徐 添,黃春華,官磊瑤,劉浪輝,黃 梅,吳國燕

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué),江西 南昌 330004;2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江西 南昌 330006)

失眠表現(xiàn)為持續(xù)入睡困難、睡眠維持困難,并伴有日間社會功能障礙,是成人常見的睡眠障礙疾病,中國成人失眠發(fā)生率在30%以上[1-3]。其發(fā)病機制復(fù)雜,近年來研究證實失眠可誘發(fā)加重神經(jīng)炎癥,損害海馬神經(jīng)元,影響認知記憶功能,長期的失眠甚至?xí)黾宇净颊J知障礙疾病的風(fēng)險[4-5]。因此,抑制神經(jīng)炎癥、保護神經(jīng)對改善失眠引起的認知記憶損害、預(yù)防認知障礙疾病具有重要意義。目前失眠的治療以認知行為療法為主,輔以藥物和物理治療等綜合干預(yù),常用藥物包括苯二氮受體激動劑或褪黑素受體激動劑[2],但這些藥物的長期使用易產(chǎn)生過度鎮(zhèn)靜、耐受性、成癮性和神經(jīng)毒性等諸多不良反應(yīng),可損害學(xué)習(xí)記憶功能[6-7]。中醫(yī)對失眠病機的認識多從“邪火亢盛,陰虧血少,神失所用”立論,認為其病理變化總屬陽盛陰衰,陰陽失交。治療常以滋陰清熱、寧心安神為主,遣方用藥多用寒涼之品,鮮有從陽虛論治者。然而中醫(yī)治療疾病的優(yōu)勢在于辨證求因、審因論治,對陰虛型失眠法當(dāng)滋陰斂陽,對陽虛型失眠則當(dāng)扶陽護陽。但就目前臨床實際來看,醫(yī)者辨治失眠,多從陰虛陽熱入手,很少有慮及陽虛者,故而治療中難免有誤。為探索改善失眠的新穎療法,結(jié)合我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥的獨特優(yōu)勢,本課題組前期采用溫陽法(四逆湯+桂甘龍牡湯)治療陽虛失眠,臨床發(fā)現(xiàn)療效顯著,但其能否介導(dǎo)抑制神經(jīng)炎癥、保護神經(jīng)從而改善睡眠和認知功能尚不明確。本實驗通過構(gòu)建氯苯丙氨酸(PCPA)誘導(dǎo)的失眠大鼠模型,旨在明確溫陽法改善睡眠和認知功能的作用機制,為失眠所致認知障礙的發(fā)病原因以及相關(guān)治療方法研究提供參考。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠12只,體重(200±20)g,6～8周齡,購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2019-0010。本實驗因受疫情影響委托福建安布瑞生物科技有限公司實驗室實施實驗方案。實驗前,大鼠飼養(yǎng)于福建安布瑞生物實驗動物中心適應(yīng)環(huán)境2周,室溫(22±2)℃,濕度(50±10)%,12 h晝夜交替,飼養(yǎng)期間可自由飲水?dāng)z食。實驗經(jīng)福建安布瑞生物實驗動物倫理委員會批準(IACVC FJABR2022041301)。

1.2實驗藥物 四逆湯+桂甘龍牡湯組成:熟附子(先煎)、干姜各10g,炙甘草20g,桂枝10g,白芍20 g,柴胡15 g,枳殼15 g,龍骨、牡蠣各30 g(先煎)。用量按《傷寒論》中桂甘龍牡湯原方用量確定,按不同動物劑量折算系數(shù)推算得出。實驗所用中藥飲片及地西泮(浙江醫(yī)藥股份有限公司,國藥準字H33020250,規(guī)格:2.5 mg/片)均購自江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。將上述中藥按照傳統(tǒng)煎法獲取湯劑,合并2次濾液,以恒溫水浴鍋濃縮成1∶1藥液,生藥濃度為1g/mL,玻璃瓶密閉盛裝,置于冰箱內(nèi)4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3主要試劑 白細胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司,批號:MM-0047R2),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司,批號:MM-0180R2),PCPA(APExBIO,批號:B5036213377BD),RIPA強裂解液(meilunbio,批號:MA0151),蛋白酶抑制劑Cocktail(meilunbio,批號:MB2678),PMSF(凱基,批號:KGP610),蛋白磷酸酶抑制劑復(fù)合物Ⅰ(100×)(meilunbio,批號:MB12707),BCA蛋白定量試劑盒(Thermo,批號:23209),SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(meilunbio,批號:MA0159),PAGE凝膠超快速制備試劑盒(meilunbio,批號:MA0382),10%預(yù)染彩虹蛋白marker(meilunbio,批號:MA0342),SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X) (碧云天,批號:P0015L),脫脂奶粉(BBI,批號:A600669-0250),PVDF膜(Millipore,批號:IPVH00010),超敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(百賽生物,批號:S6009M),十二烷基硫酸鈉(sigma,批號:151-21-3),TRIS(meilunbio,批號:77-86-1),甘氨酸(meilunbio,批號:56-40-6),HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(proteintech,批號:SA00001-1),HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) (proteintech,批號:SA00001-2),GAPDH(proteintech,批號:60004-I-Ig)。

1.4主要儀器 Morris水迷宮(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司,型號:YKT-5300),離心機(中國白洋,型號:B320A),超低溫冷凍儲存箱(中科美菱,型號:DW-HL340),微量冷凍離心機(貝克曼,型號:Microfuge-22R),熒光定量PCR儀(美國 ABI,型號:7300型),PCR儀(美國BIO-RAD,型號:PTC100),數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海邦西儀器科技有限公司,型號:HH-52),蛋白垂直電泳儀(美國BIO-RAD公司,型號:POWER PAC 200),軌道式搖床(杭州米歐儀器有限公司,型號:GS-20),化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司,型號:ChemiDoc Touch),酶標(biāo)儀(美國BIO-BAD公司,型號:680),電子分析天平(賽多利斯,型號:BS 224 S),磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器,型號:MYP13-2S)。

1.5實驗方法 將12只大鼠隨機分為空白組、模型組、溫陽組、地西泮組,每組3只。除空白組大鼠外,其他組大鼠均連續(xù)2 d腹腔注射PCPA 350 mg/kg誘導(dǎo)建立失眠模型,空白組注射等量生理鹽水,以自主活動增多提示造模成功。給藥量按成年人60 kg,大鼠用量為人的10倍換算,溫陽組給予四逆湯+桂甘龍牡湯10 g/kg灌胃,地西泮組給予地西泮1 mg/kg灌胃,模型組和空白組給予等量生理鹽水灌胃,均每天1次,連續(xù)灌胃7 d。

1.6檢測指標(biāo)及方法

1.6.1Morris水迷宮實驗 在一個高35 cm、直徑150cm的水池中裝滿水(染成白色),將一個直徑12 cm平臺淹沒在水面以下1 cm處。Morris水迷宮房間光線均勻,且四面墻壁具有明顯不同的標(biāo)記。本實驗采用3 d訓(xùn)練加1 d測試的方案。在為期3 d的訓(xùn)練中,每天進行8次測試,包括4個不同位置的隨機起點入水。在每次試驗中,若1 min內(nèi)未找到平臺,則人工引導(dǎo)至平臺停留20 s,記錄每只大鼠逃避(找到平臺)潛伏期。如果大鼠在1 min內(nèi)未能完成任務(wù),潛伏期標(biāo)記為60 s。計算每只大鼠每日(8次測試)的平均逃避潛伏期以及每日成功到達率。每只大鼠離開水池后,立即用毛巾和加熱燈擦干。經(jīng)過3 d的訓(xùn)練后,在第4天進行測試:移除平臺(其原始區(qū)域稱為平臺區(qū)域),讓大鼠自由游泳1 min,記錄目標(biāo)象限內(nèi)的游泳時間和距離、找到目標(biāo)的活動時間和距離,并計算目標(biāo)象限的游泳距離與總距離之比。

1.6.2曠場實驗 曠場測試設(shè)備為一個開放式箱體(100 cm×100 cm×50 cm),在11:00—13:00,將大鼠置入曠場,允許其自由探索5 min, 記錄其水平穿越方格數(shù)和站立次數(shù)。

1.6.3海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)與結(jié)構(gòu) 將大鼠海馬組織進行石蠟包埋、切片,放入-20℃冰箱中預(yù)冷30 min,二甲苯中脫蠟10 min,換用新鮮的二甲苯,再脫蠟10 min,無水乙醇10 min、95%乙醇5 min、90%乙醇5 min、80%乙醇5 min、70%乙醇5 min,蒸餾水10 min;蘇木素染色5 min,水洗,直至無染色液流出;再浸入PBS中返藍5 min;伊紅染色15 s,浸入95%乙醇中快速脫色3 s,再浸入無水乙醇中快速脫色2 s,水洗,直至無染色液流出;浸入無水乙醇中脫水10 min,浸入二甲苯中透明10 min,中性樹膠封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察各組海馬區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)與結(jié)構(gòu)。

1.6.4海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡情況 取海馬組織石蠟包埋切片,放入-20 ℃冰箱中預(yù)冷30 min,脫蠟,然后滴加適量的1x蛋白酶K工作液,37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min,PBS漂洗3次后按照TUNEL試劑盒說明書進行操作。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。綠色熒光為凋亡細胞,Dapi染色的細胞核呈藍色。

1.6.5血清IL-1β、TNF-α水平 取大鼠血清,采用ELISA試劑盒檢測IL-1β、TNF-α水平。

1.6.6海馬組織中Caspase-3和Bcl-2 mRNA表達情況 采用qRT-PCR法檢測:取海馬組織細胞,加入1mL的RNAiso Plus裂解細胞并滅火RNA酶,分離核酸蛋白復(fù)合物,轉(zhuǎn)移至EP管中離心后加入20 μL的DEPC水,充分溶解離心管底部的RNA,使用RNA定量儀測定RNA濃度及純度,按照下列反轉(zhuǎn)錄體系及反應(yīng)條件進行反轉(zhuǎn)錄。去基因組DNA反應(yīng):模板RNA(1 μg),gDNA Purge 1 μL,gNase Free Water至10 μL,42 ℃孵育5 min,反應(yīng)結(jié)束后冰上放置;反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):第一步反應(yīng)液 10 μL,2×NovoScript?Plus 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix 10 μL,50 ℃孵育15 min,75 ℃孵育5 min,終止反應(yīng),產(chǎn)物貯存于-20 ℃;PCR反應(yīng)體系共20 μL,反應(yīng)條件:95 ℃ 1 min;95 ℃ 20 s,56 ℃ 20 s,40個循環(huán);72 ℃ 38 s,95 ℃ 15 s;60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s。Caspase-3、Bcl-2及GAPDH基因序列見表1。采用2-ΔΔCT方法進行基因表達分析(相對定量)。

表1 Caspase-3、Bcl-2及GAPDH 引物序列

1.6.7海馬組織中Caspase-3和Bcl-2蛋白表達情況 稱取海馬組織50 mg,加預(yù)冷的蛋白裂解液,置冰上充分研磨,4 ℃下12 000 r/min離心30 min,取上清液,按BCA蛋白質(zhì)試劑盒檢測各組蛋白量。用Western blot法檢測各組大鼠海馬組織中Caspase-3和Bcl-2蛋白表達量,每孔上樣量為50 μg,進行12% SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜,室溫封閉1 h,加入一抗?jié)舛确謩e為1∶300和1∶200,置4 ℃過夜,洗膜,加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG作用2 h,ECL顯色,用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值,內(nèi)參為β-actin。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析,數(shù)據(jù)繪圖采用GraphPad Prism 9.3.0軟件。各組間計量資料比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠水迷宮實驗結(jié)果比較 模型組大鼠目標(biāo)象限時間、目標(biāo)象限的游泳距離、距離比均明顯短于空白組(P均<0.05),找到目標(biāo)的活動時間和距離均明顯長于空白組(P均<0.05)。溫陽組和地西泮組大鼠目標(biāo)象限時間、目標(biāo)象限的游泳距離、距離比均明顯長于模型組(P均<0.05),找到目標(biāo)的活動時間和距離均明顯短于模型組(P均<0.05),且溫陽組各指標(biāo)變化較地西泮組更加顯著(P均<0.05)。見圖1及圖2。

圖1 空白組和失眠各組大鼠水迷宮平臺實驗結(jié)果

圖2 空白組和失眠各組大鼠水迷宮記憶實驗結(jié)果

2.2各組大鼠曠場實驗結(jié)果比較 模型組大鼠的水平穿越方格數(shù)和站立次數(shù)均明顯多于空白組(P均<0.05);溫陽組大鼠的水平穿越方格數(shù)和站立次數(shù)均明顯少于模型組(P均<0.05);地西泮組大鼠的水平穿越方格數(shù)與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),站立次數(shù)明顯少于模型組(P<0.05);溫陽組大鼠的水平穿越方格數(shù)和站立次數(shù)與地西泮組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖3。

圖3 空白組和失眠各組大鼠曠場實驗結(jié)果

2.3各組大鼠海馬組織HE染色表現(xiàn) 與空白組比較,模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)與結(jié)構(gòu)損傷比較嚴重,細胞層次變少,排列比較紊亂,分布不均勻,細胞間隙增大,存活細胞數(shù)目減少,細胞體皺縮變小,胞核固縮而深染,形狀不規(guī)則;與模型組比較,溫陽組和地西泮組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和結(jié)構(gòu)損害相對減輕,細胞排列稍紊亂,層次增多,存活細胞數(shù)目增多,有少量細胞皺縮。見圖4。

圖4 空白組和失眠各組大鼠海馬組織HE染色表現(xiàn)(×200)

2.4各組大鼠海馬組織TUNEL染色表現(xiàn) 4組大鼠海馬組織中細胞凋亡情況無明顯差異。見圖5。

圖5 空白組和失眠各組大鼠海馬組織TUNEL染色表現(xiàn)(×200)

2.5各組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平比較 模型組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平均明顯高于空白組(P均<0.05)。溫陽組和地西泮組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平均明顯低于模型組(P均<0.05),溫陽組血清IL-1β和TNF-α水平與地西泮組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖6。

2.6各組大鼠海馬組織中Caspase-3及Bcl-2 mRNA相對表達量比較 與空白組比較,模型組大鼠海馬組織中Caspase-3 mRNA相對表達量明顯升高(P<0.05),海馬組織中Bcl-2 mRNA相對表達量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,溫陽組和地西泮組大鼠海馬組織中Caspase-3 mRNA相對表達量均明顯降低(P均<0.05),海馬組織中Bcl-2 mRNA相對表達量均明顯升高(P均<0.05);溫陽組大鼠海馬組織中Caspase-3 mRNA相對表達量與地西泮組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,海馬組織中Bcl-2 mRNA相對表達量明顯高于地西泮組(P<0.05)。見圖7。

圖7 空白組和失眠各組大鼠海馬組織中Caspase-3及Bcl-2mRNA表達情況

2.7各組大鼠海馬組織中Caspase-3及Bcl-2蛋白表達情況 與空白組比較,模型組大鼠海馬組織中Caspase-3 蛋白相對表達量明顯升高(P<0.05),海馬組織中Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低(P<0.05);與模型組比較,溫陽組和地西泮組大鼠海馬組織中Caspase-3蛋白相對表達量均明顯降低(P均<0.05),海馬組織中Bcl-2蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05);溫陽組大鼠海馬組織中Caspase-3 和Bcl-2 蛋白相對表達量與地西泮組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖8。

圖8 空白組和失眠各組大鼠海馬組織中Caspase-3及Bcl-2蛋白表達情況

3 討 論

神經(jīng)炎癥相關(guān)的神經(jīng)元凋亡是失眠的重要中樞機制之一。近年來抗失眠藥物的探索逐漸突出對神經(jīng)元保護和抗凋亡作用的研究[8-9],多項實驗研究發(fā)現(xiàn),睡眠剝奪后老鼠血清、脾臟、肝臟中促炎性因子IL-1β、TNF-α表達明顯升高,且海馬神經(jīng)元損傷程度與其表達量存在明顯的相關(guān)性[10-12]。Zhang等[13]研究顯示,大腦中的藍斑神經(jīng)元(LCns)在失眠中存在線粒體壓力,可導(dǎo)致煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙?；?Sirtuin- 3(SirT3) 活性降低,凋亡水平增加,最終導(dǎo)致LCns的退化。此外,神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)是造成神經(jīng)元凋亡的直接誘因,持續(xù)神經(jīng)炎性反應(yīng)可誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡,造成諸多中樞損傷[14]。另外長時間的睡眠剝奪會導(dǎo)致動物海馬組織結(jié)構(gòu)的改變,增加細胞凋亡。Caspase-3是Caspase蛋白激酶家族中介導(dǎo)細胞凋亡的核心蛋白酶,對于細胞凋亡起決定性的調(diào)控作用[15-16]。Bcl-2對神經(jīng)元具有保護作用,其作用類似于神經(jīng)營養(yǎng)因子,能抑制凋亡蛋白活性,減少神經(jīng)元的凋亡[17]。有理由推測,異常增高的炎性反應(yīng)和伴隨的神經(jīng)元凋亡,可能構(gòu)成了失眠的關(guān)鍵中樞機制。

本實驗結(jié)果顯示,與正常大鼠相比,造模后的失眠大鼠運動能力、認知能力及記憶能力均有所下降,對新環(huán)境的探究行為、焦慮和緊張度較高,海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)與結(jié)構(gòu)損傷較為嚴重,血清IL-1β和TNF-α水平明顯升高,Caspase-3 mRNA及蛋白表達量明顯升高,Bcl-2 mRNA及蛋白表達量明顯降低。表明失眠大鼠海馬神經(jīng)炎癥反應(yīng)加重,誘導(dǎo)了神經(jīng)元的凋亡。

有研究表明大部分就診的認知障礙患者合并睡眠障礙,睡眠障礙的個體患認知障礙的風(fēng)險更高[18]。然而目前睡眠障礙與認知障礙的直接因果關(guān)系沒有具體的數(shù)據(jù)描述,認為睡眠障礙可能作為惡性循環(huán)的一部分參與到阿爾茨海默病(AD)的病理機制中[4,19]。一項薈萃分析顯示,與無睡眠障礙者相比,有睡眠障礙的受試者發(fā)生AD的風(fēng)險更高[20],且整體睡眠障礙及其亞型(如失眠、睡眠呼吸障礙)和其他睡眠問題(如日間過度嗜睡、睡眠相關(guān)運動障礙、晝夜節(jié)律睡眠障礙和非特異性睡眠問題)可以增加全因癡呆、AD、血管性癡呆(VD)的發(fā)病風(fēng)險[21]。腦脊液tau和Aβ水平被認為是AD神經(jīng)變性最敏感、最特異性的生物標(biāo)志物。在一項回顧性觀察研究中,發(fā)現(xiàn)認知障礙患者的腦脊液t-tau/Aβ比值高,且與睡眠障礙有關(guān)[22]。因此,正常人群發(fā)生睡眠障礙通過改善睡眠可以延緩認知功能下降,同時也可通過改善睡眠達到改善認知功能的目的。本研究采用四逆湯+桂甘龍牡湯進行干預(yù),方中熟附子味辛甘性熱有毒,歸心脾腎經(jīng),能助少陰之火;干姜味辛性熱,守而不走,固守中土,運轉(zhuǎn)樞機;炙甘草一者助干姜以建中陽,一者性味甘緩,可制附子之峻猛。諸藥合用,補益水中之火,健運中部之樞紐,樞機運轉(zhuǎn),氣機升降有序,心腎交通,生生不息,回歸身體“和”之道。正如近代名醫(yī)章次公謂“失眠患者,單純應(yīng)用養(yǎng)陰、安神、鎮(zhèn)靜藥物效果不佳時,適當(dāng)加入桂、附一類興奮藥時,每收佳效”。又《傷寒論·辨太陽病脈證并治》云:“火逆下之,因燒針煩躁者,桂枝甘草龍骨牡蠣湯主之?！碧崾竟鹬Ω什菪粮驶?以助心陽,心陽得復(fù),而得安寧。龍骨、牡蠣重鎮(zhèn)潛降以導(dǎo)龍入海,寧心安神。該方具有調(diào)和營衛(wèi)、和陰益陽、潛鎮(zhèn)攝納之功,用以治療失眠癥能起到調(diào)節(jié)陰陽、安神定志的作用。因此,兩方合用,共奏扶陽抑陰、運轉(zhuǎn)樞機、引導(dǎo)氣機升降之功。

本實驗結(jié)果顯示,溫陽組大鼠運動能力、認知能力及記憶能力均明顯改善,在一定程度上緊張焦慮的情緒得到緩解;海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和結(jié)構(gòu)損害相對減輕,細胞排列稍紊亂,層次增多,存活細胞數(shù)目增多,有少量細胞皺縮;血清IL-1β和TNF-α水平均明顯降低,Caspase-3 mRNA及蛋白表達量明顯降低,Bcl-2 mRNA及蛋白表達量明顯升高。表明以四逆湯+桂甘龍牡湯為基礎(chǔ)方的溫陽法能有效抑制神經(jīng)炎癥,減輕失眠引起的海馬神經(jīng)元損傷和凋亡,改善認知記憶功能。

綜上所述,以四逆湯+桂甘龍牡湯為基礎(chǔ)方的溫陽法可明顯改善PCPA致失眠大鼠的睡眠障礙和認知記憶功能,機制可能與抑制神經(jīng)炎性、減輕失眠引起的海馬神經(jīng)元損傷和凋亡相關(guān)。本研究結(jié)果為溫陽法防治失眠和認知記憶損害提供了一定科學(xué)依據(jù),但缺乏不同劑量中藥組的對比研究,有待進一步完善。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。