協(xié)和藥廠；CCl4購(gòu)自天津市天力化學(xué)試劑有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒（批號(hào)S03030）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號(hào)S03040）購(gòu)自深圳生命科學(xué)股份有限公司；總膽紅素（total bilirubin，TBil）試劑盒（批號(hào)C120）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBil）試劑盒（批號(hào)C119）購(gòu)自生物技術(shù)有限公司；MDA試劑盒（批號(hào)A003-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號(hào)A001-1）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（批號(hào)A005）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒（批號(hào)A007-1）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；超敏ECL發(fā)光液（批號(hào)KR0016）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)152203）購(gòu)自科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號(hào)C0105S）、BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)P0010）、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（批號(hào)A0216）購(gòu)自；免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemical staining，IHC）試劑盒（批號(hào)16I14B07G2622）、二氨聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒（批號(hào)16C08A17）購(gòu)自武漢生物工程有限公司；Cul3多抗（批號(hào)11107-1-AP）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單抗（批號(hào)60004-1-Ig）購(gòu)自Proteintech公司；Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）多抗（批號(hào)WL03285）、Nrf2多抗（批號(hào)WL02135）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸醌氧化還原酶1（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate quinone oxidoreductase 1，NQO1）多抗（批號(hào)WL04860）均購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司。

1.4 儀器

Chemray 380型全自動(dòng)生化檢測(cè)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；1510型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、A44116型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Thermo公司）；RM2245型組織切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；CX41RF型正置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；B212AT04E型電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；JA2003N型高精度天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；5811型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

2 方法

2.1 竹節(jié)參多糖的制備及含量測(cè)定

竹節(jié)參多糖的制備參考文獻(xiàn)方法[12-14]并加以改進(jìn)：取一定質(zhì)量的干燥竹節(jié)參藥材碎末，以20倍體積的95%乙醇80 ℃回流3 h，脫脂；以20倍體積的80%乙醇60 ℃回流2 h，脫單糖和低聚糖；濾過(guò)，收集藥渣后，10倍體積的純化水磁力攪拌80 ℃回流提取3次，每次2 h；合并3次濾液過(guò)D101大孔樹(shù)脂柱，脫皂苷、色素；收集濾液減壓濃縮至一定體積，用Svage法除蛋白（4 ℃、10 000 r/min離心4 min）直至無(wú)蛋白層出現(xiàn)，合并上清液，加無(wú)水乙醇（慢加快攪）直至乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)90%，4 ℃過(guò)夜，濾過(guò)，收集沉淀干燥，即得精制竹節(jié)參多糖。應(yīng)用苯酚-硫酸法[15]測(cè)定竹節(jié)參多糖含量。

2.2 動(dòng)物分組、造模與給藥

SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、聯(lián)苯雙酯（100 mg/kg）[16]組和竹節(jié)參多糖低、中、高劑量（50、100、200 mg/kg）組，每組6只。依據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版中竹節(jié)參成人生藥劑量（6～9 g）與“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的體表面積換算關(guān)系”進(jìn)行劑量確定，計(jì)算得到的劑量作為中劑量組，并按照0.5∶1∶2比例設(shè)置低、中、高劑量組[9,17]。采取間隔誘導(dǎo)法建立ALI大鼠模型[18]，除正常組ip生理鹽水外，其余各組大鼠在第1、4、7天ip 12% CCl4生理鹽水溶液（5 mL/kg）。此期間除正常組和模型組ig生活飲用水外，其余各組大鼠ig相應(yīng)藥物（5 mL/kg），2次/d。第7天給藥后，晚上禁食不禁水，次日麻醉收集大鼠血清與肝臟組織。大鼠血液在4 ℃、4000 r/min離心15 min，分離血清于?80 ℃保存。

2.3 肝臟指數(shù)計(jì)算

大鼠肝臟稱定質(zhì)量后，切取約1 cm×1 cm大小于4%多聚甲醛中固定，剩余肝組織分裝若干于?80 ℃下凍存后用于肝臟相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

肝臟指數(shù)＝肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量

2.4 血清肝功能相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

使用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)各組大鼠血清中AST、ALT活性及TBil、DBil水平。

2.5 肝組織病理學(xué)觀察

大鼠肝組織經(jīng)多聚甲醛固定24 h后，脫水、包埋，制作石蠟切片（5 μm），HE染色，使用光學(xué)顯微鏡對(duì)比觀察各組大鼠肝組織病理學(xué)變化。

2.6 肝組織中MDA水平及SOD、GSH-Px、CAT活性測(cè)定

大鼠肝組織與生理鹽水以1∶9的比例制成勻漿，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定MDA水平及SOD、GSH-Px、CAT活性。

2.7 免疫組化法檢測(cè)肝組織Nrf2表達(dá)

大鼠肝組織石蠟切片（5 μm），經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇復(fù)水，5% H2O2進(jìn)行內(nèi)源性過(guò)氧化物酶淬滅處理，于0.01 mol/L枸櫞酸鹽中進(jìn)行高壓抗原修復(fù)，5%牛血清白蛋白封閉；滴加一抗（1∶200），4 ℃孵育過(guò)夜；滴加二抗（1∶100），37 ℃孵育30 min；滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（streptavidin-biotin complex，SABC），37 ℃孵育30 min；DAB染色5 min，蘇木素復(fù)染10 min，飽和碳酸鋰返藍(lán)50 s；經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片后于顯微鏡下觀察并拍照，用Image J軟件分析Nrf2相對(duì)陽(yáng)性表達(dá)面積。

2.8 Western blotting檢測(cè)肝組織Nrf2-ARE通路蛋白表達(dá)

提取大鼠肝臟中總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中封閉1 h，加入一抗（1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜；次日室溫孵育0.5 h回收一抗，加入二抗（1∶2000），室溫孵育1 h，使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物顯影。用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 竹節(jié)參多糖的提取與含量測(cè)定

取200 g竹節(jié)參，按照“2.1”項(xiàng)下提取流程后獲得14.62 g精制竹節(jié)參多糖，提取率為7.31%；配制75.8 μg/mL精制竹節(jié)參多糖，用苯酚-硫酸法測(cè)得中性多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為91.84%。

3.2 竹節(jié)參多糖對(duì)CCl4致肝損傷大鼠肝臟指數(shù)及血清中肝功能指標(biāo)的影響

如圖1所示，與正常組比較，模型組大鼠肝臟指數(shù)顯著升高（＜0.01），血清中ALT、AST活性及TBil水平顯著升高（＜0.01），提示在肝細(xì)胞壞死的情況下，肝臟對(duì)間接膽紅素（indirect bilirubin，IBil）代謝失常，IBil反流入血而致使TBil水平增高；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組和竹節(jié)參多糖中、高劑量組肝臟指數(shù)顯著降低（＜0.05、0.01），血清中ALT和AST活性均顯著降低（＜0.05、0.01），竹節(jié)參多糖高劑量組TBil水平顯著降低（＜0.05）。與聯(lián)苯雙酯組比較，竹節(jié)參多糖高劑量組上述各指標(biāo)并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。各組DBil水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果說(shuō)明竹節(jié)參多糖對(duì)CCl4誘導(dǎo)的ALI大鼠肝功能有明顯改善作用。

3.3 竹節(jié)參多糖對(duì)CCl4致肝損傷大鼠肝組織病理變化的影響

如圖2所示，正常組大鼠肝組織細(xì)胞形態(tài)正結(jié)構(gòu)正常，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以匯管區(qū)為中心周圍肝細(xì)胞索呈放射狀排列。模型組大鼠肝臟細(xì)胞可見(jiàn)融合性壞死，空泡樣病變，匯管區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞索消失。與模型組相比，各給藥組肝臟組織壞死及空泡樣病變有不同程度的減輕，肝索形態(tài)結(jié)構(gòu)相對(duì)改善。說(shuō)明竹節(jié)參多糖對(duì)CCl4導(dǎo)致的肝組織細(xì)胞形態(tài)損傷具有保護(hù)作用。

3.4 竹節(jié)參多糖對(duì)CCl4致肝損傷大鼠肝組織氧化應(yīng)激水平的影響

如圖3所示，與正常組比較，模型組大鼠肝組織MDA水平顯著升高（＜0.01），SOD、CAT和GSH-Px活性顯著降低（＜0.01），說(shuō)明模型組氧化損傷嚴(yán)重，抗氧化酶系活性下降；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組和竹節(jié)參多糖中、高劑量組肝組織MDA水平顯著降低（＜0.01），SOD和GSH-Px活性顯著升高（＜0.05、0.01），竹節(jié)參多糖高劑量組CAT活性顯著升高（＜0.05）。與聯(lián)苯雙酯組比較，竹節(jié)參多糖高劑量組SOD、GSH-Px和CAT活力雖呈一定的提高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明竹節(jié)參多糖增強(qiáng)了大鼠肝臟抗氧化酶的表達(dá)，對(duì)CCl4導(dǎo)致的肝損傷具有抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。

與正常組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

融合性壞死（→），空泡樣病變（↓），匯管區(qū)（←）

圖3 竹節(jié)參多糖對(duì)CCl4致肝損傷大鼠肝組織MDA水平及SOD、CAT、GSH-Px活性的影響(, n = 6)

3.5 竹節(jié)參多糖對(duì)CCl4致肝損傷大鼠肝組織Nrf2表達(dá)的影響

為進(jìn)一步探索竹節(jié)參多糖導(dǎo)致的抗氧化酶系活性的上調(diào)作用是否是通過(guò)上游調(diào)節(jié)因子Nrf2的激活引起的，通過(guò)免疫組化法觀察各組大鼠肝組織中Nrf2的表達(dá)情況。如圖4所示，正常組大鼠肝組織細(xì)胞內(nèi)基本未見(jiàn)Nrf2陽(yáng)性；與正常組比較，模型組細(xì)胞中Nrf2陽(yáng)性明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，經(jīng)給藥治療干預(yù)后，肝組織內(nèi)Nrf2的表達(dá)顯著降低（＜0.01），其中竹節(jié)參多糖高劑量組和聯(lián)苯雙酯組最佳。提示竹節(jié)參多糖可能通過(guò)對(duì)肝臟組織Nrf2的表達(dá)產(chǎn)生影響，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞抗氧化酶系的表達(dá)以抑制氧化應(yīng)激，改善氧化應(yīng)激水平。

3.6 竹節(jié)參多糖對(duì)CCl4致肝損傷大鼠肝組織Nrf2-ARE通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，與正常組比較，模型組大鼠肝臟Nrf2表達(dá)顯著減少（＜0.01）；與模型組比較，竹節(jié)參多糖中、高劑量組Nrf2表達(dá)顯著增加（＜0.01），該結(jié)果與免疫組化的結(jié)果不一致，進(jìn)而對(duì)Nrf2的結(jié)合蛋白Keap1、支架蛋白Cul3及其下游的效應(yīng)蛋白NQO1的表達(dá)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。與正常組比較，模型組大鼠肝臟Cul3表達(dá)無(wú)顯著性差異，Keap1、NQO1表達(dá)顯著減少（＜0.01）；與模型組比較，竹節(jié)參多糖中、高劑量組Keap1、NQO1表達(dá)顯著升高（＜0.05、0.01），提示竹節(jié)參多糖在治療過(guò)程中可能增強(qiáng)了機(jī)體Keap1、Nrf2的合成，在面對(duì)自由基團(tuán)攻擊時(shí)啟動(dòng)NQO1等抗氧化酶系的表達(dá)，進(jìn)而降低了肝臟氧化應(yīng)激水平。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組Keap1、Nrf2、NQO1的表達(dá)均無(wú)明顯差異，提示聯(lián)苯雙酯改善抗氧化酶活力的作用機(jī)制可能受其他因素的調(diào)節(jié)。

3.7 各組大鼠肝組織Keap1/Nrf2值比較

鑒于Keap1與Nrf2之間特殊的結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)性，擬將兩者與各自內(nèi)參的相對(duì)比值進(jìn)行比較，即分別用Keap1/GAPDH相對(duì)量與Nrf2/GAPDH相對(duì)量的比值進(jìn)行兩兩處理，然后取平均值得Keap1/Nrf2的相對(duì)值，觀察各組兩者比值的相對(duì)變化，分析不同處理組對(duì)Keap1與Nrf2的整體影響（圖6）。結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組Keap1/Nrf2值減小（＜0.05），提示可能通過(guò)減少Keap1的量，進(jìn)而相對(duì)增加Nrf2的激活來(lái)應(yīng)對(duì)CCl4所致的氧化應(yīng)激，而從圖5來(lái)看，可能在持續(xù)的氧化誘導(dǎo)下，即便機(jī)體減少了Keap1的量，但Nrf2的量也存在不可避免的被降解而減少，同時(shí)提示機(jī)體新Nrf2合成不足，出現(xiàn)了Keap1與Nrf2表達(dá)同時(shí)減少的情況。與模型組一致，聯(lián)苯雙酯組Keap1/Nrf2值減小，進(jìn)一步揭示，聯(lián)苯雙酯可能并無(wú)通過(guò)Nrf2蛋白發(fā)揮改善肝損傷的作用，其增加抗氧化的機(jī)制可能與其他因素有關(guān)。竹節(jié)參多糖各劑量組相對(duì)于正常組而言，其Keap1/Nrf2值無(wú)明顯差異，提示在機(jī)體減少Keap1的量以及Nrf2也因CCl4持續(xù)誘導(dǎo)肝損傷而減少的情況下，竹節(jié)參多糖治療后可能存在使新Nrf2合成增加的作用，同時(shí)增加了Keap1合成以錨定Nrf2，進(jìn)而增加了肝組織細(xì)胞的抗氧化能力，緩解肝損傷。竹節(jié)參多糖促進(jìn)Nrf2表達(dá)增加的更深層次分子作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

圖4 竹節(jié)參多糖對(duì)CCl4致肝損傷大鼠肝組織Nrf2表達(dá)的影響(, n = 3)

圖5 竹節(jié)參多糖對(duì)CCl4致肝損傷大鼠肝組織Nrf2、Keap1、Cul3和NQO1蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

圖6 各組大鼠肝組織Keap1/Nrf2值比較(, n = 3)

4 討論

本研究通過(guò)間隔式誘導(dǎo)肝損傷的方法模擬現(xiàn)實(shí)生活中ALI發(fā)病的突然性及長(zhǎng)期處于有毒環(huán)境持續(xù)誘導(dǎo)造成ALI的持續(xù)性，并采取治療性給藥方式，探究竹節(jié)參多糖通過(guò)Nrf2-ARE信號(hào)通路對(duì)CCl4誘導(dǎo)ALI大鼠的保護(hù)作用機(jī)制。結(jié)果表明，竹節(jié)參多糖可改善肝損傷大鼠的肝功能，通過(guò)激活Nrf2-ARE信號(hào)通路增強(qiáng)抗氧化酶系的活力而發(fā)揮抗氧化作用（圖7）。

血清轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST是評(píng)價(jià)肝功能損傷的有效指標(biāo)，當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，ALT和AST大量釋放到血液中，血清ALT和AST活性升高。本實(shí)驗(yàn)中模型組血清ALT、AST活性均顯著升高。竹節(jié)參多糖治療后血清ALT、AST活性顯著降低，說(shuō)明竹節(jié)參多糖可在一定程度上緩解CCl4誘導(dǎo)的ALI，與組織病理學(xué)結(jié)果一致。同時(shí)，竹節(jié)參多糖中、高劑量組的降酶效果與聯(lián)苯雙酯組相比無(wú)明顯差異。作為脂質(zhì)過(guò)氧化的最終代謝產(chǎn)物，MDA水平反映了由CCl4引起的氧化應(yīng)激的程度[19]。SOD、GSH-Px、GSH和CAT等是體內(nèi)重要的抗氧化酶，能有效清除自由基，抑制自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化[20-21]。本研究結(jié)果表明，竹節(jié)參多糖可以通過(guò)增加肝組織細(xì)胞SOD、GSH-Px和CAT活力并降低MDA含量改善CCl4誘導(dǎo)的肝損傷，表明竹節(jié)參多糖的護(hù)肝作用可能與抗氧化應(yīng)激有關(guān)。此外，與聯(lián)苯雙酯組比較，竹節(jié)參多糖高劑量組抗氧化酶活力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。為了進(jìn)一步探究上述竹節(jié)參多糖增加了肝組織抗氧化酶活力結(jié)果的原因，了解竹節(jié)參多糖改善CCl4誘導(dǎo)的ALI可能的作用機(jī)制，以Nrf2、NQO1、Keap1和Cul3作為研究對(duì)象，檢測(cè)了各組大鼠肝組織中Nrf2、NQO1、Keap1和Cul3的表達(dá)。

圖7 竹節(jié)參多糖治療CCl4致肝損傷大鼠的作用機(jī)制

Nrf2是抗氧化防御系統(tǒng)重要調(diào)節(jié)因子[22-23]。SOD、GSH-Px、GSH、CAT和NQO1、HO-1等抗氧化酶的基因受Nrf2調(diào)控。正常情況下，Nrf2被Keap1錨定在細(xì)胞質(zhì)中，少部分進(jìn)入細(xì)胞核與ARE結(jié)合，調(diào)控機(jī)體抗氧化酶的正常表達(dá)，維持氧化與抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡。出核后Keap1能夠使Nrf2發(fā)生泛素化被蛋白酶體降解，在這個(gè)過(guò)程中機(jī)體反饋調(diào)節(jié)合成新的Nrf2以維持基礎(chǔ)水平。當(dāng)存在較為劇烈或持續(xù)的氧化刺激或損傷時(shí)，細(xì)胞通過(guò)增加Nrf2的合成、降低出核Nrf2的泛素化及減緩Nrf2的降解，使已出核的Nrf2重新入核以應(yīng)對(duì)氧化損傷，即便如此Nrf2入核次數(shù)也是有限的，依然會(huì)被降解，這種應(yīng)對(duì)氧化損傷的策略也是有一定限度的[24-28]。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，與正常組比較，模型組Keap1、Nrf2減少可能是由于在間斷誘導(dǎo)氧化損傷情況下，肝細(xì)胞需要不斷地合成足夠的Nrf2去應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激，而持續(xù)的損傷使Nrf2合成不足，機(jī)體可能通過(guò)減少Keap1的含量使Nrf2泛素化降低維持Nrf2的相對(duì)水平，從而出現(xiàn)了Keap1、Nrf2蛋白總量都減少的情況，致使胞質(zhì)中Nrf2以持續(xù)解離狀態(tài)對(duì)抗氧化損傷，在IHC結(jié)果中表現(xiàn)出Nrf2的高陽(yáng)性，而氧化損傷未得到治療性改善。竹節(jié)參多糖中、高劑量組Keap1、Nrf2表達(dá)量高于模型組，Keap1/Nrf2值也高于模型組，提示竹節(jié)參多糖組可能在治療過(guò)程中通過(guò)增加Keap1、Nrf2的合成，使之基礎(chǔ)水平得到提升，在面對(duì)自由基團(tuán)攻擊時(shí)更有能力提高下游NQO1及SOD、GSH-Px和CAT等抗氧化酶系的活力，減輕CCl4間斷性誘導(dǎo)的肝臟損傷，使機(jī)體氧化應(yīng)激水平降低或逐漸趨于正常，進(jìn)而反饋調(diào)節(jié)Nrf2的泛素化和降解，而同時(shí)新合成的Nrf2則被Keap1錨定維持動(dòng)態(tài)平衡，從而使Nrf2游離態(tài)減少，在免疫組化結(jié)果中表現(xiàn)出比之模型組低的陽(yáng)性水平。聯(lián)苯雙酯組與模型組相比，Keap1、Nrf2和NQO1的表達(dá)均無(wú)明顯差異，提示聯(lián)苯雙酯改善抗氧化酶活力的作用機(jī)制可能并非通過(guò)Nfr2-ARE信號(hào)通路發(fā)揮作用，可能與其他抗氧化調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)。對(duì)于Cul3表達(dá)的影響，各組之間無(wú)顯著性差異，可能與其作為支架蛋白參與構(gòu)成泛素連接酶復(fù)合物的有關(guān)，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是生物體內(nèi)高度保守且不可或缺的生物過(guò)程，調(diào)控體內(nèi)多種生物學(xué)過(guò)程[26]。

本研究中竹節(jié)參多糖對(duì)Nrf2更深的影響機(jī)制尚未完全闡明，仍有待進(jìn)一步的探究。竹節(jié)參具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、活血化瘀、祛風(fēng)除濕的功效，竹節(jié)參多糖可能通過(guò)增加Nrf2調(diào)控ARE提升了機(jī)體抗氧化能力，增強(qiáng)了正氣對(duì)肝損傷致病邪氣的抵抗能力，從而達(dá)到扶正祛邪的治療效果。本研究在一定程度體現(xiàn)了竹節(jié)參的滋補(bǔ)強(qiáng)壯功效與抗氧化藥理作用的適應(yīng)性。同時(shí)，聯(lián)苯雙酯作為短期降酶藥有著其局限性和不足，竹節(jié)參多糖對(duì)轉(zhuǎn)氨酶降低作用的長(zhǎng)期性影響或可做進(jìn)一步的研究，竹節(jié)參多糖可能具有成為長(zhǎng)期降酶藥的潛能，將對(duì)天然降酶藥物和抗氧化護(hù)肝藥物的研究與開(kāi)發(fā)具有積極意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Anti-oxidative protection ofpolysaccharide on CCl4-induced acute liver injury in rats based on Nrf2-ARE signaling pathway

TANG Lang, SONG Tian-li, WU Guang-yang, WANG Yi-min, SHI Ting-yu, LIU Xu, HUANG Sheng

Department of Medicine, Hubei Minzu University, Enshi 445000, China

To study the protective mechanism ofpolysaccharide (PSPJ) against carbon tetrachloride (CCl4) induced acute liver injury in rats through nuclear factor E2 related factor 2 (Nrf2)-antioxidant response element (ARE) signal pathway.A rat model of acute liver injury was established using the CCl4interval induction method. After 7 d of treatment with PSPJ prepared by water extraction and alcohol precipitation method, samples were taken and liver tissue pathological changes were observed by hematoxylin eosin (HE) staining; Liver function related indicators in serum of rat were detected by fully automated biochemical analyzer; ELISA method was used to detect oxidative stress level in liver tissue; Immunohistochemical method was used to observe the expression of Nrf2 in liver tissue of rats; Western blotting was used to determine the expressions of Nrf2-ARE pathway related proteins in liver tissue of rats.Compared with model group, liver function related indicators in serum of rats treated with PSPJ showed varying degrees of decrease (< 0.05, 0.01), Nrf2-ARE signaling pathway was significantly activated in liver tissue (< 0.01), level of lipid peroxidation product malondialdehyde (MDA) in liver was reduced (< 0.01), and activity of antioxidant enzymes was significantly increased (< 0.05, 0.01), the number of cells with Nrf2 positive oxidative stress effector in cytoplasm was decreased (< 0.01), and the degree of liver damage in rats was significantly reduced.PSPJ can activate the Nrf2-ARE signaling pathway, enhance the expression of antioxidant enzymes in body, and alleviate oxidative damage caused by CCl4.

polysaccharide; acute liver injury; Nrf2-ARE signal pathway; oxidative stress; oxidative damage

R285.5

A

0253 - 2670(2023)15 - 4866 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.012

2023-02-24

湖北省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（2019CFB358）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（81801979）

唐 浪（1995—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槌Ｓ猛良易逅幍闹苿╅_(kāi)發(fā)與應(yīng)用。E-mail: 1411992456@qq.com

通信作者：黃 勝（1987—），男，博士，碩士生導(dǎo)師，湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院副院長(zhǎng)，從事天然藥物的藥理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及分子機(jī)制研究。E-mail: hs19870604@163.com

宋添力（1998—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊恢参飳?duì)肝病的防治。E-mail: stl15234839197@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]