張潔 齊紅偉 丁北川 楊新宇 任怡宣 樊瑞芳 田麗麗 李傳友 宋衛(wèi)萍

復(fù)治結(jié)核病患者的耐藥率和死亡率均高于首次結(jié)核治療患者[1],據(jù)估計(jì),復(fù)治結(jié)核病病例中的耐藥率比新發(fā)結(jié)核病例高5倍[2]。有研究表明,復(fù)治結(jié)核病患者的死亡率在4%～13%[3-4]。為實(shí)現(xiàn)世衛(wèi)組織到2030年將結(jié)核病死亡人數(shù)減少90%的結(jié)核病戰(zhàn)略目標(biāo),解決復(fù)治結(jié)核病問題至關(guān)重要。復(fù)治結(jié)核病治療指南也改為基于藥物敏感性實(shí)驗(yàn)的方案,首先需要掌握患者既往用藥史以評(píng)估患者是否耐藥,然后應(yīng)盡快得到藥敏結(jié)果從而確定治療方案。本文首先對(duì)2017年1月至 2019年12月就診于北京市各個(gè)區(qū)縣結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)的復(fù)治結(jié)核病患者的臨床分離株使用分子線性探針技術(shù)快速篩查出耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株,之后對(duì)所有菌株進(jìn)行比例法藥物敏感性實(shí)驗(yàn), 掌握其耐藥情況,從而為制定科學(xué)的診療策略提供依據(jù)。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)對(duì)象

本項(xiàng)目研究對(duì)象為2017年1月至 2019年12月本市16個(gè)區(qū)縣結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)所有復(fù)治肺結(jié)核患者的分枝桿菌陽性菌株,所有陽性菌株均在北京市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室樣本庫中冷凍保存,該研究已通過北京市疾病預(yù)防控制中心倫理委員會(huì)的審批(202208)。

對(duì)191例符合研究要求的分枝桿菌菌液使用PCR熒光探針法進(jìn)行菌群鑒定,排除57例非結(jié)核分枝桿菌,納入134例結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行研究。通過查閱相關(guān)紙質(zhì)病例及結(jié)核病監(jiān)測(cè)電子數(shù)據(jù)庫從而確定患者的復(fù)治類型(復(fù)發(fā)/非復(fù)發(fā))。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器 分子線性探針試劑由梅里埃診斷產(chǎn)品有限公司提供,核酸提取儀型號(hào)為博奧公司ExtractorTM36,結(jié)核分枝桿菌耐藥快速檢測(cè)系統(tǒng)為生物梅里埃GT-Biot48。

分枝桿菌中性羅氏培養(yǎng)基及含藥培養(yǎng)基由河南賽諾特生物技術(shù)有限公司提供,含藥培養(yǎng)基的含藥濃度分別為:異煙肼(INH)0.2μg/mL,利福平(RFP)40.0μg/mL,乙胺丁醇(EMB)2.0μg/mL,鏈霉素(SM)4.0μg/mL,左氧氟沙星(LFX)2.0μg/mL,阿米卡星(AK)30.0μg/mL,卷曲霉素(CM)40.0μg/mL,丙硫異煙胺(PTO)40.0μg/mL,對(duì)氨基水楊酸(PAS)1.0μg/mL。

2 分子線性探針?biāo)幟魧?shí)驗(yàn) 分子線探針技術(shù)是將提取的DNA用生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增和反向雜交。雜交步驟包括:擴(kuò)增產(chǎn)物的化學(xué)變性、單鏈雜交、生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與膜上的探針結(jié)合、嚴(yán)格漂洗、含有鏈霉抗生物素蛋白的堿性磷酸酶介導(dǎo)的染色反應(yīng)。按照模板對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀,當(dāng)一個(gè)基因的所有野生型探針都能被檢測(cè)到,并且在被檢測(cè)區(qū)域沒有檢測(cè)到突變時(shí),該樣本被認(rèn)為對(duì)相應(yīng)的抗生素敏感;如果發(fā)生突變,各自的擴(kuò)增產(chǎn)物不能結(jié)合到相應(yīng)的野生型探針,那么至少有一個(gè)野生型條帶缺失,或者出現(xiàn)了突變條帶,則該樣本被認(rèn)為是耐藥的。

3 比例法藥敏實(shí)驗(yàn) 按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》的標(biāo)準(zhǔn)操作程序?qū)Y(jié)核分枝桿菌進(jìn)行比例法藥敏實(shí)驗(yàn)。含藥培養(yǎng)基上菌落的生長(zhǎng)數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上菌落的生長(zhǎng)數(shù)的比值為耐藥百分比,若耐藥百分比大于1%,判斷該菌株對(duì)該藥耐藥,反之則判斷為敏感。

三、相關(guān)定義

按照《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南(2008年版)》復(fù)治結(jié)核病包括:(1)不合理或不規(guī)律使用抗結(jié)核藥物≥1個(gè)月的患者。(2)復(fù)發(fā)結(jié)核病患者。(3)初治失敗、死亡、轉(zhuǎn)移的結(jié)核病患者。

結(jié)核病復(fù)發(fā)是指過去有明確的結(jié)核病史,完成規(guī)定的化療療程后認(rèn)為已治愈,之后檢查又出現(xiàn)結(jié)核菌陽性的肺結(jié)核患者。

多耐藥結(jié)核病(Poly-resistant tuberculosis,PR-TB ):對(duì)1種以上一線抗結(jié)核藥物產(chǎn)生耐藥(不包括同時(shí)對(duì)異煙肼和利福平耐藥)。

利福平耐藥(Rifampicin-resistant tuberculosis,RR-TB):對(duì)利福平產(chǎn)生耐藥。

耐多藥結(jié)核病(Multidrug-resisitant tuberculosis,MDR-TB ):至少同時(shí)對(duì)異煙肼和利福平產(chǎn)生耐藥。

準(zhǔn)廣泛耐藥結(jié)核病 (Pre-XDR-TB) 由符合 MDR/RR-TB 定義、同時(shí)對(duì)任意氟喹諾酮類藥物耐藥的結(jié)核分枝桿菌菌株引起的結(jié)核病。

廣泛耐藥結(jié)核病 (Extensively drug-resistant tuberculosis,XDR-TB) 由符合MDR/RR-TB 定義、同時(shí)對(duì)任意氟喹諾酮類藥物以及至少一種其他的A組藥物耐藥的結(jié)核分枝桿菌菌株引起的結(jié)核病。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Excel 2010軟件收集記錄數(shù)據(jù)資料,應(yīng)用 SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)來比較組間差異,P<0.05 即差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、分子藥敏結(jié)果

分子線性探針技術(shù)檢測(cè)134例結(jié)核分枝桿菌菌株中,76例對(duì)INH和RFP均敏感,單耐RFP 14例,單耐INH 4例,40例為MDR,MDR率為29.9%(40/134),95%CI(0.220～0.377)。

54 例RFP耐藥的菌株中,63.0%(34/54)在rpoB基因的S531L位點(diǎn)發(fā)生了突變,探針試紙條上顯示為野生條帶 WT8 缺失,突變條帶MUT3出現(xiàn)。1例菌株在rpoB基因D516V 位點(diǎn)發(fā)生突變,7例菌株在H526D位點(diǎn)發(fā)生突變。11例雖然野生條帶缺失但沒有相應(yīng)的突變條帶出現(xiàn)的菌株被認(rèn)為含有不確定或未知的突變。1例菌株表現(xiàn)為異質(zhì)性耐藥突變模式,其探針試紙條上能觀察到所有的野生型條帶,但是一個(gè)突變條帶MUT1也出現(xiàn)了(圖1)。

圖1 異質(zhì)性耐藥條帶注:樣本rpoB基因的野生型條帶WT1～WT8均顯色的同時(shí)突變條帶 MUT1也顯色,提示異質(zhì)性耐藥

44例 INH 耐藥的菌株中,70.5%( 31/44)在katG基因 S315T1 位點(diǎn)發(fā)生了突變;22.7%(10/44)在inhA基因C15T位點(diǎn)發(fā)生突變。3例katG基因突變的菌株結(jié)果顯示野生型條帶缺失但沒有相應(yīng)的突變條帶出現(xiàn),表明有些未知的突變沒有被檢測(cè)到(表1)。

表1 分子檢測(cè)基因突變位點(diǎn)構(gòu)成

二、不同復(fù)治類型患者的臨床特征比較

134例復(fù)治結(jié)核病患者中,58.2%(78/134)為復(fù)發(fā)患者,其他類型復(fù)治病例(非復(fù)發(fā)) 56例,占41.8%,按性別、年齡及地區(qū)不同進(jìn)行統(tǒng)計(jì),復(fù)發(fā)與非復(fù)發(fā)患者無明顯差異(P>0.05),復(fù)發(fā)和非復(fù)發(fā)患者對(duì)INH 和RFP的耐藥率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),非復(fù)發(fā)患者的耐多藥率高于復(fù)發(fā)患者(39.3%vs23.1%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.090,P<0.05)。

表2 不同復(fù)治類型患者的臨床特征比較[n(%)]

三、復(fù)治患者臨床分離株比例法耐藥譜

對(duì)復(fù)治患者凍存的菌液傳代培養(yǎng)并進(jìn)行比例法藥物敏感性實(shí)驗(yàn),菌株未生長(zhǎng)、傳代失敗的29例,藥敏結(jié)果無法判讀的4例,最后101例菌株有完整的比例法藥敏結(jié)果,其中56例耐藥,總耐藥率55.4%(56/101)。101例菌株中復(fù)發(fā)患者菌株52例,耐藥率為57.7%(30/52);非復(fù)發(fā)患者菌株49 例,耐藥率為53.1%(26/49)。56例耐藥菌株的耐藥譜共有29種組合,其中耐多藥11種,準(zhǔn)廣泛耐藥6種,廣泛耐藥1種;單一耐藥6種;多耐藥5種。具體耐藥譜(見表 3,4)。

表3 MDR患者耐藥譜

表4 復(fù)治患者其他耐藥類型耐藥譜

討 論

大量的研究表明,復(fù)治患者的耐藥率、耐多藥率都明顯高于初治患者[5-8],北京市2009—2010年復(fù)治肺結(jié)核患者臨床分離株對(duì)一線抗結(jié)核藥的耐藥率為56.4%,耐多藥率為28.2%[9]。北京胸科醫(yī)院的一項(xiàng)研究顯示2015年該院初治肺結(jié)核患者耐藥率為25.08%,耐多藥率為7.36%;復(fù)治患者的耐藥率為78.99%,耐多藥率為57.20%[10]。北京耐藥監(jiān)測(cè)點(diǎn)的結(jié)果也顯示,復(fù)治患者的耐藥率為44.83%, 耐多藥率為34.48%[7],本次對(duì)北京市結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)復(fù)治患者的研究顯示,耐藥率為55.4%,耐多藥率為29.9%,其中,復(fù)發(fā)患者耐多藥率為23.1%,低于其他類型的復(fù)治患者。

本研究中,復(fù)發(fā)患者耐藥率為57.7%,高于上海市及寶雞市的研究報(bào)道[11-12]。結(jié)核病復(fù)發(fā)是指完成正確的療程并治愈的結(jié)核病患者體內(nèi)又出現(xiàn)了活性細(xì)菌,可能通過再感染(外源性復(fù)發(fā))或再激活(內(nèi)源性復(fù)發(fā))發(fā)生。然而,只有直接觀察給藥,才能確定患者已經(jīng)完成了所有的藥物治療。如果治療沒有得到監(jiān)督,復(fù)發(fā)的真實(shí)性就會(huì)受到質(zhì)疑。一般來說,早期復(fù)發(fā)與內(nèi)源性復(fù)燃有關(guān),在進(jìn)行正確的治療過程中,即使藥物達(dá)到了殺菌濃度,細(xì)菌芽孢也具有一定的生存能力。滯留菌不一定耐藥,但可能代謝緩慢或不規(guī)則,在免疫力低下的時(shí)候它們的代謝開始活躍并再次繁殖,導(dǎo)致了復(fù)發(fā)。因此,理論上復(fù)發(fā)患者會(huì)表現(xiàn)出與患者初治時(shí)相同的耐藥性模式,可以使用初始治療方案。如果在初次治療數(shù)年后復(fù)發(fā),再次感染的可能性比內(nèi)源性復(fù)燃的可能性大[13-14]。事實(shí)上,當(dāng)實(shí)際進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)時(shí),復(fù)發(fā)患者的耐藥性發(fā)生率與初治時(shí)候相比顯著增加。這可能是由于藥物攝入的不規(guī)律,也可能是由于單一或多重耐藥的選擇。

除復(fù)發(fā)病例外,大多數(shù)復(fù)治病例是由于之前治療方案實(shí)施或管理過程中的問題所致。其他類型的復(fù)治患者主要包括初治失敗、死亡、轉(zhuǎn)移的結(jié)核病患者以及不合理或不規(guī)律用抗結(jié)核藥物≥1個(gè)月的患者等。結(jié)核病治療失敗的原因可能是在治療的過程中,有一群具有代謝活性的菌群增殖[15],這為原始菌群中存在的自然耐藥突變菌的篩選創(chuàng)造了有利的條件,這種情況下實(shí)施藥物敏感性試驗(yàn)就對(duì)治療方案的制定非常重要。不規(guī)則用藥的現(xiàn)象在患者治療過程中非常常見,不規(guī)則用藥持續(xù)數(shù)周或數(shù)月時(shí),自然耐藥突變菌就有了發(fā)展的適宜條件。所以即便是在治療的最后幾個(gè)月,即使癥狀緩解,患者也必須繼續(xù)服藥。放棄治療的患者也分為不同的情況,一種是治療短時(shí)間內(nèi)放棄所有藥物的患者,另一種是放棄其中一種或多種藥物的患者。放棄所有藥物的患者通常不會(huì)增加耐藥的風(fēng)險(xiǎn),因?yàn)楫?dāng)患者接受治療時(shí),藥物是有效的,而且沒有有利的條件來選擇自然耐藥突變菌,當(dāng)治療中斷時(shí),整個(gè)細(xì)菌種群恢復(fù)生長(zhǎng)。因此,在這種情況下,重新采用最初的治療方案就足夠了。當(dāng)病人在接受治療時(shí)放棄其中一種或多種藥物時(shí),情況就完全不同了,這為選擇對(duì)患者繼續(xù)服用的藥物具有自發(fā)耐藥性的微生物創(chuàng)造了條件[16]。本研究共發(fā)現(xiàn)復(fù)治患者各種不同的耐藥組合29種,耐藥譜呈現(xiàn)出復(fù)雜性和多樣性。應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇合理的藥物組合,從而提高治愈率。

隨著結(jié)核分枝桿菌耐藥分子機(jī)制的闡明,快速的分子藥物敏感性試驗(yàn)在臨床上應(yīng)用越來越廣泛,本研究采用線性探針技術(shù)通過檢測(cè)rpoB基因的突變來判定對(duì)利福平的耐藥性;檢測(cè)katG基因確定對(duì)異煙肼的高水平耐藥,而檢測(cè)inhA 基因的啟動(dòng)子區(qū)確定對(duì)異煙肼的低水平耐藥,從而快速篩出MDR。結(jié)果顯示,rpoB基因的S531L突變最為常見,占63.0%,而INH耐藥最常見的突變是katG基因的S315T位點(diǎn),這與高水平的INH耐藥有關(guān)。對(duì)于僅發(fā)生inhA突變的患者來說,可選擇高劑量INH來進(jìn)行治療,而當(dāng)僅存在katG突變時(shí),可使用乙硫酰胺進(jìn)行替代治療[17]。

我們還鑒定出1例具有異質(zhì)性耐藥突變的菌株,所有的野生型條帶都沒有缺失,且出現(xiàn)了一個(gè)突變條帶。異質(zhì)性耐藥是指在同一臨床樣本中同時(shí)出現(xiàn)藥物敏感和耐藥菌株。異質(zhì)性耐藥反映了結(jié)核分枝桿菌菌群從部分耐藥向全部耐藥轉(zhuǎn)變的中間過程。異質(zhì)性耐藥對(duì)評(píng)估結(jié)核病治療方案和指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。當(dāng)耐藥菌在菌群中的比例較低時(shí),表型法藥敏結(jié)果為敏感,而針對(duì)敏感菌株的治療方案最后可能由于耐藥菌株的比例逐漸增加而治療失敗,目前對(duì)異質(zhì)性耐藥的認(rèn)識(shí)還不深入,針對(duì)異質(zhì)性耐藥是否需要采取不同的治療措施還有待討論[18]。

綜上所述,北京市結(jié)防機(jī)構(gòu)復(fù)治結(jié)核病患者耐藥率較高,特別是非復(fù)發(fā)的復(fù)治患者M(jìn)DR率需要引起重視。對(duì)于復(fù)治結(jié)核病患者如果培養(yǎng)出陽性菌株應(yīng)及時(shí)進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn),從而盡早發(fā)現(xiàn)耐藥,并以此為基礎(chǔ)制定合理有效的治療方案。