王廣玲,幸凡,周雪念,熊依寧

(1江西省人民醫(yī)院臨床營養(yǎng)科,南昌 330006;2宜春市袁州區(qū)婦幼保健院保健科,江西 宜春 336000)

隨著我國老年人口的增加,與老年相關的疾病不斷攀升,嚴重危害著老年人的身心健康。隨著年齡增長,骨骼肌衰老,骨骼肌出現(xiàn)進行性的質量和力量丟失,導致肢體殘疾,生活質量減低甚至死亡,給社會和家庭帶來巨大的經(jīng)濟壓力和精神壓力[1]。1998年Rosenberg[2]首次將骨骼肌隨年齡增長進行性衰老現(xiàn)象診斷為肌肉衰減綜合征。目前肌肉衰減綜合征的臨床治療以運動、營養(yǎng)、藥物治療為主,實際上大部分患者并未獲益,且藥物(睪酮、雌激素、生長激素)因其較大的副作用,在臨床上的應用受到限制[3]。因此對于肌肉衰減綜合征的治療及干預亟需安全有效的措施。

多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是人體所必需的脂肪酸,其中omega-3多不飽和脂肪酸(omega-3 polyunsaturated fatty acids,n-3PUFAs)在海洋魚類及某些堅果中含量較為豐富,能夠發(fā)揮抗腫瘤、抗炎、抗衰老等作用[4,5]。有流行病學研究證實人類通過攝入富含 n-3PUFAs的飲食方式能夠有效降低神經(jīng)系統(tǒng)、心血管疾病及免疫性疾病的風險[6]。有研究報道老年脂肪酸氧化能力下降,可能是導致年齡相關的肌肉衰減、脂肪堆積的重要原因之一[7]。n-3PUFAs防治衰老相關慢性病的研究成果,提示n-3 PUFAs可能成為新型延緩衰老的功能因子[8]。但是現(xiàn)有研究大多基于流行病學層面,n-3PUFAs衰老過程中其抗骨骼肌減少的作用機制未見文獻報道。本研究探討n-3PUFAs對骨骼肌生物效應的影響及其相關機制,旨在為骨骼肌的抗衰老策略提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30只22～24月齡老年雄性Wistar大鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,所有大鼠在同樣環(huán)境下飼養(yǎng),自然照明周期,清潔級飼養(yǎng),動物房溫度(22±1)℃,動物飼料為無特定病原體級大鼠維持飼料。

1.2 主要試劑

D-半乳糖(D-galactose)購自MedChemExpress(MCE)公司;蛋白質裂解緩沖液(protein lysis buffer,RIPA)、蛋白酶抑制劑(protease inhibitor,PMSF)購自北京索萊寶科技有限公司;封閉用脫脂奶粉購自賽默飛公司;增強化學發(fā)光試劑盒(enhanced chemiluminescent,ECL)、聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDE)購自碧云天生物有限公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑盒(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、抗體稀釋液、電轉及電泳緩沖液購于博士德生物工程有限公司;鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶2(calcium/calmodulin-dependent protein kinase 2,CAMKK2)(ab96531)、腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)(ab80039)、磷酸化-腺甘酸活化蛋白激酶(p-adenosine monophosphate activated protein kinase,p-AMPK)(ab194920)、一抗及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)購自艾博抗公司。

1.3 方法

1.3.1 動物模型建立及分組 將大鼠隨機分為3組:空白組、模型組和n-3PUFAs組,每組10只。模型組和n-3PUFAs組行腹部皮下注射5% D-半乳糖(125mg/kg)建立骨骼肌衰老動物模型[9];空白組腹部皮下注射0.9%生理鹽水,造模給藥連續(xù)進行8周。在造模第7天開始,n-3PUFAs組連續(xù)給予n-3PUFAs 2.0mg/(g·d)飼料喂養(yǎng)7周,空白組和模型組給予等體積的米湯干預。最后一次喂養(yǎng)24h后,腹腔麻醉,將所有大鼠脫頸處死,置于冰上迅速剝離大鼠股直肌和比目魚肌,并用分析天平稱取濕重,進行相關實驗檢測。

1.3.2 大鼠肌力行為學檢測 所有大鼠適應性飼養(yǎng)1周,運用水平繩實驗檢測各組大鼠肌力行為學,首先將各組大鼠的前肢放置在水平繩讓其握住,正常情況下普通大鼠的后肢會迅速抓住水平繩并在繩上爬行。若大鼠存在肌力下降情況,則前、后肢無力抓繩,后肢抓繩上繩的時間將延長。因此,通過觀察大鼠攀爬上繩的時間可間接判斷肌肉力量的改變情況。

1.3.3 Western blot 使用RIPA裂解緩沖液提取3組大鼠股直肌中的總蛋白;采用蛋白濃度測定試劑盒(增強型)測定蛋白濃度,蛋白煮沸變性,以備后續(xù)實驗。隨后進行SDS-PAGE電泳,并將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上,5%脫脂牛奶封閉1h,用CaMKK2(ab96531)抗體(1∶5000)、AMPK(ab80039)抗體(1∶5000)、p-AMPK(ab194920)抗體(1∶2000)在4℃下過夜。次日TBS-吐溫20洗膜3次,每次10min,用二抗(1∶8000稀釋)在37℃下孵育2h。最后用增強化學發(fā)光試劑盒顯示蛋白條帶;獲得條帶后使用Image J軟件分析蛋白信號強度,計算蛋白水平。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 D-半乳糖構建衰老大鼠模型

通過計算衰老大鼠骨骼肌組織的質量來評價D-半乳糖對構建衰老大鼠模型是否建立成功。結果顯示,模型組比目魚肌質量(0.334±0.015)g顯著低于空白組(0.412±0.021),差異有統(tǒng)計學意義(P=0.015)。說明D-半乳糖誘導的衰老大鼠模型建模成功。

2.2 3組大鼠體質量監(jiān)測結果

3組大鼠經(jīng)過不同處理后,每周測定體質量并記錄。結果顯示,模型組大鼠脫毛明顯,伴有精神萎靡,活動度明顯下降,飲食一般,體質量增長速度緩慢,而n-3PUFAs組大鼠上述情況有明顯改善。實驗前,3組大鼠體質量比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);實驗結束后,3組大鼠體質量增加明顯;與空白組大鼠比較,模型組和n-3PUFAs組大鼠體質量增長較緩,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組大鼠比較,n-3PUFAs組大鼠體質量增加較大,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05;表1)。

表1 n-3PUFAs對D-半乳糖誘導的衰老大鼠體質量的影響

2.3 n-3PUFAs對D-半乳糖誘導的衰老大鼠四肢肌力的影響

空白組各月末檢測開始攀爬的所需時間接近,組內各月末間的數(shù)據(jù)比較無顯著差異。與空白組比較,造模1個月后模型組大鼠開始攀爬的時間明顯延長[(2.40±0.50)和(1.07±0.15)s],造模2個月后更為顯著[(7.33±0.76)和(1.33±0.32)s] ,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),間接反映了D半乳糖可誘導大鼠骨骼肌肌力下降。與模型組比較,n-3PUFAs組大鼠同時期開始攀爬的所需時間明顯縮短[1個月:(1.76±0.32)和(2.40±0.50)s; 2 個月:(4.07±0.61)和(7.33±0.76)s],提示n-3PUFAs干預處理后,大鼠的肌力逐漸得到恢復(圖1)。

圖1 n-3PUFAs對D-半乳糖誘導的衰老大鼠四肢肌力的影響

2.4 n-3PUFAs對D-半乳糖誘導的衰老大鼠骨骼肌形態(tài)學和衰老相關標志物的影響

3組大鼠經(jīng)過不同的處理后,通過HE染色觀察各組大鼠骨骼肌的萎縮情況,結果顯示,與空白組比較,模型組中大鼠骨骼肌細胞形狀大小不一、細胞間隙增大,骨骼肌萎縮最為嚴重,肌纖維直徑明顯縮小;而n-3PUFAs組大鼠骨骼肌細胞大小逐漸均一化、細胞間隙縮小、細胞間隙結締組織減少且排列緊密,肌纖維直徑增粗。采用Western blot 檢測衰老相關標志物p21、p16的表達水平,結果顯示,與空白組比較,模型組大鼠中p21、p16蛋白表達升高;與模型組比較,n-3PUFAs組大鼠中p21、p16蛋白表達降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01;圖2)。

圖2 n-3PUFAs對D-半乳糖誘導的衰老大鼠骨骼肌形態(tài)學和衰老相關標志物的影響

2.5 n-3PUFAs對D-半乳糖誘導的衰老大鼠骨骼肌CaMKK2及AMPK蛋白表達的影響

3組大鼠經(jīng)過不同處理后,采用Western blot 檢測CaMKK2/AMPK信號通路蛋白CaMKK2、AMPK、p-AMPK表達水平。結果顯示,與空白組比較,模型組大鼠CaMKK2、p-AMPK的相對蛋白表達明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與模型組比較,n-3PUFAs組大鼠中CaMKK2、p-AMPK相對蛋白表達明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);而AMPK在3組中的表達無顯著差異(P>0.05;圖3)。

圖3 Western blot檢測CaMKK2、AMPK及p-AMPK蛋白表達水平

3 討 論

衰老是一個與時間有關的多方面過程,其中生理完整性的逐漸喪失會導致功能障礙和生活質量下降[10]。隨著世界老齡化人口的日益加劇,如何安全有效地延緩衰老成為關注的焦點[11]。衰老的自由基學說認為自由基引起的氧化損傷是引起機體老化及多種老年病的主要因素[12]。存在于細胞膜的不飽和脂肪酸受到自由基的啟動產(chǎn)生過氧化脂質,過氧化脂質經(jīng)過分解產(chǎn)生丙二醛,通過與蛋白質、肽類或脂類聚合、交聯(lián),形成老年色素或脂褐質積累在細胞組織中,導致機體衰老[13]。已有研究報道n-3PUFAs對于心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病和癌癥等增齡性慢性病具有防治作用,提示了n-3PUFAs對健康老齡化的潛在促進作用[14]。

目前,在進行衰老和抗衰老的研究方面,動物模型的建立非常重要。D-半乳糖誘導的衰老模型因其時間短、耗時短、副作用最少及在整個實驗周期中存活率較高而最受歡迎[15]。已有研究結果報道體質量、肌肉力量及器官系數(shù)可間接反映機體的衰老程度[16]。本研究應用D-半乳糖誘導制成Wistar大鼠骨骼肌衰老模型,結果顯示,與空白組比較,模型組脫毛明顯、活動度下降、體質量減輕,開始攀爬的時間明顯延長;而與模型組比較,大鼠的體質量、肌肉力量有明顯改善。并且HE染色提示,經(jīng)過n-3PUFAs處理后大鼠骨骼肌的萎縮情況明顯改善,衰老相關標志物p21、p16蛋白表達下調,提示n-3PUFAs可降低骨骼肌衰老過程中骨骼肌損傷,能夠改善D-半乳糖誘導的大鼠骨骼肌的衰老。

關于n-3PUFAs對于骨骼肌衰老的保護作用可能涉及多種機制,但目前尚未完全闡明。多項研究證實,AMPK通路不僅處于能量代謝的樞紐,同時也參與對老化過程的調節(jié),在多種器官和組織的脂代謝中發(fā)揮非常重要的作用[17]。AMPK是一個異源三聚體蛋白,由一個催化亞基Q和兩個調節(jié)亞基8和7組成,是重要的細胞內能量狀態(tài)的傳感器之一,依賴于體內單磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)/三磷酸腺苷(adenosine triphosphqte,ATP)比例的升高發(fā)揮作用[18]。AMPK參與糖、脂、蛋白質代謝、細胞生長與凋亡、骨骼肌等多個方面的調控[19]。CaMKK2/AMPK途徑是AMPK數(shù)條通路途徑中重要的通路分支,有研究證實通過干預這條通路能夠明顯改善肝臟脂肪變性和肝損傷[20]。CaMKK2受細胞內Ca2+濃度調控,通過磷酸化激活AMPK,而AMPK的磷酸化則進一步抑制脂肪合成相關蛋白的表達,進而促進物質代謝和脂肪酸氧化[21]。在哺乳動物細胞中CaMKK2超表達能夠提高AMPK的活性;反之,藥物抑制CaMKK2或用反義RNA干擾抑制CaMKK2表達,則使AMPK的活性幾乎完全喪失[22]。研究n-3PUFAs是否通過CaMKK2/AMPK通路影響骨骼肌衰老,結果顯示,與空白組比較,模型組大鼠中CaMKK2、p-AMPK的蛋白表達明顯下調;給予n-3PUFAs處理后,CaMKK2、p-AMPK蛋白表達逐步恢復。說明在衰老過程中,大鼠骨骼肌發(fā)生了CaMKK2/AMPK信號通路的活化,引起了CaMKK2與p-AMPK表達,進而發(fā)揮了延緩骨骼肌衰老的作用。

綜上,D-半乳糖可誘導大鼠產(chǎn)生衰老模型,n-3PUFAs干預可緩解D-半乳糖誘導的大鼠骨骼肌衰老,其作用機制可能與CaMKK2/AMPK信號通路關鍵蛋白的激活有關。