白芙婷,姜 怡,郭宇航,張藏?zé)?王博韜,剡雨彤,周怡菲,孫 卓,陳 鏑

三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)因高轉(zhuǎn)移、高侵襲、高復(fù)發(fā)等特點導(dǎo)致預(yù)后較差[1]。TNBC因缺乏有效靶點而主要依賴化療,然而化療藥物毒副作用大且易產(chǎn)生耐藥,導(dǎo)致患者預(yù)后不佳[2]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)/缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)通路是調(diào)控腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵通路。STAT3在惡性腫瘤中異常激活,是腫瘤治療的重要分子靶點。HIF-1α是STAT3的靶分子,可促進腫瘤增殖、血管生成和耐藥等。研究[3]顯示,白細(xì)胞介素-6通過激活STAT3誘導(dǎo)HIF-1α上調(diào),抑制化療藥物產(chǎn)生的細(xì)胞毒和促凋亡作用,導(dǎo)致耐藥發(fā)生。上述研究提示,抑制STAT3/HIF-1α通路的活性將有望改善TNBC化療現(xiàn)狀。蓽茇酰胺(piperlongumine,PL)可抑制不同類型癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡。研究[4]顯示,PL通過降低STAT3磷酸化抑制TNBC增殖,而對HIF-1α的調(diào)控尚不明確。探究PL對STAT3/HIF-1α通路的調(diào)控機制,將為PL應(yīng)用于TNBC的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞來源于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院。

1.1.2實驗動物 12只5周齡SPF級雌性裸鼠購于北京華阜康生物科技股份有限公司,體質(zhì)量(18.4±0.54)g。生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2019-0008。使用許可證號:SYXK(陜)2022-004。

1.1.3主要藥物與試劑 PL購于美國APExBIO公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、青鏈霉素、Accutase購于美國GIBCO公司;胰蛋白酶購于美國MP公司;MTT試劑盒、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購于美國Sigma公司;Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購于美國BD公司;BCA蛋白定量試劑盒、特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;一抗:增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)抗體、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體、細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A,CDKN1A/p21)抗體、STAT3抗體、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3,p-STAT3)抗體、HIF-1α抗體、存活素(Survivin)抗體購于美國CST公司;小鼠抗β-actin一抗、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠/兔二抗購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.4主要儀器 Epoch酶標(biāo)儀(美國BioTek公司);Accuri C6流式細(xì)胞儀(美國BD公司);Mini Pro TEAN Tera cell電泳儀、Chemi Doc凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%青鏈霉素)培養(yǎng),置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱。細(xì)胞密度達(dá)70%以上時,用胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2細(xì)胞增殖實驗 取對數(shù)期的MDA-MB-231細(xì)胞消化接種于96孔板,100 μl/孔過夜培養(yǎng)。藥物分別作用24、48、72 h后再吸出。加MTT工作液100 μl/孔培養(yǎng)4 h后吸出。加DMSO 100 μl/孔振蕩10 min。酶標(biāo)儀測定各孔490 nm波長處吸光度值(absorbance,A),計算細(xì)胞存活率及半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。細(xì)胞存活率(%)=A(PL組-空白組)/A(PL 0 μmol/L組-空白組)×100%。

1.2.3細(xì)胞凋亡實驗 取對數(shù)期的MDA-MB-231細(xì)胞消化接種于12孔板,2 ml/孔過夜培養(yǎng)。藥物作用48 h后,用Accutase消化并收集各孔細(xì)胞于100 μl緩沖液中。每管分別加5 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI,混勻后室溫避光孵育15 min。加400 μl binding buffer,以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4Western blot RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min,4 ℃、12 000 r/min離心20 min收集上清液。用BCA蛋白定量試劑盒測定濃度,以等體積loading buffer和不同體積PBS混合至濃度相同。采用SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,加入PCNA、Bcl-2、p21、STAT3、p-STAT3、HIF-1α、Survivin、β-actin抗體(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜,PBST漂洗5次。二抗(1 ∶1 000)室溫孵育1 h,重復(fù)漂洗步驟。加ECL發(fā)光液顯色,凝膠成像儀檢測灰度值。

1.2.5裸鼠荷瘤實驗 12只雌性裸鼠飼養(yǎng)于西安醫(yī)學(xué)院SPF級動物飼養(yǎng)單元。將100 μl MDA-MB-231細(xì)胞懸液(5×106個)注射于每只裸鼠的乳腺處。待裸鼠腫瘤體積達(dá)到約50 mm3時,將12只裸鼠隨機均分為PBS組和PL組,PBS組6只裸鼠編號為PBS-1至PBS-6,PL組6只裸鼠編號為PL-1至PL-6。隔天經(jīng)腹腔注射給藥,PBS組注射100 μl PBS,PL組注射100 μl PL溶液(4 mg/kg,溶于PBS)。隔天記錄裸鼠體質(zhì)量,并以游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑和短徑,計算腫瘤體積。腫瘤體積=(長徑×短徑2)/2。給藥結(jié)束后處死所有裸鼠,取出腫瘤稱重,提取腫瘤總蛋白。

2 結(jié)果

2.1 PL對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示,不同濃度PL處理后,MDA-MB-231細(xì)胞存活率逐漸降低。PL作用24、48、72 h的IC50值分別為(17.73± 0.41)、(9.81± 1.21)、(6.77± 1.24)μmol/L,呈現(xiàn)量效和時效關(guān)系,見圖1。

圖1 PL對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響(n=3)

2.2 PL對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,不同濃度PL處理后,MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率逐漸升高(F= 47.20,P<0.01),且呈量效關(guān)系,見圖2。

圖2 PL對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響(n=3)

2.3 PL對MDA-MB-231細(xì)胞增殖與凋亡信號通路的影響Western blot結(jié)果顯示,在MDA-MB-231細(xì)胞中,PL處理后,PCNA和Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(F=24.87,P<0.01;F=17.54,P<0.05),p21蛋白表達(dá)水平升高(F=27.74,P<0.01),見圖3。

圖3 PL對MDA-MB-231細(xì)胞增殖與凋亡信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響(n=3)

2.4 PL對MDA-MB-231細(xì)胞STAT3/HIF-1α信號通路的影響Western blot結(jié)果顯示,在MDA-MB-231細(xì)胞中,PL處理后,p-STAT3、HIF-1α、Survivin 蛋白表達(dá)水平降低(F=26.65,P<0.01;F=50.54,P<0.01;F=41.08,P<0.01),STAT3蛋白表達(dá)水平無顯著變化(F=1.26,P>0.05),見圖4。

圖4 PL對MDA-MB-231細(xì)胞STAT3/HIF-1α信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響(n=3)

2.5 PL對裸鼠腫瘤增殖的影響終止給藥后,PBS組和PL組腫瘤體積分別為(867.68± 156.27)mm3和(590.70± 109.76)mm3,腫瘤質(zhì)量分別為(0.895± 0.236)g和(0.560± 0.124)g。相較于PBS組,PL組腫瘤體積減小(F=12.62,P<0.01),腫瘤質(zhì)量減輕(F=9.50,P<0.05)。兩組裸鼠體質(zhì)量間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.49,P>0.05),見圖5。

圖5 PL對裸鼠腫瘤增殖的影響(n=1)

2.6 PL對裸鼠腫瘤中STAT3/HIF-1α信號通路的影響終止給藥后,以液氮研磨提取裸鼠腫瘤組織總蛋白,Western blot法檢測PBS組和PL組腫瘤組織中PCNA、p-STAT3、STAT3、HIF-1α、Survivin蛋白的相對表達(dá)量。兩組的STAT3蛋白表達(dá)水平無顯著變化(F=1.35,P>0.05)。相較于PBS組,PL組的PCNA、p-STAT3、HIF-1α、Survivin蛋白表達(dá)水平均降低(F=21.82,P<0.01;F=6.44,P<0.05;F=149.88,P<0.001;F=36.57,P<0.01),見圖6。

圖6 PL對裸鼠腫瘤中STAT3/HIF-1α信號通路的影響(n=1)

3 討論

TNBC在乳腺癌各種類型中惡性程度最高,且化療預(yù)后不佳,患者的5年內(nèi)生存率僅為60%[5]。STAT3是腫瘤早期診斷標(biāo)志物,與乳腺癌惡變密切相關(guān),其異常活化后調(diào)控HIF-1α等信號分子使癌細(xì)胞增殖活躍,并導(dǎo)致多臟器轉(zhuǎn)移和多藥耐藥。PL被報道具有廣泛的抗癌活性,能夠抑制包括TNBC在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞增殖,而對正常細(xì)胞毒性較小。PL的抗癌機制涉及不同信號通路,其是否通過調(diào)控STAT3/HIF-1α通路介導(dǎo)對TNBC的抑制增殖和促凋亡作用目前尚不明確。

PL通過調(diào)控凋亡相關(guān)分子介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖。Kim et al[6]研究發(fā)現(xiàn),p21通過直接靶向Bcl-2調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的侵襲和凋亡。Bcl-2則通過線粒體凋亡途徑控制細(xì)胞凋亡,當(dāng)其表達(dá)水平升高時可促進乳腺癌細(xì)胞增殖。Chen et al[4]發(fā)現(xiàn),PL通過下調(diào)Bcl-2的表達(dá)誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。此外,PCNA與Bcl-2的表達(dá)具有相關(guān)性,Bcl-2被抑制可導(dǎo)致PCNA表達(dá)下調(diào)[7]。本研究顯示,PL對MDA-MB-231細(xì)胞的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用具有濃度依賴性。Western blot結(jié)果顯示,PL上調(diào)了p21蛋白表達(dá)水平,下調(diào)了Bcl-2和PCNA蛋白表達(dá)水平,提示PL可能通過阻滯細(xì)胞周期誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。此外,裸鼠荷瘤實驗結(jié)果表明,PL可在動物體內(nèi)抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖,且未造成動物體質(zhì)量異常變化。

STAT3/HIF-1α通路異常激活對于腫瘤的發(fā)展至關(guān)重要。STAT3持續(xù)激活促進腫瘤細(xì)胞快速增殖,導(dǎo)致缺氧微環(huán)境的形成,而HIF-1α是響應(yīng)缺氧誘導(dǎo)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,兩者共同介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生物活性調(diào)控。STAT3是HIF-1α的原始調(diào)控分子,在缺氧條件下發(fā)生自身磷酸化[8]。p-STAT3通過激活HIF-1α的啟動子,提高HIF-1α的轉(zhuǎn)錄和翻譯活性。STAT3/HIF-1α通路異常激活可導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及抗凋亡能力增強[9]。STAT3/HIF-1α通路還參與腫瘤細(xì)胞化療耐藥的形成。Wang et al[10]研究發(fā)現(xiàn),miR-183通過抑制STAT3/HIF-1α通路增強了多藥耐藥肝癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶等化療藥物的敏感性。值得關(guān)注的是,HIF-1α或許發(fā)揮了更為關(guān)鍵的作用。Shi et al[11]在對多種乳腺癌細(xì)胞株的研究中發(fā)現(xiàn),HIF-1α在MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)最高,且該細(xì)胞在同等培養(yǎng)條件下增殖最快。Xiong et al[12]發(fā)現(xiàn),HIF-1α激活將導(dǎo)致TNBC耐藥以及化療失敗。此外,研究[13]顯示HIF-1α通過調(diào)控下游凋亡抑制蛋白Survivin來增強胃癌細(xì)胞的抗凋亡能力。在胰腺癌中,聯(lián)合阻抑HIF-1α和Survivin產(chǎn)生了比阻抑其一更強的抑制增殖作用[14]。這些研究提示,HIF-1α可能是改善TNBC化療的關(guān)鍵因素。此前,PL對癌細(xì)胞HIF-1α的影響無明確報道,本研究顯示PL可降低MDA-MB-231細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)水平。隨著PL濃度升高,體外和體內(nèi)均檢測到p-STAT3蛋白和Survivin蛋白表達(dá)水平降低。提示PL很可能通過抑制STAT3和HIF-1α的活性而降低Survivin蛋白表達(dá)水平,導(dǎo)致MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力降低、凋亡率升高。

綜上所述,本研究表明PL在體外和體內(nèi)抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖,其分子機制可能與負(fù)調(diào)控STAT3/HIF-1α信號通路有關(guān)。PL抑制TNBC中HIF-1α表達(dá)的調(diào)控作用,但仍需在其他類型癌細(xì)胞中進行驗證,裸鼠荷瘤實驗還需要在更多劑量下檢測PL的有效性和安全性。在未來的研究中,將選用耐藥TNBC細(xì)胞探究PL抗耐藥的機制,為PL應(yīng)用于TNBC的臨床治療提供更為充分的理論依據(jù)。