韋卓純，林 繪，彭 穎，張卉青，李 健

UPLC指紋圖譜多模式識別結(jié)合多指標(biāo)成分測定的清熱消炎寧膠囊質(zhì)量控制研究

韋卓純，林 繪，彭 穎，張卉青，李 健

東莞市濱海灣中心醫(yī)院，廣東 東莞 523905

建立清熱消炎寧膠囊（Qingre Xiaoyanning Capsules，QXC）UPLC指紋圖譜及多指標(biāo)成分定量分析方法，結(jié)合化學(xué)模式識別技術(shù)對多批次制劑進(jìn)行質(zhì)量評價。通過優(yōu)化樣品前處理及色譜檢測方法，建立合適UPLC指紋圖譜和含量測定條件。色譜柱為UPLC HSS T3柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相梯度洗脫；檢測波長280 nm；柱溫40 ℃；體積流量0.5 mL/min。采用層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）和聚類熱圖分析對20批清熱消炎寧膠囊進(jìn)行質(zhì)量評價。清熱消炎寧膠囊UPLC指紋圖譜及含量測定方法學(xué)考察結(jié)果均符合測定要求，獲得21個共有峰，運用對照品比對方式指認(rèn)了7個色譜峰；20批樣品的相似度均大于0.954，樣品間一致性及穩(wěn)定性良好；由HCA可知，20批樣品可大致聚成2類；PCA從21個共有峰中提取了4個主成分，通過OPLS-DA篩選了迷迭香酸、綠原酸、隱綠原酸、丹參素鈉、新綠原酸等8個影響樣品質(zhì)量差異性較大的化合物；7個定量成分線性關(guān)系均良好（≥0.999 8），平均加樣回收率98.41%～101.18%，RSD均不大于1.81%；聚類熱圖分析結(jié)果表明，20批樣品可聚為2類。建立的同一色譜條件下的清熱消炎寧膠囊UPLC指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)成分定量方法專屬性強(qiáng)、簡便、準(zhǔn)確，可為其整體質(zhì)量控制和品質(zhì)評價提供參考依據(jù)。

清熱消炎寧膠囊；UPLC指紋圖譜；聚類分析；主成分分析；正交偏最小二乘-判別分析；定量分析；聚類熱圖分析；質(zhì)量控制；迷迭香酸；綠原酸；隱綠原酸；丹參素鈉；新綠原酸

清熱消炎寧膠囊（Qingre Xiaoyanning Capsules，QXC）為腫節(jié)風(fēng)經(jīng)水提取加工而成的清熱解毒類中成藥制劑[1]，臨床療效確切，安全性良好，主要含有咖啡酰類衍生物、香豆素、有機(jī)酸、黃酮、倍半萜、多糖等多種化學(xué)成分[2-3]。目前，QXC沒有統(tǒng)一的國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，部頒標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制僅有【鑒別】和【檢查】兩項[1]，其他質(zhì)量控制近幾年未見大的突破，主要針對指標(biāo)成分異嗪皮啶及活性成分迷迭香酸進(jìn)行含量測定[4-5]，檢測方法均采用常規(guī)的HPLC法，暫時未見QXC的指紋圖譜研究報道，故QXC現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較為低下，測定一種或兩種指標(biāo)成分不能有效保證其質(zhì)量，有必要探索整體質(zhì)量控制模式研究。中藥指紋圖譜具有整體性強(qiáng)、專屬性高、分析手段豐富等特點，能表征被測樣品主要化學(xué)成分的整體特征，確保其內(nèi)在質(zhì)量的均一和穩(wěn)定等[6-7]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中藥及中成藥制劑的整體質(zhì)量評價研究[8-12]。本實驗在前期對QXC化學(xué)成分檢識分析的基礎(chǔ)上[3]，首次采用UPLC法建立20批次制劑指紋圖譜，標(biāo)定了21個共有峰，指認(rèn)了其中7個色譜峰，進(jìn)而借助化學(xué)計量學(xué)方法對多批次制劑進(jìn)行質(zhì)量評價，根據(jù)正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）差異性成分篩選及前期入血成分研究結(jié)果[13]，定量分析了涵蓋有機(jī)酸、咖啡酰類衍生物、香豆素的7個化學(xué)成分，以期為QXC的整體質(zhì)量控制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步提升提供有效的參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters Acquity UPLC H-Class型超高效液相色譜儀，配有四元超高壓溶劑系統(tǒng)、自動進(jìn)樣恒溫樣本管理器、柱溫箱、PDA測器和Empower 3色譜工作站，美國Waters公司；SQP型萬分之一電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；XPE26型百萬分電子天平，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；DC400型超聲儀，東莞市大朗速潔超聲設(shè)備制造廠；2-16N型高速離心機(jī)，湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；明澈TM-D 24UV型超純水系統(tǒng)，默克密理博實驗室設(shè)備（上海）有限公司。

1.2 試劑與藥物

甲醇，分析純，廣東光華科技股份有限公司；乙腈（HPLC色譜級）、甲醇（HPLC色譜級）、甲酸（HPLC色譜級）為Fisher公司；水為實驗室超純水系統(tǒng)制備所得。對照品原兒茶酸（批號PS012604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.2%）、丹參素鈉（批號PS010590，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、新綠原酸（批號PS000974，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、隱綠原酸（批號PS001110，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、異嗪皮啶（批號PS012652，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%），上述5個對照品購自成都普思生物科技股份有限公司；對照品綠原酸（批號5077，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.1%）、迷迭香酸（批號5828，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.3%），上述2個對照品購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。前期收集QXC制劑共20批，其中樣品S1～S13生產(chǎn)廠家為廣州白云山敬修堂藥業(yè)股份有限公司，樣品S14～S20生產(chǎn)廠家為廣東五虎山藥業(yè)有限公司，具體信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 將QXC內(nèi)容物混勻、研細(xì)，取0.25 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 60%甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲45 min（功率400 W、頻率40 kHz），放冷，再次稱定質(zhì)量，減失的質(zhì)量用60%甲醇補(bǔ)足，搖勻，靜置，取上清液，12 000 r/min離心10 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取“1.2”項下7種對照品適量，分別置于10 mL棕色量瓶中，用純甲醇溶解，搖勻，定容配制成母液；分別精密吸取上述各母液適量制成含原兒茶酸19.26 μg/mL、丹參素鈉29.31 μg/mL、新綠原酸8.30 μg/mL、隱綠原酸7.49 μg/mL、異嗪皮啶16.62 μg/mL、綠原酸15.31 μg/mL、迷迭香酸39.67 μg/mL的混合對照品溶液。

表1 20批QXC樣品

2.2 色譜條件

色譜柱為Waters Acquity UPLC HSS T3柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～1.0 min，2%乙腈；1.0～4.0 min，2%～6%乙腈；2.0～9.0 min，6%～16%乙腈；9.0～13.0 min，16%～20%乙腈；13.0～15.0 min，20%～25%乙腈；15.0～16.0 min，25%乙腈；16.0～16.1 min，25%～2%乙腈；檢測波長為280 nm；體積流量0.5 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 按“2.1.1”項下方法制備QXC供試品溶液（S4），按“2.2”項下色譜條件連續(xù)6次進(jìn)樣測定，以異嗪皮啶為參照峰，得到21個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.10%～0.21%和0.22%～1.78%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗 取同一批QXC樣品（S4），按“2.1.1”項下方法，分別平行制備6份QXC供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以異嗪皮啶為參照峰，得到21個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.12%～0.37%和0.99%～2.02%，結(jié)果表明樣品處理方法具有良好的重復(fù)性。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取QXC的供試品溶液（S4），按“2.2”項下色譜條件，在0、2、6、12、24、36、48 h分別進(jìn)樣測定，以異嗪皮啶為參照峰，得到21個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.12%～0.97%和1.26%～2.47%，表明供試品溶液在室溫下48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 UPLC指紋圖譜的建立

按“2.1.1”項下方法制備20批QXC供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，將20批QXC UPLC圖譜色譜峰積分轉(zhuǎn)為AIA格式，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度軟件評價系統(tǒng)（2012版）》對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以樣品S1為參照圖譜，時間窗寬度設(shè)置為0.1 min，采用中位數(shù)法，通過多點校正進(jìn)行峰匹配，建立了20批QXC UPLC指紋圖譜，在此基礎(chǔ)上生成對照指紋圖譜（圖1），并進(jìn)行相似度評價，結(jié)果20批QXC樣品（S1～S20）的相似度分別為0.991、0.983、0.993、0.993、0.986、0.992、0.999、0.997、0.995、0.994、0.979、0.996、0.954、0.998、0.976、0.993、0.972、0.999、0.971、0.998，20批QXC與其對照圖譜的相似度在0.954～0.999，表明2個廠家不同批次樣品一致性及穩(wěn)定性良好。經(jīng)過全峰匹配后確定了21個共有峰，與混合對照品溶液比對，指認(rèn)了7個共有峰（圖2），根據(jù)保留時間先后順序依次為峰4（原兒茶酸）、5（丹參素鈉）、9（新綠原酸）、10（綠原酸）、11（隱綠原酸）、14（異嗪皮啶）、20（迷迭香酸），其中，異嗪皮啶是QXC原料藥腫節(jié)風(fēng)的特征指標(biāo)成分[14]，故選擇其作為參照峰。

2.5 化學(xué)模式識別分析

2.5.1 層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA） 以14號峰（異嗪皮啶）為參照峰，將20批QXC樣品的21個共有峰的相對峰面積（表2）導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行HCA，由結(jié)果知，20批QXC整體分為2類，其中來自廣東五虎山藥業(yè)有限公司的7批樣品（S14～S20）聚為第1類，其余來自廣州白云山敬修堂藥業(yè)股份有限公司的13批樣品（S1～S13）聚為第2類，詳見圖3，QXC質(zhì)量受到原料、提取工藝、炮制加工、生產(chǎn)等多方面環(huán)節(jié)的影響，根據(jù)聚類分析結(jié)果，考慮除了原料影響外，不同廠家的提取工藝、生產(chǎn)等也是影響制劑質(zhì)量的重要原因，而對于總體聚成2大類的其他具體原因仍需進(jìn)一步研究。

圖1 20批QXC樣品(S1～S20)的UPLC指紋圖譜(A)和對照指紋圖譜(B)

4-原兒茶酸 5-丹參素鈉 9-新綠原酸 10-綠原酸 11-隱綠原酸 14-異嗪皮啶 20-迷迭香酸

表2 20批QXC21個共有峰的相對峰面積值

2.5.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 以14號峰（異嗪皮啶）為參照峰，將20批QXC的21個共有峰的相對峰面積（表2）導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行PCA，PCA特征值及方差貢獻(xiàn)率見表3，結(jié)果知前4個主成分的特征值均大于1，累積貢獻(xiàn)率達(dá)87.5%，可反映QXC指紋圖譜共有峰的基本信息。由PCA得分圖（圖4）知PCA結(jié)果與HCA結(jié)果基本一致，20批樣品大致分為2大類，第1類樣品主要來自五虎山藥業(yè)有限公司，第2類樣品主要來自廣州白云山敬修堂藥業(yè)股份有限公司。

圖3 20批QXC的HCA結(jié)果

表3 QXC樣品主成分方差貢獻(xiàn)率和特征值

圖4 20批QXC的PCA得分圖

2.5.3 正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA） 結(jié)合HCA和PCA，20批樣品大致可分為2組，為進(jìn)一步尋找組間的差異性原因，采用OPLS-DA建立分析模型。結(jié)果表明模型穩(wěn)定性（R2）達(dá)到0.853，模型解釋率（R2）達(dá)到0.94，預(yù)測力（2）達(dá)到0.872，表明建立的OPLS-DA模型穩(wěn)定且預(yù)測能力較強(qiáng)。對OPLS-DA模型進(jìn)行置換檢驗（200次），得置換檢驗圖（圖5）。在圖5中，2在軸的截距為0.421，2在軸的截距為?0.871，斜率均大于0，表明建立的OPLS-DA模型無過度擬合的現(xiàn)象，能夠用于20批樣品組間差異的判別分析。OPLS-DA模型生成的變量重要性投影（VIP）值見圖6，VIP值是篩選差異性化合物的重要指標(biāo)，通常以VIP值大于1作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，VIP值越高，對組間差異的影響越大。本實驗以VIP＞1為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果共找到了8個成分，根據(jù)VIP值大小排序依次為20號峰（迷迭香酸）＞16號峰＞2號峰＞10號峰（綠原酸）＞19號峰＞11號峰（隱綠原酸）＞5號峰（丹參素鈉）＞9號峰（新綠原酸），提示這8個成分是引起不同批次QXC差異的主要標(biāo)志性成分。

2.6 多指標(biāo)成分的含量測定

2.6.1 色譜條件 色譜條件同“2.2”項。

2.6.2 供試品溶液的制備 供試品溶液的制備方法同“2.1.1”項。

圖5 OPLS-DA置換檢驗圖

圖6 20批QXC的OPLS-DA得分圖(A)和VIP圖(B)

2.6.3 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取“1.2”項下7種對照品適量，分別置于棕色量瓶中，用純甲醇溶解，搖勻，定容配制成母液；分別精密吸取上述各母液適量制成含原兒茶酸51.905 μg/mL、丹參素鈉216.646 μg/mL、新綠原酸51.645 μg/mL、隱綠原酸101.478 μg/mL、異嗪皮啶85.064 μg/mL、綠原酸132.984 μg/mL、迷迭香酸299.186 μg/mL的混合對照品溶液1。

2.6.4 專屬性考察 分別精密吸取60%甲醇、混合對照品溶液及供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖（圖2），結(jié)果表明，供試品中7個定量成分均與相鄰峰的分離度良好（均大于2.0）；空白溶劑對測定無干擾，說明方法的專屬性良好。

2.6.5 線性關(guān)系及檢測限、定量限考察 依次精密吸取“2.6.2”項下的混合對照品溶液1適量，分別置于2、5、10、50、100、200 mL量瓶中，加純甲醇定容至刻度、搖勻，得7個不同質(zhì)量濃度系列混合對照品溶液，分別按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣分析，并記錄上述7個成分的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸分析，得到QXC中7個定量成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍分別為原兒茶酸＝2 912.595＋211.274，＝0.999 9，線性范圍0.519～51.905 μg/mL；丹參素鈉＝1 310.550＋391.515，＝0.999 8，線性范圍2.166～216.646 μg/mL；新綠原酸＝2 946.539＋408.317，＝0.999 8，線性范圍0.516～51.645 μg/mL；綠原酸＝3 195.288＋623.986，＝0.999 8，線性范圍1.330～132.984 μg/mL；隱綠原酸＝ 2 893.893＋673.930，＝0.999 8，線性范圍1.015～101.478 μg/mL；異嗪皮啶＝1 803.268＋451.271，＝0.999 8，線性范圍0.851～85.064 μg/mL；迷迭香酸＝3 556.987＋1 741.879，＝0.999 8，線性范圍2.992～299.186 μg/mL；結(jié)果表明7個定量成分在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以最低質(zhì)量濃度的對照品溶液逐級稀釋，以信噪比為3的質(zhì)量濃度作為檢測限，結(jié)果檢測限分別為0.165、0.472、0.189、0.149、0.197、0.282、0.186 μg/mL；以信噪比為10的質(zhì)量濃度作為定量限，結(jié)果定量限分別為0.369、0.868、0.266、0.231、0.229、0.463、0.620 μg/mL。

2.6.6 精密度試驗 按“2.1.1”項下方法制備QXC供試品溶液（S4），按“2.2”項下色譜條件連續(xù)6次進(jìn)樣測定，分別計錄所含原兒茶酸、丹參素鈉、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸的峰面積并計算其RSD，結(jié)果測得上述7個定量成分峰面積的RSD分別為1.42%、0.16%、0.39%、0.15%、0.18%、0.55%、0.22%，表明該方法儀器精密度良好。

2.6.7 重復(fù)性試驗 取同一批QXC樣品（S4），按“2.1.1”項下方法分別平行制備6份QXC供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，分別計算QXC所含原兒茶酸、丹參素鈉、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)并計算其RSD，結(jié)果測得上述7個定量成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為0.65%、0.32%、1.04%、1.38%、0.75%、1.94%、0.71%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.8 穩(wěn)定性試驗 取QXC供試品溶液（S4），按“2.2”項下色譜條件，在0、2、6、12、24、36、48 h分別進(jìn)樣測定，計錄所含原兒茶酸、丹參素鈉、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸的峰面積并計算其RSD，結(jié)果測得上述7個定量成分峰面積的RSD分別為1.01%、1.63%、1.02%、0.65%、0.53%、1.50%、0.81%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.9 加樣回收率試驗 取同一批QXC樣品（S4）共6份，每份0.125 g，精密稱定，分別按已知指標(biāo)成分含量的100%加入原兒茶酸、丹參素鈉、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸混合對照品溶液，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，上述7個成分的平均加樣回收率分別為98.92%、99.93%、98.41%、100.45%、99.70%、98.39%、101.18%，RSD分別為1.10%、1.81%、1.25%、1.22%、1.60%、1.12%、0.92%，均不超過1.81%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.6.10 樣品測定 按“2.1.1”項下方法制備20批QXC供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算7個成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表4。結(jié)果20批QXC中原兒茶酸、丹參素鈉、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異嗪皮啶、迷迭香酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.284～0.948、1.868～3.758、0.493～1.178、1.002～2.278、0.672～1.744、0.456～0.821、1.943～5.282 mg/g，初步提示不同批次樣品中各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在一定的差異，7個成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)上下波動范圍均不超過3.3倍，其中異嗪皮啶質(zhì)量分?jǐn)?shù)波動范圍最小。

對比2個不同生產(chǎn)廠家數(shù)據(jù)，7個定量成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mg/g）均值分別如下：原兒茶酸（白云山五虎山）：（0.6010.572），丹參素鈉（白云山五虎山）：（2.6543.095），新綠原酸（白云山五虎山）：（0.7760.893），綠原酸（白云山五虎山）：（1.4451.696），隱原酸（白云山五虎山）：（1.0731.250），異嗪皮啶（白云山五虎山）：（0.5950.599），迷迭香酸（白云山五虎山）：（3.8654.197），采用SPSS 26.0軟件對2個廠家QXC 7個定量成分含量均值進(jìn)行檢驗，結(jié)果值為0.797（＞0.05），表明2個廠家QXC多指標(biāo)成分含量均值無顯著性差異。為更好的展示各批次同一成分含量差異，將20批QXC中7個定量成分的含量測定結(jié)果數(shù)據(jù)導(dǎo)入Hiplot科研繪圖平臺（https://hiplot.com. cn/），選擇“Word.D2”法，設(shè)置距離度量為“euclidean”，并選擇“按行標(biāo)準(zhǔn)化”處理，繪制聚類熱圖，結(jié)果見圖7（圖中顏色由藍(lán)到紅代表含量由低到高），結(jié)果表明20批樣品大致可聚成2大類，其中S17、S12、S18、S20、S19、S8、S9、S13、S15 9批聚為第1類，其余11批樣品聚為第2類，第1類樣品主要來自廣東五虎山藥業(yè)有限公司，第2類樣品除S14和S16外，均來自廣州白云山敬修堂藥業(yè)股份有限公司，基本佐證了指紋圖譜聚類分析的結(jié)果。

表4 20批QXC中7個定量成分的含量測定結(jié)果

圖7 26批QXC7個定量成分含量的聚類熱圖分析

另外，由聚類熱圖結(jié)果知來自第1類的樣品丹參素鈉、新綠原酸，綠原酸，隱綠原酸等4個成分的含量相對較高，來自第2類的樣品丹參素鈉、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的含量相對較低，提示這4個成分對樣品間分組有顯著影響，而這4個成分均來自指紋圖譜OPLS-DA篩選的差異性成分，二者相互吻合。

3 討論

3.1 樣品前處理考察

本實驗前期通過比較水、60%甲醇、甲醇、70%乙醇和乙醇作為提取溶劑的UPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)以60%甲醇作為提取溶劑色譜峰信息較為豐富且峰面積相對較大，故選用60%甲醇作為提取溶劑。通過比較超聲提取，加熱回流提取和冷浸提取3種不同提取方式的UPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)冷浸提取效果較超聲提取和加熱回流提取差，而超聲提取和加熱回流提取差別不大，考慮實驗操作的簡便性和可行性，故選擇超聲提取法。通過比較不同提取時間下的UPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)各色譜峰峰面積都隨著提取時間的增加而增加，但是45、60 min變化不大，為保證樣品提取完全且操作簡化性、節(jié)能等原則，故選擇超聲45 min。

3.2 色譜條件優(yōu)化

實驗前期對不同的色譜柱［HSS T3柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）、BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Cortecs C18（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）］進(jìn)行了考察，結(jié)果BEH C18色譜柱前端3 min前分離較好，但3 min后色譜峰的分離度沒有HSS T3柱好，Cortecs C18柱整體分離度沒有HSS T3柱好，因此選擇HSS T3柱。分別考察比較甲醇-水系統(tǒng)、甲醇-水（含0.1%甲酸）系統(tǒng)、甲醇-水（含0.1%冰乙酸）系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)、乙腈-水（含0.1%甲酸）系統(tǒng)、乙腈-水（各含0.1%甲酸）系統(tǒng)、乙腈-水（含0.1%冰乙酸）系統(tǒng)，結(jié)果乙腈-水（含0.1%甲酸）色譜峰信號豐富且分離度相對較好，故選擇乙腈-水（含0.1%甲酸）作為QXC指紋圖譜的流動相梯度洗脫系統(tǒng)。通過PDA檢測器在190～400 nm全波長掃描，結(jié)果280 nm色譜峰最多、基線噪音較低，各成分的分離情況相對較好，故選擇280 nm作為檢測波長。

3.3 參照峰的選擇

異嗪皮啶為QXC原料藥腫節(jié)風(fēng)的特征指標(biāo)成分，且出峰時間和峰面積適中，峰型較好，故選擇其作為參照峰，結(jié)合20批樣品的測定結(jié)果知異嗪皮啶質(zhì)量分?jǐn)?shù)波動范圍最小，含量較為穩(wěn)定，提示選擇異嗪皮啶作為參照峰可減小因數(shù)據(jù)大幅度波動對實驗結(jié)果的影響。

3.4 含量測定成分確定

本研究通過OPLS-DA分析找到了影響QXC質(zhì)量的8個差異性較大的化合物，提示這些成分對樣品分組有顯著影響，并指認(rèn)了其中5個，分別為迷迭香酸、丹參素鈉、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸，初步將上述5個成分作為定量候選化合物。另外，結(jié)合課題組前期對QXC大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究結(jié)果顯示原兒茶酸、異嗪皮啶、迷迭香酸均為入血原型成分[13]，提示可能為QXC藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，其中原兒茶酸具有抗炎[15]、抗菌[16]等藥理活性，異嗪皮啶為原料藥腫節(jié)風(fēng)的特征指標(biāo)成分，迷迭香酸與其他3個差異性化合物新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸均屬咖啡酰類衍生物，有文獻(xiàn)報道該類化合物具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤、抗病毒等藥理作用[17-20]，故將原兒茶酸、異嗪皮啶同時納入定量分析，建立同時涵蓋藥理活性及特征成分的多成分含量測定方法。

3.5 質(zhì)量控制策略

QXC現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)量控制方法較為低下，目前尚未見開展指紋圖譜的研究報道，不同以往文獻(xiàn)報道研究僅選取單一指標(biāo)異嗪皮啶或迷迭香酸進(jìn)行質(zhì)量控制，考慮中藥制劑成分復(fù)雜，藥理活性多樣化，本實驗采取“色譜指紋圖譜＋多指標(biāo)成分定量”的模式，并緊密結(jié)合化學(xué)模式識別技術(shù)進(jìn)行分析評價。

本實驗在運用中藥指紋圖譜表征QXC整體概貌的基礎(chǔ)上，選擇與臨床療效相關(guān)性強(qiáng)、以特征指標(biāo)成分、藥理活性成分、質(zhì)量差異性成分作為定量評價指標(biāo)，這樣不僅豐富了QXC質(zhì)量鑒別的檢測方法，還可準(zhǔn)確地標(biāo)示與限定其成分種類、含量與配比等，克服了中藥指紋圖譜模糊性特點，保留其整體性特點，提供了一種多變量整體、精確評價QXC質(zhì)量控制模式。

結(jié)果表明，20批QXC指紋圖譜相似度較高，表明其質(zhì)量在整體水平上具有較好的一致性，但不足以辨別差異性與質(zhì)量優(yōu)劣，進(jìn)而借助CA、PCA、OPLS-DA等化學(xué)模式識別技術(shù)進(jìn)行綜合分析，20批樣品大致分為2類，并篩選了8個質(zhì)量差異性成分，指認(rèn)了其中5個成分，以上3種方法結(jié)果互為驗證，相互補(bǔ)充。

在此基礎(chǔ)上，對OPLS-DA分析篩選并指認(rèn)的5個質(zhì)量差異性成分及原兒茶酸、異嗪皮啶等7個成分進(jìn)行定量分析并進(jìn)行聚類熱圖分析，20批樣品大致聚為2類，結(jié)果可見基于指紋圖譜和基于含量測定的20批次樣品間分類基本一致，基于含量測定的聚類熱圖分析尋找組間差異性成分和指紋圖譜OPLS-DA篩選的差異性成分基本吻合，提示本實驗定量成分選擇具有一定的合理性和可行性。

另外，因目前市面銷售QXC多為廣州白云山敬修堂藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，廣東五虎山藥業(yè)有限公司產(chǎn)品批次更新較慢，本次收集的2個廠家樣品數(shù)目可能存在差異，盡管指紋圖譜中HCA和PCA結(jié)果提示2個廠家的樣品可能存在差異，但相似度結(jié)果顯示2個廠家樣品相似度均較高；定量分析方面，本實驗同時納入各廠家各定量成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值指標(biāo)，進(jìn)一步減少組間樣品數(shù)量對結(jié)果的影響，結(jié)果表明2個廠家QXC多指標(biāo)成分含量均值無顯著性差異。綜合定性定量分析結(jié)果表明，2個廠家的多批次樣品整體質(zhì)量較為接近。

綜上，本實驗采用統(tǒng)一的色譜條件實現(xiàn)了指紋圖譜定性和多成分定量的同時分析，建立的方法專屬性強(qiáng)，可快速、準(zhǔn)確地評價不同廠家不同批次QXC的質(zhì)量差異和重點成分，從而為全面控制和整體評價該制劑質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)及為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的規(guī)范化提供重要借鑒。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality control of Qingre Xiaoyanning Capsules based on multi-pattern recognition method of UPLC fingerprint and multi-index composition determination

WEI Zhuo-chun, LIN Hui, PENG Ying, ZHANG Hui-qing, LI Jian

Binhaiwan Central Hospital of Dongguan, Dongguan 523905, China

To establish the UPLC fingerprint and multi-component quantitative analysis of Qingre Xiaoyanning Capsules (清熱消炎寧膠囊, QXC), at the same time, chemical pattern recognition technology was used to evaluate the quality of multiple batches of QXC.The sample pretreatment conditions and chromatographic analysis conditions of QXC were optimized, and the optimal UPLC fingerprint and multi-component quantitative analysis method were established. Column: UPLC HSS T3 column (50 mm × 2.1 mm, 1.8 μm); mobile phase acetonitrile-water (containing 0.1% formic acid) with gradient elution; detection wavelengths 280 nm; column temperature 40 ℃; flow rate 0.5 mL/min. Cluster analysis (CA), principal components analysis (PCA), orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) and cluster heatmap analysis were applied for evaluating the quality of 20 batches of QXC.Methodological investigation of UPLC fingerprint and content determination were well verified and meeting the analysis requirements. A total of 21 common peaks were obtained by full peak matching, and seven of them were identified by comparing with the retention time of mixed reference substance. The similarity of 20 batches of samples was greater than 0.954, which showed good consistency and stability between the samples. Twenty samples could be classified into two clusters; Four principal components from 21 common peaks were extracted by PCA. Eight quality differential compounds were presented in the fingerprint by OPLS-DA, including rosmarinic acid, chlorogenic acid, 4-dicaffeoylquinic acid, salvianic acid A sodium, neochlorogenic acid and so on. The resolution and linear relationship of seven components in quantitative analysis were good. The average recovery rates were 98.41%—101.18% with RSD ≤ 1.81%. Results of cluster heatmap analysis showed that 20 batches of QXC also could be divided into two categories.In this study, the qualitative analysis of UPLC fingerprint and quantitative analysis of multiple index components based on the same chromatographic analysis conditions is specific, simple and accurate, which can provide a reference for the quality control and quality evaluation of QXC.

Qingre Xiaoyanning Capsules; ultra-performance liquid chromatography fingerprint; cluster analysis; principal components analysis; orthogonal partial least squares discriminant analysis; quantitative analysis; cluster heatmap analysis; quality control; rosmarinic acid; chlorogenic acid; 4-dicaffeoylquinic acid; salvianic acid A sodium; neochlorogenic acid

R283.6

A

0253 - 2670(2023)15 - 4856 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.011

2023-02-20

東莞市社會發(fā)展科技項目（20211800900442）

韋卓純，女，碩士，主管藥師，研究方向為中藥質(zhì)量控制研究。Tel: (0769)85010062 E-mail:wzc2018666@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]