鐵明慧 陳 斌 龐永誠(chéng) 李巽華 劉 明 陳維軍

(云南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,云南 昆明 650500)

膿毒癥是由細(xì)菌等病原微生物侵入機(jī)體引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征,嚴(yán)重者可出現(xiàn)器官功能及循環(huán)障礙[1]。研究表明,炎性反應(yīng)及治療干預(yù)措施(如抗生素、質(zhì)子泵抑制劑、腸外營(yíng)養(yǎng)等)等可引起腸道微生態(tài)環(huán)境發(fā)生劇烈變化,導(dǎo)致正常的腸道微生物組成結(jié)構(gòu)和功能喪失,細(xì)菌腸道易位和毒力基因轉(zhuǎn)化,是膿毒癥器官功能障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2-3],并有越來越多的實(shí)驗(yàn)及臨床研究結(jié)果顯示,通過改善腸道微生物組成結(jié)構(gòu)可減輕膿毒癥炎性反應(yīng),提高患者生存率[4-5]。菌黃保腸合劑是我院重癥團(tuán)隊(duì)20世紀(jì)80年代研制而成的醫(yī)院特色制劑,具有健脾益氣生津、清熱利濕行氣的功效,前期的臨床及藥理研究已證實(shí)菌黃保腸合劑具有治療腸道感染,促進(jìn)腸道免疫及生物屏障修復(fù)的作用[6-7]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討菌黃保腸合劑對(duì)膿毒癥模型大鼠腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)作用,以期闡明菌黃保腸合劑在膿毒癥治療中的作用機(jī)制及實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體(SPF)級(jí)雄性SD大鼠80只,10周齡,體質(zhì)量275～315 g,經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,合格證號(hào)：SYXK(湘)2016-0002,飼養(yǎng)在云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證號(hào)：SYXK(滇)2017-005,本實(shí)驗(yàn)獲得云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),批準(zhǔn)編號(hào)：R-06201903。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 菌黃保腸合劑(主要由黃芪、太子參、茯苓、白術(shù)、酒炒黃連、薏苡仁、神曲、茵陳、石菖蒲等組成,云南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科輔助加工制作,滇藥制字[Z]20082615A);雙歧桿菌活菌膠囊(麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠,批號(hào)2018020488-1);鹽酸頭孢噻呋鈉注射液(江西正和生物科技有限公司,批號(hào)20180802)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

1.3.1 實(shí)驗(yàn)試劑 細(xì)菌基因組總DNA抽提試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司,貨號(hào)12888);腸道微生物樣本核酸純化試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司,貨號(hào)51531);聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)用DNA聚合酶(日本TaKaRa公司,貨號(hào)R060B);定量DNA濃度檢測(cè)的熒光試劑(美國(guó)Thermo公司,貨號(hào)Q32854)。

1.3.2 主要儀器 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)儀(美國(guó) Bio-Rad公司,型號(hào)580BR10905);核酸電泳儀(上海天能科技有限公司,型號(hào)HE-120);凝膠成像儀(上海天能科技有限公司,型號(hào)2500);QubitTMFlex熒光計(jì)(美國(guó)Thermo公司);高通量核酸純化工作站(德國(guó)QIAGEN公司,型號(hào)SN002358);Agilent 2100生物芯片分析系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組與模型制備 造模前禁食不禁水24 h,稱質(zhì)量后運(yùn)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行完全隨機(jī)化分成4組：假手術(shù)組、模型組、菌黃保腸合劑組及雙歧桿菌組,每組各20只。采用盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)法制備大鼠膿毒癥模型[8]。以2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠,麻醉滿意后大鼠無翻正反射,用碘伏常規(guī)消毒腹部區(qū)域,鋪無菌洞巾,用手術(shù)刀沿腹正中線作一長(zhǎng)約3～4 cm縱行切口,逐層分離肌肉、筋膜、腹膜,無菌鑷探查并仔細(xì)分離盲腸。將分離的盲腸置于0.9%氯化鈉注射液濕潤(rùn)的紗布上,在盲腸全長(zhǎng)1/2處用4號(hào)線結(jié)扎,然后用20 G套管針將盲腸貫通穿孔2次,避免損傷腸系膜及盲腸血管,擠出少許糞便并確保針孔通暢,將盲腸回納腹腔,簡(jiǎn)單縫合關(guān)腹后使用金屬夾臨時(shí)夾閉皮膚。其中假手術(shù)組僅分離并拖出暴露盲腸后直接回納腹腔,不進(jìn)行結(jié)扎及穿刺操作。術(shù)后各組大鼠皮下注射預(yù)熱的0.9%氯化鈉注射液50 mL/kg補(bǔ)充手術(shù)中丟失的體液,并將其置于保溫墊上直至麻醉蘇醒后送回飼養(yǎng)室正常飼養(yǎng)。于CLP術(shù)后24 h時(shí)重新開腹,仔細(xì)切除壞死的盲腸,用60 mL預(yù)熱的0.9%氯化鈉注射液沖洗腹腔后逐層縫合,同時(shí)連續(xù)3天皮下注射鹽酸頭孢噻呋鈉抗感染治療,劑量為5 mg/(kg·d)。

1.4.2 動(dòng)物給藥 CLP術(shù)后48 h對(duì)各組大鼠開始給藥處理,參照藥理試驗(yàn)中大鼠與人體間的等效劑量換算[9],菌黃保腸合劑組按4.0 g/(kg·d)(成人等效劑量2倍)予菌黃保腸合劑灌胃,雙歧桿菌組按0.1 g/(kg·d)予雙歧桿菌活菌膠囊灌胃,假手術(shù)組和模型組予3 mL純凈水灌胃,各組均連續(xù)灌胃7天。灌胃結(jié)束后處死大鼠,采集的大鼠腸內(nèi)容物(空腸上段、回腸下段)樣本,備用。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 腸道內(nèi)容物細(xì)菌DNA提取 采集大鼠腸內(nèi)容物新鮮樣本后立即放入液氮中,2 h后儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱。使用細(xì)菌基因組總DNA抽提試劑盒對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取,之后利用瓊脂糖凝膠電泳和熒光計(jì)測(cè)定樣本DNA濃度。

1.5.2 DNA文庫(kù)構(gòu)建及高通量測(cè)序 采用細(xì)菌16S V4(引物343F-798R)特異引物對(duì)DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物經(jīng)純化后構(gòu)建文庫(kù)。使用Agilent 2100生物芯片分析系統(tǒng)測(cè)定文庫(kù)平均分子長(zhǎng)度及濃度,并通過Real-time PCR對(duì)文庫(kù)進(jìn)行量化。采用Illumina HiSeq 2500平臺(tái)對(duì)合格文庫(kù)進(jìn)行Paired-end測(cè)序生成原始雙端序列,測(cè)序類型為PE250。

1.5.3 生物信息學(xué)分析 使用Trimmomatic 軟件對(duì)原始雙端序列進(jìn)行去雜;使用Vsearch軟件聚類得到OTUs的代表序列;使用QIIME軟件將代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋[10];物種比對(duì)注釋采用RDP分類算法[11]對(duì)代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),進(jìn)行物種注釋,得到相應(yīng)的物種信息和基于物種豐度的分布情況。計(jì)算細(xì)菌群落在門分類學(xué)相對(duì)豐度、Alpha多樣性指數(shù),分析beta多樣性,使用R軟件繪制出主坐標(biāo)成分分析圖(PCoA),并采用在線分析程序LEfSe尋找組間在豐度上有顯著差異的物種[12]。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠7天生存率 除假手術(shù)組外,其余各組大鼠于CLP術(shù)后48 h開始陸續(xù)死亡,最后假手術(shù)組20只大鼠均存活,模型組11只大鼠存活,存活率55%,菌黃保腸合劑組14只大鼠存活,存活率70%,雙歧桿菌組13只大鼠存活,存活率65%。與假手術(shù)組比較,模型組、菌黃保腸合劑組、雙歧桿菌組大鼠存活率顯著降低,比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組、菌黃保腸合劑組、雙歧桿菌組3組大鼠存活率組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠術(shù)后7天生存率情況(n=20)

2.2 各組大鼠腸道細(xì)菌群落在門分類學(xué)水平上相對(duì)豐度比較 進(jìn)行物種注釋后,假手術(shù)組大鼠通過高通量測(cè)序總共檢測(cè)到了14個(gè)門166個(gè)屬的細(xì)菌,門水平相對(duì)豐度排在前4位的依次為：厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門、放線菌門,它們構(gòu)成了約99%的序列。模型組、菌黃保腸合劑組及雙歧桿菌組大鼠均以厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門、放線菌門為優(yōu)勢(shì)菌門,但各組組間主要菌門的相對(duì)豐度構(gòu)成比明顯不同。與假手術(shù)組比較,模型組擬桿菌門、變形桿菌門相對(duì)豐度明顯上調(diào),厚壁菌門、放線菌門相對(duì)豐度明顯下調(diào),比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明膿毒癥造模后腸道微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變。與模型組比較,菌黃保腸合劑組厚壁菌門相對(duì)豐度明顯上調(diào),擬桿菌門、變形桿菌門相對(duì)豐度明顯下調(diào),雙歧桿菌組僅變形桿菌門相對(duì)豐度明顯下調(diào),比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與雙歧桿菌組比較,菌黃保腸合劑組擬桿菌門相對(duì)豐度明顯下調(diào),比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腸道細(xì)菌群落在門分類學(xué)水平上相對(duì)豐度比較

2.3 各組大鼠腸道微生態(tài)alpha多樣性分析 利用Chao1和PD_whole_tree指數(shù)評(píng)估alpha多樣性的參數(shù),鑒于alpha多樣性數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布,采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。結(jié)果顯示,各組組間Chao1和PD_whole_tree指數(shù)alpha多樣性差異明顯。與假手術(shù)組比較,模型組Chao1指數(shù)和PD_whole_tree指數(shù)均有下降,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,菌黃保腸合劑組及雙歧桿菌組Chao1指數(shù)和PD_whole_tree指數(shù)上升,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 )。菌黃保腸合劑組與雙歧桿菌組Chao1指數(shù)和PD_whole_tree指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05 )。見表2。

表2 各組大鼠腸道微生態(tài)alpha多樣性分析 M(P25,P75)

2.4 各組大鼠腸道微生態(tài)beta多樣性分析 將去除嵌合體的序列標(biāo)準(zhǔn)化1800條,隨機(jī)抽樣處理,以Unweighted Unifrac距離進(jìn)行RDP分類算法與Silva(version123 )數(shù)據(jù)庫(kù)比較,得到組間腸道菌群物種組成差異,采用PCoA展示各樣品差異性。結(jié)果顯示,假手術(shù)組、模型組、菌黃保腸合劑組及雙歧桿菌組大鼠腸道菌群差異通過PCoA分析進(jìn)行歸類,假手術(shù)組與模型組在PCoA圖上均能各自聚類未發(fā)生重疊,說明2組大鼠的腸道菌群beta多樣性具有差異。而菌黃保腸合劑組和雙歧桿菌組的腸道菌群菌落分布距離部分重疊,說明菌黃保腸合劑組與雙歧桿菌組beta多樣性差異相對(duì)較小。見圖2。

圖2 各組大鼠腸道微生態(tài)beta多樣性分析

2.5 各組大鼠腸道菌群特定菌屬的差異分析 使用 LEfSe 軟件分析各組之間腸道菌群特定菌屬的差異。將LDA值(LDA)設(shè)為2.0,大于設(shè)定值的為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異物種,尋找細(xì)菌可能存在的生物標(biāo)志物差異。結(jié)果顯示,在屬水平分類上,假手術(shù)組中厚壁菌門下的Anaerostipes屬、Blautia屬和疣微菌門下阿克曼氏菌屬(Akkermansia)富集;模型組中變形桿菌門下的莫拉氏菌屬(Moraxella)、埃希氏菌屬(Escherichia),擬桿菌門下的Odoribacter屬,普雷沃氏菌 Ga6A1(Prevotellac-eae_Ga6A1_group )富集;菌黃保腸合劑組中厚壁菌門下的糞球菌屬(Coprococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus),毛螺菌科NK4A136(Lachnospiraceae_NK4A136_group),放線菌門下的放線菌屬(Actinomycetaceae)富集;雙歧桿菌組厚壁菌門下的乳桿菌屬(Lactobacillus)、羅斯伯里氏菌屬(Roseburia),放線菌門下的雙歧桿菌屬(Bifidobacterium),擬桿菌門下的副擬桿菌屬(Parabacteroides)富集。表明在菌屬水平上4組大鼠的腸道菌群特定菌屬具有差異。見圖3。

圖3 各組大鼠腸道菌群特定菌屬的差異分析

3 討論

膿毒癥的發(fā)病機(jī)制涉及感染、炎癥、免疫、凝血等一系列病理生理機(jī)制,建立具有膿毒癥相似病理生理機(jī)制和臨床特點(diǎn)的動(dòng)物模型是開展相關(guān)研究的前提條件。CLP模型表現(xiàn)出與人類膿毒癥發(fā)病因素、病理生理機(jī)制以及臨床癥狀的相似特點(diǎn)：宿主對(duì)嚴(yán)重感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)改變及全身器官功能障礙,而非細(xì)菌和內(nèi)毒素對(duì)機(jī)體的直接損傷[13-16]。傳統(tǒng)CLP模型具有較高的自然死亡率,動(dòng)物模型48 h死亡率達(dá)到50～70%[17]。從膿毒癥模型制備到出現(xiàn)多器官功能障礙并由此引發(fā)腸道微生態(tài)改變需要一定時(shí)間,故本研究在傳統(tǒng)CLP模型基礎(chǔ)上加入壞死盲腸切除和廣譜抗生素抗感染等操作,以建立更符合人類臨床膿毒癥致腸道菌群微生態(tài)變化過程特點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚18-20]。結(jié)果顯示,CLP術(shù)后12 h大鼠開始出現(xiàn)豎毛、活動(dòng)減少、嗜睡、蜷縮、飲食減少等表現(xiàn),術(shù)后24 h再次開腹發(fā)現(xiàn)結(jié)扎端盲腸腫脹,表面顏色紫黑,被網(wǎng)膜包裹,周圍腸管表面充血等腹腔內(nèi)感染表現(xiàn),通過控制感染治療后,模型組存活時(shí)間延長(zhǎng),病死率下降,與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致[21]。

腸道微生態(tài)由腸道、腸道上皮及黏液、腸內(nèi)容物質(zhì)以及腸道菌群構(gòu)成[22],是腸道菌群與其宿主相互作用的統(tǒng)一體。近年來越來越多的研究顯示,中醫(yī)藥與腸道微生態(tài)關(guān)系密切,兩者可互相影響,運(yùn)用益氣健脾、滲濕利水等中藥干預(yù)后可增加腸道有益菌數(shù)量,抑制病原菌生長(zhǎng),維持腸道黏膜上皮完整,提高機(jī)體免疫并減輕炎性反應(yīng)[23-25]。本研究所采用的菌黃保腸合劑是在四君子湯基礎(chǔ)上根據(jù)大量臨床試驗(yàn)研制的醫(yī)院特色制劑,該方由黃芪、太子參、茯苓、白術(shù)、酒炒黃連、薏苡仁、神曲、茵陳、石菖蒲等組成。方中黃芪溫補(bǔ)中土而強(qiáng)脾胃,行營(yíng)氣而理脾胃,健中焦而不傷陰;太子參旨在補(bǔ)益脾胃之氣而斂陰生津,與黃芪配伍,二者均入脾、肺二經(jīng),健運(yùn)中氣而益陰生津,共為君藥。白術(shù)為補(bǔ)脾胃之要藥,長(zhǎng)于補(bǔ)氣而復(fù)健運(yùn),除濕并補(bǔ)中土;薏苡仁與茯苓共用,補(bǔ)脾健中,滲濕利水,可“利小便而實(shí)大便”。三者并列為臣藥,可使君藥補(bǔ)益脾胃之功得到進(jìn)一步加強(qiáng)。黃連歸心、脾、胃經(jīng),本制劑用炒制,降低其寒性,可用于清中焦?jié)駸岫蛊⑽傅玫秸{(diào)和;茵陳善清脾胃濕熱;石菖蒲辛溫芳香,達(dá)醒脾胃、消氣滯、化濕濁之功。以上三者為伍,辛開苦降,祛除邪實(shí),標(biāo)本兼治,共為佐藥。神曲作為使藥,健脾開胃,可調(diào)理氣機(jī)而緩解食滯。諸藥配伍,可顧護(hù)脾胃,促進(jìn)脾胃之氣恢復(fù),兼以祛除邪實(shí),寒溫并施,標(biāo)本兼治,使脾胃功能得到進(jìn)一步加強(qiáng)。從現(xiàn)代藥理學(xué)的研究上看,該方不僅能夠增加人體免疫力[26-27],還兼具調(diào)節(jié)腸道菌群,促進(jìn)胃腸功能恢復(fù)的作用[28-30]。

膿毒癥可改變腸道微生態(tài)環(huán)境,引起腸道菌群由共生模式向致病模式轉(zhuǎn)變,表現(xiàn)為腸道菌群多樣性降低,厚壁菌門和擬桿菌門細(xì)菌豐度降低,而艱難梭菌、葡萄球菌屬、埃希氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬和腸球菌屬過度生長(zhǎng)[31]。本研究觀察到膿毒癥大鼠模型中厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門、放線菌門等主要菌群結(jié)構(gòu)比例改變,腸道菌群豐度和多樣性都有不同程度下降。進(jìn)一步利用LEfSe法分析假手術(shù)組與模型組細(xì)菌的群落組成時(shí),發(fā)現(xiàn)在屬的水平上,厚壁菌門Anaerostipes屬和Blautia屬、疣微菌門阿克曼氏菌屬等維持健康的菌屬在假手術(shù)組相對(duì)富集,而變形桿菌門莫拉氏菌屬、埃希氏菌屬、擬桿菌門Odoribacter屬等條件致病菌和致病菌在模型組增多,與既往文獻(xiàn)報(bào)告結(jié)果相同[32-33]。同時(shí)變形桿菌門作為細(xì)菌中最大的一個(gè)門,包括大腸桿菌、幽口螺桿菌、沙門氏菌等許多致病菌,正常人腸道內(nèi)不含或含有少量變形桿菌門細(xì)菌,而腸道中變形桿菌大量繁殖則反映腸道微生物群落結(jié)構(gòu)失穩(wěn)[34]。通過補(bǔ)充益生菌可調(diào)節(jié)腸道菌群平衡,促進(jìn)腸黏膜的微生物屏障修復(fù),阻止致病菌的入侵從而減輕腸道炎癥[35]。本研究中將雙歧桿菌活菌膠囊作為陽性對(duì)照藥對(duì)菌黃保腸合劑進(jìn)行的藥效學(xué)評(píng)價(jià),結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)、外生態(tài)多樣性影響作用相當(dāng),但菌群種屬富集方面存在差異,推測(cè)雙歧桿菌活菌膠囊作用機(jī)制為補(bǔ)充正常菌群,而菌黃保腸合劑從細(xì)菌與宿主雙方因素產(chǎn)生代謝、免疫、炎癥等多方面的作用機(jī)制選擇性刺激正常菌群生長(zhǎng)繁殖[36-37]。另有研究發(fā)現(xiàn)益生菌雙歧桿菌能夠保護(hù)宿主抵御大腸桿菌感染,但只有能產(chǎn)生醋酸鹽的雙歧桿菌可發(fā)揮這種保護(hù)作用,表明在益生菌中細(xì)菌行使的功能遠(yuǎn)重要過細(xì)菌所屬的種類[38]。因此,研究可進(jìn)一步深入,明確中藥復(fù)方在維持膿毒癥腸道穩(wěn)態(tài)的靶點(diǎn)機(jī)制。

綜上所述,膿毒癥大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)改變,菌群多樣性下調(diào),條件致病菌菌群種類增加,腸道黏膜上皮損傷,是造成膿毒癥內(nèi)源性感染和細(xì)菌易位的重要機(jī)制,菌黃保腸合劑能夠上調(diào)有益菌相對(duì)豐度,抑制條件致病菌過度生長(zhǎng),減少機(jī)會(huì)性感染,具有調(diào)節(jié)膿毒癥大鼠腸道微生態(tài)的作用。