潘 宇，丁一鳴，李向榮，亢柳璇，張艷艷，王晶晶,*

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院，遼寧 錦州 121000；2.遼寧智慧安鮮物聯(lián)網(wǎng)科技有限公司，遼寧 沈陽(yáng) 110000；3.遼寧通正檢測(cè)有限公司，遼寧 沈陽(yáng) 110000）

苦蕎麥（Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn）為蓼科蕎麥屬雙子葉植物，又名花角麥、三角麥等，是一種“假谷物”[1]?？嗍w麥在我國(guó)分布廣泛，其加工副產(chǎn)物蕎麥殼因富含多種營(yíng)養(yǎng)素、膳食纖維及黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)化合物等生物活性物質(zhì)，而備受研究者關(guān)注[2-4]。研究表明，蕎麥殼具有潤(rùn)腸通便、抗氧化、預(yù)防高血壓和糖尿病等保健功效[5-6]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)苦蕎麥中的膳食纖維和游離態(tài)多酚進(jìn)行了大量的研究，但對(duì)膳食纖維中的結(jié)合酚鮮有報(bào)道[7-10]。膳食纖維和多酚類(lèi)物質(zhì)可以采用物理、化學(xué)反應(yīng)通過(guò)氫鍵、范德華力和疏水作用等非共價(jià)形式結(jié)合[11]。Dong等[12]研究表明，胡蘿卜膳食纖維結(jié)合酚具有很好的抗氧化能力。Zheng 等[13]發(fā)現(xiàn)，綠豆皮膳食纖維結(jié)合酚對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有抑制作用。值得關(guān)注的是，Guo 等[14]發(fā)現(xiàn)，全麥谷物中不溶性膳食纖維結(jié)合酚的抗氧化能力強(qiáng)于可溶性膳食纖維結(jié)合酚。Zhu 等[15]研究了微粉化技術(shù)對(duì)蕎麥殼膳食纖維理化性質(zhì)的影響，結(jié)果表明，微粉化可以改善膳食纖維理化性質(zhì)。結(jié)合酚的提取方法主要有化學(xué)法和酶法，化學(xué)法涉及強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫，會(huì)造成結(jié)合酚的損失，而溫和且有效的酶法較好地避免了這個(gè)問(wèn)題。張金宏等[16]對(duì)比了3種水解方法對(duì)蘋(píng)果渣結(jié)合酚單體酚含量的影響，結(jié)果表明，酶法提取12 種單體酚效果最佳。綜上可知，結(jié)合酚具有潛在的功能特性，而且不同處理方法會(huì)影響其理化性質(zhì)和功能性。本文以苦蕎麥殼為原料，以不溶性膳食纖維得率和結(jié)合酚含量為指標(biāo)，對(duì)結(jié)合酚的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并評(píng)價(jià)了其理化性質(zhì)，以期為苦蕎麥殼的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

苦蕎麥殼，市售；纖維素酶（2 000 U/g）、木瓜蛋白酶（20 000 U/g），北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司；α-淀粉酶（40 000 U/g）、沒(méi)食子酸（純度≥98%），索萊寶生物科技有限公司；碳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、福林酚等均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

GL20M 高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器，金壇市科技儀器有限公司；XD-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海賢德實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；UV-5100B 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海分析儀器有限公司；Mira 3 掃描電鏡，泰思肯貿(mào)易（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 苦蕎麥殼不溶性膳食纖維結(jié)合酚（F-DFPP）提取工藝流程

苦蕎麥殼→預(yù)處理→不同方法提取不溶性膳食纖維（IDF）→苦蕎麥不溶性膳食纖維（F-IDF）→纖維素酶酶解→鹽酸中和→萃取→F-DFPP

1.2.2 苦蕎麥殼粉的制備

將苦蕎麥殼在60 ℃下烘干至恒重，粉碎，過(guò)60目篩，備用。

1.2.3 苦蕎麥殼不溶性膳食纖維的提取

1.2.3.1 酸法提取

參考武陽(yáng)等[17]的方法，稱(chēng)取5 g苦蕎麥殼粉，按照1∶15（g/mL）的料液比加入0.1 mol/L 的HCl 溶液，在50 ℃的恒溫水浴中振蕩酸解2 h。離心分離，濾渣用蒸餾水洗滌至中性，50 ℃干燥至恒重，檢測(cè)F-IDF得率和結(jié)合酚含量。

1.2.3.2 堿法提取

參考林偉達(dá)等[18]的方法，稱(chēng)取5 g樣品，按照1∶15（g/mL）的料液比加入1%的NaOH 溶液，在50 ℃的恒溫水浴中振蕩堿解2 h。離心分離，濾渣用蒸餾水洗滌至中性，50 ℃干燥至恒重，檢測(cè)F-IDF得率和結(jié)合酚含量。

1.2.3.3α-淀粉酶-木瓜蛋白酶復(fù)合酶法提取

參考丁政宇等[19]的方法，稱(chēng)取5 g樣品，按照1∶15（g/mL）的料液比加入pH 為6 的水溶液，加入1%的α-淀粉酶，在80 ℃的恒溫水浴中振蕩酶解50 min，冷卻至50 ℃，再加入1%的木瓜蛋白酶，于50 ℃條件下酶解50 min。85 ℃水浴滅酶10 min 后離心分離，濾渣用蒸餾水洗滌至中性，50 ℃干燥至恒重，檢測(cè)FIDF得率和結(jié)合酚含量。

1.2.4 F-IDF理化性質(zhì)測(cè)定

1.2.4.1 持水性

參考Zhang等[20]的方法稍作修改。準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g F-IDF 于50 mL 的離心管中，向其中加入25 mL 的蒸餾水充分混勻，室溫反應(yīng)2 h后離心測(cè)定其質(zhì)量。持水性計(jì)算公式如下：

1.2.4.2 持油性

參考Zhang等[20]的方法稍作修改。準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g F-IDF 于50 mL 的離心管中，向其中加入25 mL 豆油充分混勻，室溫反應(yīng)2 h后離心測(cè)定其質(zhì)量。計(jì)算公式如下：

1.2.4.3 膨脹力

參考郭婭[21]的方法稍作修改。準(zhǔn)確稱(chēng)取F-IDF 0.5 g，放入10 mL的刻度試管中，加入10 mL蒸餾水，充分混勻，室溫反應(yīng)24 h后離心稱(chēng)重。計(jì)算公式如下：

1.2.5 F-DFPP提取工藝的優(yōu)化

參考Peng 等[22]的方法，稍作修改。分別稱(chēng)取上述3 種方法獲得的苦蕎麥殼不溶性膳食纖維5 g，在60 ℃條件下，用超聲波輔助纖維素酶法對(duì)F-DFPP提取，3 500 r/min 離心10 min，上清液用6 mol/L 鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至中性，乙酸乙酯萃取3次收集萃取液，45 ℃下真空濃縮到一定體積，檢測(cè)結(jié)合酚含量。

1.2.5.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

固定料液比為1∶20（g/mL），纖維素酶添加量8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），超聲功率180 W，提取時(shí)間2 h，水溶液pH為7?？疾觳煌弦罕龋?∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL））、纖維素酶添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、超聲功率（90、120、150、180、210 W）和提取時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）對(duì)結(jié)合酚含量的影響。

1.2.5.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以結(jié)合酚含量為考察指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor and level design of response surface test

1.2.6 結(jié)合酚含量的測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu 法[23]測(cè)定F-IDF 中結(jié)合酚的含量，結(jié)合酚含量以每克IDF中所含沒(méi)食子酸的量表示（mg/g）。

1.2.7 掃描電鏡（SEM）分析

使用SEM對(duì)樣品微觀(guān)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀(guān)察。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 和SPSS 25.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，采用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對(duì)F-IDF得率和F-DFPP含量的影響

由表2可見(jiàn)，酶法處理F-IDF的得率和結(jié)合酚含量均顯著高于酸法和堿法（P＜0.05）。唐玉妹[24]比較了不同提取方法對(duì)竹筍膳食纖維結(jié)合酚含量的影響，發(fā)現(xiàn)酶法顯著高于化學(xué)法（P＜0.05）。

表2 F-IDF得率及結(jié)合酚含量Table 2 Extraction yields of F-DFPP and contents of F-IDF

2.2 不同提取方法對(duì)F-IDF理化性質(zhì)的影響

2.2.1 不同提取方法對(duì)F-IDF持水性的影響

膳食纖維的持水性與其親水基團(tuán)具有密切相關(guān)性。膳食纖維的持水性越好，越有利于泌尿系統(tǒng)減輕壓力，促進(jìn)體內(nèi)毒素的排出[25]。因此，膳食纖維的持水性是重要的理化評(píng)價(jià)指標(biāo)。由圖1可知，采用堿法提取F-IDF 的持水性顯著高于酶法和酸法（P＜0.05），這可能是由于堿法對(duì)F-IDF結(jié)構(gòu)破壞性更強(qiáng)，導(dǎo)致大量親水基團(tuán)被釋放，從而使其具有更好的持水性。

圖1 不同提取方法對(duì)F-IDF持水性的影響Fig.1 Effects of different extraction methods on water holding capacity of F-IDF

2.2.2 不同提取方法對(duì)F-IDF持油性的影響

膳食纖維的持油性是評(píng)價(jià)其物理吸附功能的重要指標(biāo)，與其攝入后的減肥功效密切相關(guān)[26]，持油性的大小與表面積和空隙有關(guān)。如圖2所示，酸法和酶法提取F-IDF 的持油性分別為（1.24±0.05）g/g 和（1.26±0.05）g/g，顯著高于堿法（P＜0.05）。這可能由于酸法和酶法提取的F-IDF結(jié)構(gòu)更加稀疏多孔，從而利于油脂的吸附[27]。

圖2 不同提取方法對(duì)F-IDF持油性的影響Fig.2 Effects of different extraction methods on oil retention of F-IDF

2.2.3 不同提取方法對(duì)F-IDF膨脹力的影響

膳食纖維的膨脹力與其致密的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系，多孔狀結(jié)構(gòu)可以吸水膨脹，產(chǎn)生飽腹感，還可以加速腸道蠕動(dòng)，因此膳食纖維具有通便和減肥功效[28]。如圖3 所示，堿法提取F-IDF 的膨脹力達(dá)（1.12±0.02）mL/g，顯著高于酸法和酶法（P＜0.05），這可能是由于堿液的破壞性較大，使其孔隙率提高，縫隙被水填充后使其膨脹[29]。

圖3 不同提取方法對(duì)F-IDF膨脹力的影響Fig.3 Effects of different extraction methods on dilatancy of F-IDF

綜合各因素考慮，酶法提取的IDF結(jié)構(gòu)更加完整，理化性質(zhì)相對(duì)良好，在提取時(shí)間、能耗、活性成分等方面的優(yōu)勢(shì)明顯高于其他兩種方法，可為利用苦蕎麥殼開(kāi)發(fā)膳食纖維功能性產(chǎn)品提供依據(jù)。因此，下文將對(duì)酶法提取F-IDF中結(jié)合酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

如圖4～圖7所示，不同料液比、纖維素酶添加量、超聲功率和提取時(shí)間對(duì)苦蕎麥殼中不溶性膳食纖維結(jié)合酚的含量具有顯著影響，均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)。

圖4 料液比對(duì)結(jié)合酚含量的影響Fig.4 Effects of solid-liquid ratios on the contents of F-DFPP

由圖4可知，在料液比1∶5（g/mL）到1∶20（g/mL）范圍內(nèi)，隨溶劑量的增加，結(jié)合酚釋放量上升，但料液比1∶25（g/mL）時(shí)結(jié)合酚釋放量反而降低，這可能是由于過(guò)多的溶劑增大了其他物質(zhì)的溶出，使其含量減少[30]，因此選擇適宜的料液比為1∶20（g/mL）。

由圖5 可見(jiàn)，隨著纖維素酶添加量的增加，細(xì)胞壁的水解程度增加，結(jié)合酚大量釋放，但過(guò)多添加纖維素酶會(huì)降低結(jié)合酚含量，這是由于蛋白質(zhì)等其他物質(zhì)被釋放，黏度增大降低了結(jié)合酚釋放量[31]，因此選擇適宜的纖維素酶添加量為8%。

圖5 纖維素酶添加量對(duì)結(jié)合酚含量的影響Fig.5 Effects of cellulase additions on the contents of F-DFPP

如圖6 所示，超聲功率在90～180 W 范圍內(nèi)與結(jié)合酚釋放量呈正相關(guān)，當(dāng)超聲功率達(dá)210 W 時(shí)，結(jié)合酚受熱分解，其含量反而降低，因此選擇適宜的超聲功率為180 W。

圖6 超聲功率對(duì)結(jié)合酚含量的影響Fig.6 Effects of ultrasonic power on the contents of combined phenol

由圖7 可見(jiàn),在0.5～2.0 h 范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的不斷增加，結(jié)合酚不斷溶出。但提取時(shí)間繼續(xù)增加，結(jié)合酚受溫度的影響發(fā)生了氧化分解，其含量減少，因此選擇適宜的提取時(shí)間為2.0 h。

圖7 提取時(shí)間對(duì)結(jié)合酚含量的影響Fig.7 Effects of extraction time on the contents of combined phenol

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面模型的建立及方差分析

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Response surface test results

表4 方差分析表Table 4 Variance analysis table

對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到結(jié)合酚含量的回歸方程為：Y=7.35+0.11A+0.072B+0.20C+5.833×10-3D-0.037AB+0.12AC-0.19AD+0.080BC-0.085BD-2.500×10-3CD-0.79A2-0.63B2-0.46C2-0.3D2。

由表4可知，該模型達(dá)極顯著水平（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著，決定系數(shù)R2=0.973 3，說(shuō)明回歸方程具有良好的擬合性，可應(yīng)用于結(jié)合酚提取試驗(yàn)的預(yù)測(cè)。由表4方差分析結(jié)果可知，因素B對(duì)結(jié)合酚含量影響顯著（P＜0.05），A、C、AD、A2、B2、C2、D2對(duì)結(jié)合酚含量的影響極顯著（P＜0.01）。各因素對(duì)結(jié)合酚含量影響的主次順序依次為：C＞A＞B＞D。

2.4.2 各因素交互作用響應(yīng)面分析

由圖8可知，AD的曲面圖變化陡峭，等高線(xiàn)趨近于橢圓形，說(shuō)明AD間的交互作用對(duì)結(jié)合酚含量有著顯著影響，AB、AC、BC、BD、CD曲面圖變化不陡峭，等高線(xiàn)趨近于圓形，說(shuō)明他們之間的交互作用對(duì)結(jié)合酚含量的影響不顯著，這與表4方差分析結(jié)果一致。

圖8 各因素交互作用對(duì)結(jié)合酚含量影響的響應(yīng)曲面及等高線(xiàn)圖Fig.8 Response surface and contour plots of various factors interaction on bound phenol contents

2.4.3 最優(yōu)提取條件的確定

通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化后得到的最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶20.44（g/mL），酶添加量8.14%，超聲功率186.94 W，提取時(shí)間1.99 h，模型預(yù)測(cè)結(jié)合酚含量為7.37 mg/g。調(diào)整后的參數(shù)為：料液比1∶20（g/mL），酶添加量8%，超聲功率180 W，提取時(shí)間2 h。按調(diào)整后的工藝進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到結(jié)合酚含量為（7.45±0.05）mg/g，實(shí)際結(jié)果與預(yù)測(cè)值相差較小，說(shuō)明本模型具有較高的可信度。

2.5 水解前后F-IDF在電鏡下的組織狀態(tài)

酶解是影響結(jié)合酚釋放的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。如圖9 所示，酶解前后F-IDF 的微觀(guān)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，酶解前F-IDF結(jié)構(gòu)緊密，而酶解后F-IDF結(jié)構(gòu)變得疏松多孔。這是由于結(jié)合酚從F-IDF中釋放出來(lái)，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變得疏松多孔，這說(shuō)明纖維素酶解法是一種適合蕎麥殼膳食纖維結(jié)合酚提取的方法。

圖9 水解前后F-IDF的電鏡圖Fig.9 Electron microscopic images of F-IDF before and after hydrolysis

3 結(jié)論

本文對(duì)苦蕎麥殼不溶性膳食纖維的理化性質(zhì)及其結(jié)合酚的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明：采用α-淀粉酶-木瓜蛋白酶復(fù)合酶法制備F-IDF，F(xiàn)-IDF得率可達(dá)到59.45%±0.87%；不同方法獲得的F-IDF理化性質(zhì)差異顯著，酶法和酸法提取的F-IDF具有較高的持油性；堿法提取的F-IDF持水性和膨脹性最佳；F-DFPP的提取最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶20（g/mL），纖維素酶添加量8%，超聲功率180 W，提取時(shí)間2 h，按該工藝提取的結(jié)合酚含量為（7.45±0.05）mg/g；纖維素酶可使膳食纖維結(jié)構(gòu)變得疏松多孔，從而利于結(jié)合酚的提取和制備。