沈 瑤，黃思紅，劉依茹，李靖蕾，陳昌倫，劉考鏵，劉 偉，秦路平，李榮勝*，吳建軍*

基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析覆盆子不同部位的化學(xué)成分及其9種成分含量的快速測(cè)定

沈 瑤1，黃思紅2，劉依茹1，李靖蕾1，陳昌倫1，劉考鏵1，劉 偉3，秦路平1，李榮勝3*，吳建軍1*

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053 2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院寶山分院 兒科，上海 201900 3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所，肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203

采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS法對(duì)覆盆子不同部位（小核果和花托）化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，并建立快速測(cè)定覆盆子中9種成分含量的方法。采用Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱，以0.1%甲酸水與乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫；覆盆子化學(xué)成分鑒定時(shí)采用正負(fù)離子Full MS/dd-MS2模式，通過化合物的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息，結(jié)合對(duì)照品比對(duì)確認(rèn)，進(jìn)行覆盆子不同部位主要化學(xué)成分的快速、精準(zhǔn)識(shí)別。采用ACQUITY BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱在負(fù)離子Full MS/SIM模式，建立快速測(cè)定覆盆子不同部位中9種成分（沒食子酸、蘆丁、鞣花酸、金絲桃苷、山柰酚-3--蕓香糖苷、紫云英苷、椴樹苷、槲皮素和山柰酚）含量的UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS方法，并測(cè)定其含量。從覆盆子小核果和花托中共鑒定122種化學(xué)成分，包括黃酮類66種、有機(jī)酸類28種、萜類24種、其他類4種。成功建立一種6 min完成覆盆子中9種成分含量測(cè)定的方法，各成分在其線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性良好（RSD≤6.30%）；加樣回收率在99.45%～105.30%（RSD≤4.43%），并發(fā)現(xiàn)小核果中蘆丁的含量顯著高于花托；而花托中的鞣花酸、山柰酚-3--蕓香糖苷和椴樹苷的含量顯著高于小核果。覆盆子小核果和花托部位的化學(xué)成分存在差異性，運(yùn)用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS建立的定量方法分析時(shí)間短、靈敏度高、準(zhǔn)確性好，方法學(xué)考察結(jié)果均符合含量測(cè)定的要求，可用于覆盆子中9種成分的快速測(cè)定。

覆盆子；小核果；花托；超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜；沒食子酸；蘆??；鞣花酸；金絲桃苷；山柰酚-3--蕓香糖苷；紫云英苷；椴樹苷；槲皮素；山柰酚

覆盆子為薔薇科懸鉤子屬植物華東覆盆子Hu.的干燥果實(shí)，具有益腎固精縮尿、養(yǎng)肝明目的功效[1]，應(yīng)用歷史悠久[2]。覆盆子在我國(guó)浙江、福建、江蘇等地區(qū)有廣泛分布，于2002年被中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部認(rèn)定為既是食品又是中藥材的兩用品種，兼具藥食兩用性，具備極高的研究和開發(fā)價(jià)值。覆盆子為聚合果，由多數(shù)小核果聚合而成，其構(gòu)造可分為小核果和花托2部分（圖1）?，F(xiàn)代研究表明，覆盆子中主要含黃酮類、有機(jī)酸類、萜類、甾體及多糖類等成分[3-7]，然而，至今尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)覆盆子不同部位的化學(xué)成分進(jìn)行分析的研究報(bào)道，導(dǎo)致其不同部位的化學(xué)成分及其含量的差異尚不明確。目前《中國(guó)藥典》2020年版以鞣花酸和山柰酚- 3--蕓香糖苷作為含量測(cè)定項(xiàng)[1]，已有文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]通過HPLC法在254、315、344 nm波長(zhǎng)切換下測(cè)定了覆盆子中7種成分的含量和在360 nm下測(cè)定6種成分的含量，采集時(shí)間約60 min。本研究利用高分辨質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)，一級(jí)質(zhì)譜精確定量保證穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度的同時(shí)，簡(jiǎn)化了操作處理流程，節(jié)省分析時(shí)間；首次對(duì)覆盆子不同部位（小核果和花托）化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，并采用UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap HRMS對(duì)小核果和花托中沒食子酸、蘆丁、鞣花酸、金絲桃苷、山柰酚-3--蕓香糖苷、紫云英苷、椴樹苷、槲皮素和山柰酚共9種成分進(jìn)行測(cè)定，以期為覆盆子不同部位的合理利用及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

圖1 覆盆子構(gòu)造圖

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Dionex Ultimate 3000高壓液相色譜、Q Exactive四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Co.，美國(guó)）、Sartorius BP211D電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、微量移液器（Eppendorf，美國(guó)）、高速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）、HH-4型數(shù)碼恒溫水浴鍋（國(guó)華儀器制造有限公司）。

1.2 試藥與試劑

10批次覆盆子中藥材（批號(hào)S220501～S220510）購(gòu)自瑞輝中藥材有限公司，產(chǎn)地杭州千島湖，經(jīng)過浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院秦路平教授鑒定為薔薇科植物華東覆盆子Hu.的干燥果實(shí)。

對(duì)照品水楊酸（批號(hào)AF21052253）購(gòu)自成都埃法生物科技有限公司；沒食子酸（批號(hào)D0409AS）、槲皮素（批號(hào)0821AS）、紫云英苷（批號(hào)MB7087）、阿魏酸（批號(hào)M1102AS）、金絲桃苷（批號(hào)00807AS）、橙皮苷（批號(hào)A1006AS）、柚皮苷（批號(hào)J1110AS）、奎寧酸（批號(hào)MB6731）、蘆?。ㄅ?hào)J0509AS）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；新綠原酸（批號(hào)15020503）、咖啡酸（批號(hào)190425）、綠原酸（批號(hào)15020601）、異綠原酸A（批號(hào)15030201）、異綠原酸B（批號(hào)15030202）、異綠原酸C（批號(hào)15030203）、隱綠原酸（批號(hào)15020603）購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；兒茶素（批號(hào)PRF21062821）、原兒茶醛（批號(hào)PRF10041021）、鞣花酸（批號(hào)PRF21030521）、山柰酚-3--蕓香糖苷（批號(hào)PRF20071321）、銀椴苷（批號(hào)PRF21031542）、木犀草素（批號(hào)BP0899）、木犀草苷（批號(hào)BP0899）、刺芒柄花素（批號(hào)BP0592）、異槲皮苷（批號(hào)PRF10032142）、原兒茶酸（批號(hào)PRF10061151）均購(gòu)自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；以上對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。色譜純甲醇與乙腈購(gòu)自美國(guó)賽默飛科技有限公司。色譜純甲酸購(gòu)自美國(guó)天地股份有限公司。分析純無水乙醇購(gòu)自中國(guó)杭州悅耳科技有限公司。超純水通過Milli-Q Academic System制備獲得。

2 方法與結(jié)果

2.2 覆盆子中化學(xué)成分鑒定

2.2.1 色譜條件 使用Acquity UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱，流動(dòng)相0.1%甲酸水與乙腈，梯度洗脫：0～1 min，2%乙腈；1～10 min，2%～48%乙腈；10～11 min，48%乙腈；11～12 min，48%～95%乙腈；12～14 min，95%乙腈；14～45 min，2%乙腈；柱溫40 ℃；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量3 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 采用Q Exactive四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（H-ESI）作為分析檢測(cè)的儀器，電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子Full MS/dd-MS2模式全掃描。正離子模式參數(shù)：掃描范圍（/100～1500）；分辨率70 000；噴霧電壓3.5 kV；毛細(xì)管溫度320 ℃；輔助加熱器溫度300 ℃；鞘氣（N2）流量35 arb；輔助氣（N2）流量13 arb；自動(dòng)增益控制（AGC）106；s-lens 射頻水平50。負(fù)離子模式參數(shù)：掃描范圍（/100～1500）；分辨率70 000；噴霧電壓3.2 kV；毛細(xì)管溫度320 ℃；輔助加熱器溫度300 ℃；鞘氣（N2）流量35 arb；輔助氣（N2）流量10 arb；自動(dòng)增益控制（AGC）106；s-lens 射頻水平50。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 取各對(duì)照品適量，精密稱定，分別溶于20%甲醇中，配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，待用。所有對(duì)照品溶液均在4 ℃條件下貯藏，用于化學(xué)成分鑒定用。

2.2.4 供試品溶液的制備 將批號(hào)S220503覆盆子整果分離為小核果和花托，粉碎，過60目篩。分別精密稱取供試品（覆盆子小核果、花托）粉末1.0 g，加60%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，放置，取上清液濾過，取續(xù)濾液1 mL超純水稀釋至10 mL，在12 000×、4 ℃條件下離心10 min，待用。

2.2.5 鑒定結(jié)果 按照“2.2.1”及“2.2.2”項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣，根據(jù)高分辨質(zhì)譜提供的準(zhǔn)分子離子和加荷離子等信息推測(cè)并得到一級(jí)質(zhì)譜的精確相對(duì)分子質(zhì)量，經(jīng)Xcalibar 3.0軟件擬合分子式。對(duì)在高分辨質(zhì)譜下獲取的各成分推測(cè)，再通過與對(duì)照品、文獻(xiàn)、Mass Bank等數(shù)據(jù)庫(kù)及碎片離子信息，進(jìn)一步對(duì)覆盆子所含化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。從覆盆子中鑒定出122種化學(xué)成分，包括黃酮類66種、有機(jī)酸類28種、萜類24種、其他類4種成分，其中27種化學(xué)成分通過對(duì)照品比對(duì)確認(rèn)，44個(gè)化合物與文獻(xiàn)報(bào)道一致，其他化合物根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)一級(jí)、二級(jí)碎片比對(duì)獲得。覆盆子整果、小核果及花托提取液正負(fù)離子模式下的總離子流圖見圖2，結(jié)果見表1。

2.2.6 化合物結(jié)構(gòu)鑒定及質(zhì)譜特征

（1）黃酮類成分：從覆盆子中鑒定的黃酮類成分多達(dá)66種，見表1。黃酮類化合物大多以A-C-B3個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)連接，其A環(huán)7位和C環(huán)3位連接的--糖苷鍵容易斷裂產(chǎn)生[M－H2O]?、[M－H－rha]?、[M－H－glc]?、[M－H－rutinose]?等碎片，C環(huán)C--C鍵斷裂或發(fā)生重排。在MS條件下，在負(fù)離子模式下有較好的響應(yīng)。以《中國(guó)藥典》控制成分山柰酚-3--蕓香糖苷和椴樹苷為例，一級(jí)質(zhì)譜得到山柰酚-3--蕓香糖苷/593.151 9 [M－H]?準(zhǔn)分子離子峰，化學(xué)式為C27H30O15，在二級(jí)質(zhì)譜下失去-C12H20O9碎片得到/284.032 8 [M－H－C15H10O6]?離子碎片，該碎片進(jìn)一步失去-CH2O碎片得到/255.029 8 [M－H－C14H8O5]?，該碎片失去-CO碎片最終得到/227.034 4 [M－H－C13H6O4]?離子碎片。從裂解獲得的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜離子碎片/值分析，化合物裂解途徑符合黃酮類的裂解規(guī)律，與文獻(xiàn)報(bào)道裂解途徑相似[15]，通過對(duì)照品比對(duì)確定化合物為山柰酚-3--蕓香糖苷，相應(yīng)質(zhì)譜裂解途徑見圖3。椴樹苷/593.130 6 [M－H]?準(zhǔn)分子離子峰，化學(xué)式為C30H26O13。在二級(jí)質(zhì)譜下失去-C15H16O7碎片得到/285.040 5 [M－H－C15H10O6]?碎片，該碎片進(jìn)一步裂解得到/255.029 7 [M－H－C14H8O5]?，最終得到/227.029 7 [M－H－C7H2O3]?離子碎片。從裂解獲得的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜離子碎片/值分析，化合物裂解途徑符合黃酮類的裂解規(guī)律，與對(duì)照品一致，通過對(duì)照品比對(duì)確定化合物為椴樹苷，相應(yīng)質(zhì)譜裂解途徑見圖3。

圖2 覆盆子整果(A) 及其不同部位(B:小核果；C:花托) 提取液的總離子流圖

表1 覆盆子不同部位（小核果和花托）的化學(xué)成分鑒定

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

*經(jīng)對(duì)照品指認(rèn)；＋表示測(cè)出 ?表示未測(cè)出

*Confirmed with reference substance; +detected ?not detected

（2）有機(jī)酸類成分：研究表明有機(jī)酸是植物中共有成分，且大多有生物活性。本次建立的分析方法從覆盆子中共鑒定出28個(gè)有機(jī)酸類成分，見表1。此類化合物在負(fù)離子模式下有較好的響應(yīng)，因含有-COOH官能團(tuán)，一般容易斷裂產(chǎn)生[M－H－H2O]?、[M－H－CO2]?、[M－H－CO]?等小分子基團(tuán)。以沒食子酸和鞣花酸的裂解規(guī)律為例，一級(jí)質(zhì)譜得到?jīng)]食子酸/169.013 1 [M－H]?準(zhǔn)分子離子峰，化學(xué)式為C7H6O5，在高能H－ESI質(zhì)譜離子源碰撞離子作用下獲得主要二級(jí)碎片離子信息為/150.969 4 [M－H－H2O]?、/97.028 0 [M－H－2CO2-O]?和/125.023 0 [M－H－CO2]?3個(gè)離子碎片。鞣花酸一級(jí)質(zhì)譜得到/300.998 9 [M－H]?準(zhǔn)分子離子峰，化學(xué)式為C14H6O8，二級(jí)質(zhì)譜獲得/283.994 0 [M－H－H2O]?和/257.008 8 [M－H－CO2]?離子碎片。從裂解獲得的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜離子碎片/值分析，沒食子酸和鞣花酸化合物裂解途徑符合有機(jī)酸的裂解規(guī)律，與文獻(xiàn)報(bào)道裂解途徑相似[16]，同時(shí)通過對(duì)照品的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜裂解碎片和提取離子峰位置、相對(duì)保留時(shí)間比對(duì)，最終確定化合物分別為沒食子酸和鞣花酸，相應(yīng)質(zhì)譜裂解途徑見圖4。

圖3 山柰酚-3-O-蕓香糖苷與椴樹苷的質(zhì)譜棒狀圖 (A、B) 和裂解途徑(C、D)

圖4 沒食子酸與鞣花酸的質(zhì)譜棒狀圖(A、B) 和裂解途徑(C、D)

（3）萜類成分：從覆盆子中鑒定的萜類成分24種，見表1。萜類化合物是以異戊二烯結(jié)構(gòu)單元為基本骨架的烴類及其其含氧衍生物，以5個(gè)碳為基本單位，按單位數(shù)量分為單萜、二萜、三萜等。此類化合物一般在[M＋H]+、[M＋Na]+、[M－H]?、[M＋COOH]?等多種模式下均有響應(yīng)，通常容易發(fā)生糖苷鍵斷裂，丟失[M－H2O]?、[M－CO2]?、[M－Rha]?、[M－Glc]?、[M－Rutinose]?等碎片。以覆盆子酸為例，該化合物在正離子模式下響應(yīng)較好，一級(jí)質(zhì)譜得到覆盆子酸/485.328 4 [M＋H]+準(zhǔn)分子離子峰，化學(xué)式為C30H44O5，在二級(jí)質(zhì)譜條件下獲得失去1分子H2O，得到/467.312 7 [M＋H－H2O]+，該碎片進(jìn)一步裂解失去1分子-CO得到/439.319 6 [M＋H－CO]+碎片，覆盆子酸的裂解途徑與數(shù)據(jù)庫(kù)萜類化合物的裂解規(guī)律相符合。

（4）其他類成分：從覆盆子中鑒定出的其他類成分4種，分別位香草醛、白藜蘆醇和stellarin-2、根皮酸。

2.3 覆盆子中9種成分定量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 使用Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，流動(dòng)相為0.1%甲酸水與乙腈，梯度洗脫：0～0.6 min，5%乙腈；0.6～1.0 min，5%～25%乙腈；1.0～3.5 min，25%～48%乙腈；3.5～4.0 min，48%～95%乙腈；4.0～5.0 min，95%乙腈；5.01～6.0 min，5%乙腈；柱溫40 ℃；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量3 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 參數(shù)為負(fù)離子Full MS/SIM模式全掃描，分辨率70 000；噴霧電壓3.2 kV；毛細(xì)管溫度320 ℃；輔助加熱器溫度300 ℃；鞘氣（N2）流量35 arb；輔助氣（N2）流量10 arb；自動(dòng)增益控制（AGC）106；s-lens射頻水平50。掃描范圍（/100～1500）；碰撞能梯度為10、20、40 eV。

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取各對(duì)照品沒食子酸10.9 mg、蘆丁14.7 mg、鞣花酸13.3 mg、金絲桃苷11.8 mg、山柰酚-3--蕓香糖苷11.4 mg、紫云英苷12.5 mg、椴樹苷11.3 mg、槲皮素12.5 mg、山柰酚20.0 mg，柳氨酚（內(nèi)標(biāo)）10.0 mg于10 mL量瓶中，加入甲醇定容，分別配制成沒食子酸1.09 mg/mL、蘆丁1.47 mg/mL、鞣花酸1.33 mg/mL、金絲桃苷1.18 mg/mL、山柰酚-3--蕓香糖苷1.14 mg/mL、紫云英苷1.25 mg/mL、椴樹苷1.13 mg/mL、槲皮素1.25 mg/mL、山柰酚2.00 mg/mL、柳氨酚1.00 mg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3.4 供試品溶液的制備 將不同批號(hào)覆盆子整果分離為小核果和花托，粉碎，過60目篩。分別精密稱取供試品（覆盆子小核果、花托）粉末1.0 g，加60%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，放置，取上清液濾過，取續(xù)濾液1 mL超純水稀釋至10 mL（含柳氨酚質(zhì)量濃度50 ng/mL）12 000×g、4 ℃離心10 min，備用。

2.3.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用柳氨酚內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為50 ng/mL的20%甲醇稀釋并定容，因鞣花酸相對(duì)含量較高，為了保證被測(cè)樣品含量符合線性范圍，故鞣花酸對(duì)照品溶液依次配制成54.47、136.19、340.48、851.20、2 128.00、5 320.00、13 300.00 ng/mL的梯度溶液；其他8種對(duì)照品溶液依次配制成3.20、8.19、20.48、51.20、128.00、320.00、800.00 ng/mL的梯度溶液。在“2.3.1”及“2.3.2”項(xiàng)所述色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。采用Xcalibur軟件對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)處理，以各待測(cè)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），待測(cè)物峰和內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)（）及線性范圍。線性關(guān)系考察結(jié)果發(fā)現(xiàn)9種成分（沒食子酸、蘆丁、鞣花酸、金絲桃苷、山柰酚-3--蕓香糖苷、紫云英苷、椴樹苷、槲皮素和山柰酚）在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，鞣花酸線性范圍為54.47～13 300.00 ng/mL，其他成分線性范圍均在3.26～800.00 ng/mL，線性回歸方程、見表2。

2.3.6 精密度考察 配制沒食子酸、蘆丁、鞣花酸、金絲桃苷、山柰酚-3--蕓香糖苷、紫云英苷、椴樹苷、槲皮素和山柰酚的質(zhì)量濃度分別為3.39、8.43、8.17、3.48、3.36、3.26、3.33、3.28、3.28 ng/mL含用柳氨酚內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為50 ng/mL的混合對(duì)照品溶液，按“2.3.1”及“2.3.2”項(xiàng)所述條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值計(jì)算9種成分的RSD，同1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次來計(jì)算日內(nèi)精密度，連續(xù)3 d，每天進(jìn)樣6次來計(jì)算日間精密度，結(jié)果見表3，表明該方法精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性考察 按照“2.3.4”項(xiàng)方法平行制備的6份覆盆子供試液，分別進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值。結(jié)果見表3，表明該方法重復(fù)性良好。

表2 各對(duì)照品線性關(guān)系

2.3.8 穩(wěn)定性考察 取3份按照“2.3.4”項(xiàng)方法制備的覆盆子提取液，放置于室溫（25±2）℃，分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，計(jì)算9種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值。結(jié)果見表3，表明該供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.9 加樣回收率 按照“2.3.4”項(xiàng)方法平行制備9份覆盆子提取液，每3份為1組，根據(jù)各成分在樣品中量，加入配制好的含9種成分對(duì)照品的混合溶液適量，使加入后各成分的量分別為覆盆子提取液中相應(yīng)成分量的約50%、100%、150%。計(jì)算各待測(cè)物的平均回收率及RSD值，加樣回收率的考察結(jié)果見表3，在建立的方法下9種成分和內(nèi)標(biāo)柳胺酚在空白對(duì)照溶劑、混合對(duì)照品溶液和覆盆子小核果、花托提取液的提取離子流圖見圖5。

2.4 樣品含量檢測(cè)與結(jié)果

取收集的覆盆子樣品，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備各批小核果和花托供試品溶液，在“2.1”及“2.2”項(xiàng)下色譜質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算食子酸、蘆丁、鞣花酸、金絲桃苷、山柰酚-3--蕓香糖苷、紫云英苷、椴樹苷、槲皮素和山柰酚苷在各樣品中的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，發(fā)現(xiàn)不同批次樣品的含量存在一定差異，10批次樣品小核果中沒食子酸0.006～0.023 mg/g、蘆丁0.05～0.20 mg/g、鞣花酸1.06～4.48 mg/g、金絲桃苷0.005～0.078 mg/g、山柰酚- 3--蕓香糖苷0.15～0.41 mg/g、紫云英苷0.05～0.17 mg/g、椴樹苷0.04～0.40 mg/g、槲皮素0.001 6～0.011 6 mg/g、山柰酚0.003 2～0.009 1 mg/g；花托中沒食子酸0.013～0.024 mg/g、蘆丁0.01～0.09 mg/g、鞣花酸2.97～5.69 mg/g、金絲桃苷0.004～0.056 mg/g、山柰酚-3--蕓香糖苷0.21～0.62 mg/g、紫云英苷0.06～0.21 mg/g、椴樹苷0.17～0.43 mg/g、槲皮素0.001 6～0.007 5 mg/g、山柰酚0.000 3～0.011 5 mg/g。

表3 9種成分的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率

A-空白溶劑對(duì)照 B-混合對(duì)照品溶液 C-覆盆子小核果提取液 D-覆盆子花托提取液；1-沒食子酸 2-蘆丁 3-鞣花酸 4-金絲桃苷 5-山柰酚-3-O-蕓香糖苷 6-紫云英苷 7-椴樹苷 8-槲皮素 9-山柰酚 IS-柳胺酚

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，小核果中蘆丁的含量顯著性高于花托 [（0.111±0.042）mg/g（0.045±0.028）mg/g，＜0.01]，而花托中鞣花酸[（4.653±0.916）mg/g（2.890±1.232）mg/g，＜0.01]、山柰酚-3--蕓香糖苷 [（0.423±0.124）mg/g（0.302±0.095）mg/g，＜0.05）]、椴樹苷 [（0.318±0.087）mg/g（0.162±0.125）mg/g，＜0.01）]的含量顯著性高于小核果，其他成分在小核果和花托中的含量分布無顯著性差異。

表4 不同批次、不同部位覆盆子中9種成分含量

檢驗(yàn)，與小核果比較：#< 0.05##< 0.01

test,#< 0.05##< 0.01drupelet group

3 討論

覆盆子為聚合果，其構(gòu)造可分為小核果和花托兩部分。迄今為止，所有關(guān)于覆盆子的化學(xué)及藥理方面的研究報(bào)道以及臨床應(yīng)用都是局限于覆盆子整果，導(dǎo)致覆盆子不同部位的化學(xué)成分及其含量的差異尚不明確，本研究首次將覆盆子分為小核果和花托2個(gè)部分，對(duì)其化學(xué)成分及含量差異進(jìn)行分析。近年來UHPLC-Q-Extactive Orbitrap HRMS聯(lián)用技術(shù)，因其具有高分辨力、強(qiáng)分離能力、高靈敏度、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，已較廣泛應(yīng)用于中藥或復(fù)雜基質(zhì)中待測(cè)成分的篩選、鑒定及定量分析[17-20]。本研究采用HRMS技術(shù)，首先基于化合物的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息，結(jié)合對(duì)照品比對(duì)確認(rèn)等方法，從覆盆子小核果和花托中快速推測(cè)鑒定出122種化學(xué)成分，包括黃酮類66種，有機(jī)酸類28種，萜類24種，其他類4種。其中枸櫞酸（2）、刺芒柄花素（57）、野鳶尾黃素（89）、3,4-二羥基-7,5-二甲氧基黃酮（90）為小核果特有成分；白楊素-6--α--阿拉伯糖- 8--β--葡萄糖苷（72）、佛來心苷（88）、白楊素- 6--β--葡萄糖-8--α--阿拉伯糖苷（92）和川陳皮素（103）為花托成分，其余成分皆為共有成分。

另外，《中國(guó)藥典》2020年版以鞣花酸和山柰酚-3--蕓香糖苷作為覆盆子的含量測(cè)定項(xiàng)，針對(duì)中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，若能實(shí)現(xiàn)其多成分的定性及定量分析，從而可以從整體上更好地進(jìn)行覆盆子質(zhì)量評(píng)價(jià)，本研究利用HRMS高分辨的功能特點(diǎn)，采用一級(jí)質(zhì)譜精確定量方法建立了快速測(cè)定覆盆子中包括藥典含量測(cè)定項(xiàng)在內(nèi)的9種成分（沒食子酸、蘆丁、鞣花酸、金絲桃苷、山柰酚-3--蕓香糖苷、紫云英苷、椴樹苷、槲皮素和山柰酚）含量的方法，并發(fā)現(xiàn)了小核果中蘆丁（＜0.01）的含量顯著性高于花托，而花托中鞣花酸（＜0.01），山柰酚-3--蕓香糖苷（＜0.05），椴樹苷（＜0.01）的含量顯著性高于小核果，其他成分在小核果和花托中的含量分布雖有差別，但無顯著性差異，提示了按照現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，花托部位對(duì)覆盆子整果的質(zhì)量達(dá)標(biāo)發(fā)揮重要作用。該方法在保證極高的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度的同時(shí)簡(jiǎn)化了操作處理流程，節(jié)省了分析時(shí)間（單個(gè)樣品分析時(shí)間為6 min），為覆盆子的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了參考，有一定推廣應(yīng)用前景。

覆盆子作為藥食同源品種，同時(shí)作為新“浙八味”培育品種，在我國(guó)擁有特定的資源優(yōu)勢(shì)，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)覆盆子小核果和花托的化學(xué)成分及其含量存在差異性，不同的化學(xué)成分將導(dǎo)致功效的差異性，根據(jù)中藥加工精深化的趨勢(shì)，如何有效使用覆盆子的不同部位，合理確定其具體應(yīng)用范圍，使覆盆子的利用效益達(dá)到最大化，將是今后研究的方向。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Analysis of chemical components in different parts ofand rapid determination of its nine main components by UHPLC-Q-Orbitrap high resolution mass spectrometry

SHEN Yao1, HUANG Si-hong2, LIU Yi-ru1, LI Jing-lei1, CHEN Chang-lun1, LIU Kao-hua1, LIU Wei3, QIN Lu-ping1, LI Rong-sheng3, WU Jian-jun1

1. School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China 2. Department of Pediatric, Baoshan Branch, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201900, China 3. Institute of Liver Diseases, Key Laboratory of Liver and Kidney Diseases, Ministry of Education, Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (TCM), Shanghai 201203, China

UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS was used to analyze and identify the chemical components in different parts (drupelets and receptacles) of, and a rapid method for the determination of nine components in drupelets and receptacles ofwas established, and to provide the basis for the rational application of different parts ofand its quality evaluation.Using Acquity UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm) column with 0.1% formic acid water and acetonitrile as mobile phase, and gradient elution was performed. The identification of chemical components inadopted the positive and negative ion Full MS/dd-MS2mode, combined with the primary and secondary mass spectrometry information of the compound, from the comparison and confirmation of reference substances, the main chemical components ofcan be identified quickly and accurately. The UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS method for rapid determination of nine components inwas established by using Acquity BEHC18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm) column in negative ion Full MS-SIM mode, and the contents of 10 batches ofwere determined.A total of 122 chemical components in drupelets and receptacle ofwere identified, including 66 flavonoids, 28 organic acids, 24 terpenoids and 4 other chemical components. Established a method successfully for the determination of nine components ofin 6 min, and the linear relationship of each component was good in its linear range. The precision, repeatability and stability were good (RSD≤6.30%); The recoveries were 99.45%?105.30% (RSD≤4.43%). Comparing the average content of nine components in 10 batches of drupelet and receptacle samples, the content of rutin in drupelets is higher than in receptacle, while the contents of ellagic acid, kaempferol 3-rutinoside and tiliroside are higher in receptacles than in drupelets of.The chemical compositions of different parts (drupelets and receptacles) ofwere different. UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS method is achieved the rapid identification of chemical components in. The established quantitative method has the advantages of short analysis time, high sensitivity and good accuracy, and the results of methodological investigation meet the requirements of content determination. It can be used for rapid determination of nine components in, which can provide some scientific reference for its quality evaluation.

Hu.; drupelet; receptacle; UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS; gallic acid; rutin; ellagic acid; hyperoside; kaempferol-3--rutinoside; astragalin; tiliroside; quercetin; kaempferol

R284.1

A

0253 - 2670(2023)15 - 4789 - 15

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.15.004

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81803794）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)“5151遠(yuǎn)志人才工程”（112123A12201/001/004/019）

沈 瑤（2001—），在讀本科生，中藥學(xué)專業(yè)。Tel: 15857227126 E-mail: shenyao0923@163.com

通信作者：吳建軍，博士，副教授，從事中藥化學(xué)方向的研究。Tel: (0571)61768150 E-mail: wjjpharmacy@zcmu.edu.cn

李榮勝，碩士，工程師，從事藥物分析及藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。Tel: (021)20256526 E-mail: rongsheng.li@shhhzy.com

2023-01-17

[責(zé)任編輯 王文倩]