丁昱嬋，秦令祥,*，丁艷芳，高愿軍

（1.漯河食品職業(yè)學(xué)院，河南 漯河 462300；2.漯河市食品研究院有限公司，河南 漯河 462300；3.河南和生食品有限公司，河南 漯河 462300；4.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

葛根又名葛藤、粉葛藤等，為豆科植物野葛的干燥根[1-2]，素有“亞洲人參”的美譽(yù)[3]，在我國有悠久的入藥歷史[4]。葛根中含有碳水化合物、蛋白質(zhì)、膳食纖維等多種營養(yǎng)物質(zhì)，以及三萜類、黃酮類、生物堿類等生物活性物質(zhì)，此外還含有多種微量元素和氨基酸等[5-6]。黃酮類物質(zhì)達(dá)30余種，主要為葛根素、金雀異黃素、大豆苷、大豆苷元、染料木素和香豆素，其中葛根黃酮是葛根中的一種生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗氧化、改善血液循環(huán)、降血糖、降血脂和提高免疫力等多種功效[7-13]。

目前，葛根黃酮提取方法主要有：乙醇回流法[14]、復(fù)合酶法[15]、超聲輔助法[16]、微波法[17]等，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前，閃式提取法[18]是一種新型提取方法，它是利用閃提器內(nèi)刀刃間形成的超速動(dòng)態(tài)分子滲透、高剪切和強(qiáng)力攪拌振動(dòng)作用，迅速破壞植物細(xì)胞，使其細(xì)胞內(nèi)的功能成分溶出，達(dá)到高效提取功能成分的作用，具有提取時(shí)間短、效率高、能耗低等顯著特點(diǎn)[19-20]。因此，本文采用閃式提取法提取葛根黃酮，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，并對(duì)其解酒保肝作用進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

葛根：漯河張仲景大藥房；蘆丁（分析標(biāo)準(zhǔn)品，97%）：廣州分析測試中心科力技術(shù)開發(fā)公司；SPF級(jí)小鼠：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(豫）-2020-0005，證書編號(hào)為C57BL/6j，體重（20±2）g，河南斯克貝斯生物科技有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、無水磷酸氫二鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉：均為分析純；聯(lián)苯雙酯、四氯化碳：鄭州化學(xué)試劑廠；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒：上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；AB-8型大孔樹脂：天津波鴻樹脂科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Quintix 224-ICN電子分析天平，鄭州萊博儀器設(shè)備有限公司；WK-400B小型高速粉碎機(jī)，濟(jì)南博創(chuàng)制藥設(shè)備有限公司；HH-4D 型單獨(dú)控溫四孔數(shù)顯水浴鍋，DZF-6020AB 真空干燥箱，北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司；EV4000 VAC 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海常豫儀器有限公司；JHBE-50T 閃式提取器，河南智晶生物科技有限公司；UV2600 型雙光束紫外可見分光光度計(jì)，日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照趙成萍等[21]的方法，并加以改進(jìn)：準(zhǔn)確稱取0.100 0 g 蘆丁，加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶解、搖勻，并定容至1 000 mL，制成0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。取刻度為10 mL的試管6支，分別用編號(hào)1、2、3、4、5、6 標(biāo)記，然后分別加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL和10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，再加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻，靜置15 min，最后用95%的乙醇定容至10 mL。在波長510 nm 處測其吸光度，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

1.2.2 葛根黃酮的提取及其得率測定

參照龔頻等[22]的方法提取及測定葛根黃酮得率。準(zhǔn)確稱取粉碎后的葛根10 g 于錐形瓶中，以95%的乙醇作溶劑，分別在不同料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)和提取壓力的條件下進(jìn)行閃式提取。提取完成后，在5 000 r/min 的條件下離心20 min，然后取其上清液并濃縮，再用AB-8型大孔樹脂純化[23]，最后將其真空干燥即可得到葛根黃酮。并按照“1.2.1”的方法測定吸光度，葛根黃酮得率計(jì)算公式如下：

式中：V為葛根黃酮提取液的體積，mL；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得到的葛根黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；m為葛根樣品質(zhì)量，mg。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以葛根黃酮得率為考察指標(biāo)，按照“1.2.2”中的方法進(jìn)行提取，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)定固定條件：提取電壓150 V，提取時(shí)間90 s，提取次數(shù)2次，料液比1∶25（g/mL），考察不同提取電壓（120、130、140、150、160 V）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL））、提取時(shí)間（60、70、80、90、100 s）和提取次數(shù)（1、2、3、4、5 次）對(duì)葛根黃酮得率的影響，然后按“1.2.2”的方法測定并計(jì)算其得率。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上優(yōu)化提取條件，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見表1。

綜合來看，隨著網(wǎng)絡(luò)信息技術(shù)的不斷發(fā)展，線上服務(wù)和線下服務(wù)的融合兼并，基于互聯(lián)網(wǎng)構(gòu)建的交易平臺(tái)對(duì)消費(fèi)者和服務(wù)提供者具體應(yīng)該承擔(dān)的責(zé)任范圍和責(zé)任內(nèi)容還有待商榷。把包含人身從屬性質(zhì)、但又包含其自身特殊性的用工關(guān)系歸入法律范圍，并利用法律武器加以保護(hù)，這也是對(duì)現(xiàn)代法治社會(huì)、現(xiàn)代法治文明的有力體現(xiàn)。同時(shí)擴(kuò)大勞動(dòng)關(guān)系界定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其概念加以宏觀闡釋，可以使傳統(tǒng)的勞動(dòng)合同制更加適應(yīng)不斷發(fā)展演變的新時(shí)代要求。而對(duì)網(wǎng)約車平臺(tái)和駕駛員兩間的法律關(guān)系和責(zé)任的明確界定，不僅可以加強(qiáng)對(duì)駕駛員行為的監(jiān)管約束，也可以凈化服務(wù)環(huán)境，優(yōu)化服務(wù)質(zhì)量，進(jìn)一步規(guī)范網(wǎng)約車行業(yè)以良好態(tài)勢發(fā)展。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.5 模型建立的方法

將40 只SPF 級(jí)雄性小鼠，飼養(yǎng)于溫度（26±2）℃，濕度50%～60%，噪音60分貝以下，照明12 h（每日8：00開燈，20：00關(guān)燈）的動(dòng)物房內(nèi)，喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為4組，分別為：正常對(duì)照組、CCl4對(duì)照組（CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷可稱為模型組）、聯(lián)苯雙酯組(聯(lián)苯雙酯治療肝損傷，可稱為陽性對(duì)照組）、葛根黃酮提取液試驗(yàn)組，每組10只。正常對(duì)照組和CCl4對(duì)照組每天均灌胃等體積的生理鹽水。聯(lián)苯雙酯組每天灌胃200 mg/kg聯(lián)苯雙酯，葛根黃酮提取液試驗(yàn)組每天灌胃300 mg/kg葛根黃酮提取液（劑量參照《中華人民共和國藥典》[24]）。每天灌服1 次，共灌服7 d。在末次灌服2 h后，除正常對(duì)照組外，其他組均按10 mL/kg 腹腔注射0.1%的CCl4。小鼠禁食16 h后測定各指標(biāo)。

1.2.6 小鼠生化指標(biāo)的測定

末次灌服后禁食16 h，取小鼠眼球血，然后離心分離血清，離心條件為：4 ℃，4 000 r/min，20 min，然后測定血清中ALT、AST活性和MDA含量。同時(shí)，取小鼠肝組織，置于-70 ℃下，冷凍待用。按肝組織質(zhì)量∶生理鹽水體積＝1∶9（g/mL）的比例混合，制成10%肝組織勻漿。并測定肝組織中SOD 和GSH-Px 活性。血清中ALT、AST 活性和MDA 含量及肝組織中SOD和GSH-Px活性測定均按試劑盒操作說明書操作。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013 進(jìn)行整理，采用正交設(shè)計(jì)助手ⅡV3.1專業(yè)版進(jìn)行設(shè)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 閃式提取葛根黃酮的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比的確定

由圖1 可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著乙醇添加比例的增加，得率不斷升高，而超出一定范圍（料液比1∶25（g/mL））后，得率不再提高而趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)?，在一定范圍?nèi)，隨著溶劑的增加，葛根與溶劑的傳質(zhì)推動(dòng)力和接觸面積增大，促使葛根黃酮的擴(kuò)散增多，得率提高；但溶劑到達(dá)一定量后，傳質(zhì)推動(dòng)力不再增加，抑制了葛根黃酮的擴(kuò)散和溶出，得率不再提高而趨于穩(wěn)定，故選擇適宜料液比為1∶25（g/mL）。

圖1 料液比對(duì)葛根黃酮得率的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratios on extraction rates of total flavonoids from Pueraria lobata Tubers

2.1.2 提取電壓的確定

由圖2 可知，隨著提取電壓升高，得率先升高后趨于平緩。這是由于升高提取電壓，增大了閃式提取的轉(zhuǎn)速，使葛根細(xì)胞破壁增多，葛根黃酮易于溶出，得率升高。當(dāng)提取電壓≥150 V后，葛根黃酮的溶出基本完全，再增加電壓，得率也不會(huì)明顯提高而趨于穩(wěn)定，故選擇適宜提取電壓為150 V。

圖2 提取電壓對(duì)葛根黃酮得率的影響Fig.2 Effects of extraction voltages on extraction rates of total flavonoids from Pueraria lobata Tubers

2.1.3 提取時(shí)間的確定

由圖3 可知，隨著提取時(shí)間的延長，得率不斷升高，最后逐漸趨于平緩。這是因?yàn)槲锪想S著提取時(shí)間的延長受到剪切、碰撞的作用增強(qiáng)，使葛根細(xì)胞破碎的程度增強(qiáng)，葛根黃酮的溶出增多，得率增大。當(dāng)提取時(shí)間超過90 s后，葛根細(xì)胞內(nèi)外溶劑濃度達(dá)到平衡，再繼續(xù)增加提取時(shí)間，葛根黃酮溶出不再顯著變化，而趨于平緩，因此選擇適宜提取時(shí)間為90 s。

圖3 提取時(shí)間對(duì)葛根黃酮得率的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction rates of total flavonoids from Pueraria lobata Tubers

2.1.4 提取次數(shù)的確定

由圖4 可知，首次提取后，提取出的葛根黃酮并不徹底，得率僅為3.38%，經(jīng)第2 次提取，葛根黃酮得率快速增加，達(dá)到6.51%，當(dāng)超過3 次后，葛根黃酮溶出基本完全，繼續(xù)增加提取次數(shù)，黃酮得率也不再提高，故選擇適宜提取次數(shù)為2次。

圖4 提取次數(shù)對(duì)葛根黃酮得率的影響Fig.4 Effects of extraction times on extraction rates of total flavonoids from Pueraria lobata Tubers

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，方差分析見表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of orthogonal experiment

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The variance analysis results

由表2和表3分析可知，各因素的影響大小順序?yàn)椋篋＞A＞B＞C，提取次數(shù)和料液比對(duì)葛根黃酮得率的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05），其他因素的影響不顯著。經(jīng)R值分析，最佳工藝條件為：A3B3C1D2，即提取次數(shù)2 次，料液比1∶30（g/mL），提取電壓160 V，提取時(shí)間80 s。對(duì)上述最佳工藝條件進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到葛根黃酮平均得率為6.71%，高于正交試驗(yàn)中各組合，明顯高于朱德艷[14]采用乙醇回流法提取的葛根黃酮得率（1.62%），且閃式提取法時(shí)間短、溫度低，可有效降低提取成本。

2.3 葛根黃酮提取液對(duì)四氯化碳致肝損傷小鼠模型的保肝作用影響研究

2.3.1 小鼠血清中AST、ALT活性測定結(jié)果

由表4 可知，葛根黃酮提取液試驗(yàn)組的AST 和ALT 活性與CCl4模型組相比差異極顯著（P＜0.01），表明葛根黃酮提取液明顯降低了CCl4所致的小鼠血清中ALT和AST的活性，具有保肝作用。與正常對(duì)照組相比，CCl4模型組AST和ALT活性極顯著升高（P＜0.01），說明CCl4能導(dǎo)致小鼠肝損傷。與CCl4模型組相比，聯(lián)苯雙酯組AST 和ALT 活性顯著降低（P＜0.05），但沒有葛根黃酮提取液組下降得多，說明聯(lián)苯雙酯能有效治療肝損傷，但效果不如葛根黃酮提取液好。

表4 小鼠血清中AST、ALT活性測定結(jié)果Table 4 Determination results of AST and ALT activities in mice sera（n=10） 單位：U/L

2.3.2 小鼠血清中MDA 含量和肝組織中GSH-Px、SOD活性測定結(jié)果

由表5可知，CCl4模型組與正常對(duì)照組相比，小鼠血清中MDA 含量極顯著升高（P＜0.01），肝組織中GSH-Px 和SOD 活性極顯著降低（P＜0.01）。與CCl4模型組比較，聯(lián)苯雙酯組小鼠肝組織中GSH-Px 和SOD活性顯著升高（P＜0.05）；葛根黃酮提取液試驗(yàn)組小鼠血清中MDA含量顯著降低（P＜0.05），GSH-Px和SOD活性極顯著升高（P＜0.01）。表明葛根黃酮提取液能夠顯著降低CCl4所致的小鼠血清中的MDA含量，同時(shí)提高小鼠肝組織中GSH-Px和SOD活性。

表5 小鼠血清中MDA含量和肝組織中SOD、GSH-Px活性測定結(jié)果Table 5 Determination results of MDA contents in sera and SOD,GSH-Px activities in liver tissues of mice（n=10）

3 結(jié)論

本文采用閃式法提取葛根黃酮，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)正交試驗(yàn)對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝條件為：提取次數(shù)2次，料液比1∶30（g/mL），提取電壓160 V，提取時(shí)間80 s，在此條件下，葛根黃酮得率達(dá)6.71%。該方法省時(shí)、節(jié)能、高效、環(huán)保。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可知，葛根黃酮能夠降低小鼠血清中ALT、AST活性和MDA含量，提高小鼠肝組織中GSH-Px和SOD活性，表明其具有明顯的保肝作用。本試驗(yàn)可為葛根黃酮的提取及應(yīng)用研究提供參考。