郭騰飛,王珍珍,,侯 義,趙戰(zhàn)勤,祖向陽,江 濤,薛 云

結核分枝桿菌感染是世界常見的單病種死亡病因之一[1]。中國是結核病高負擔國家[2]。結核的傳播及耐藥模式具有地域差異,而監(jiān)測數(shù)據(jù)的不完全性,阻礙了結核的及時診斷及耐藥的風險評估。近年來分子檢測技術廣泛地應用于臨床,使耐藥結核(drug-resistant tuberculosis,DR-TB)患者的精準防控成為可能。其中HRM技術能同時分析多種抗結核藥物的分子易感性,用于補充結核感染和分子耐藥的流行病學資料。乙胺丁醇(ethambutol,EMB)和鏈霉素(streptomycin,SM)是治療 DR-TB 的第一組藥物,但其耐藥模式在該地區(qū)卻是空白。引起結核乙胺丁醇耐藥(ethambutol resistance,EMB-R)的分子機制主要是基因EmbB和EmbC突變;鏈霉素耐藥(streptomycin resistance,SM-R)主要是由基因rrs和Rpsl 43及88位密碼子的突變引起[3-4],不同國家和地區(qū)的結核耐藥突變位點也有所不同。該研究旨在結核感染群體特征的宏觀現(xiàn)象上,分析EMB及SM的耐藥特征及耐藥在堿基水平的微觀表現(xiàn),這將有助于改進現(xiàn)有的快速耐藥檢測技術,探索藥物活性的新靶點。

1 材料與方法

1.1 病例資料該研究對洛陽市和縣區(qū)(偃師縣、欒川縣、嵩縣縣、汝陽縣、洛寧縣、孟津縣、新安縣、宜陽縣、伊川縣)2019年1月—2021年 12月期間所有的臨床確診及疑似病例的痰液、胸水或肺泡灌洗液行HRM擴增后將陽性結果納入分析。分析前按照姓名、性別、年齡、地區(qū)等因素排除重復檢測者,將年齡<15歲和年齡>86歲的個體匯總為單一年齡類別,其他均按5年為一個單位。變量包括檢測日期、HRM陽性結果(乙胺丁醇和鏈霉素耐藥結果)、性別、年齡、地區(qū)(縣區(qū)統(tǒng)一歸為鄉(xiāng)鎮(zhèn)區(qū)域)、痰涂結果和系統(tǒng)記錄或自我報告的治療史。

疑似和確診病例:經臨床診斷已明確有結核分枝桿菌感染或過往感染的群體;抗結核治療失敗,有結核治療史或既往結核感染未徹底治愈;有臨床癥狀或潛伏感染者;免疫病理有結核分枝桿菌感染特征者;影像學有感染提示者;排菌患者密切接觸者;結核菌素試驗強陽反應。

1.2 病例診斷標準根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準(WS196-2017)[5],根據(jù)治療史對患者進行分類,初治結核病。初治患者指符合下列情況之一:① 從未因結核病應用過抗結核藥物治療的患者;② 正進行標準化療方案規(guī)則用藥而未滿療程的患者;③ 不規(guī)則化療未滿1個月的患者。復治患者指符合下列情況之一:① 因結核病不合理或不規(guī)則用抗結核藥物治療≥1個月的患者;② 初治失敗和復發(fā)患者。

1.3 基因突變位點檢測該研究采用HRM針對EMB耐藥高突變的embB基因(embB 306、embB 406、embB 497、embB 368/378/380)進行檢測,SM檢測主要是rpsL基因43、88位密碼子和rrs基因的513～517位點及905～908位點。

1.4 統(tǒng)計學處理使用STATA/SE 15.1軟件對所有可能與EMB-R和SM-R發(fā)生有關的變量納入多變量Logistic回歸分析,同時對不同治療史、區(qū)域分布、痰涂結果背景下的性別及耐藥情況行Pearson卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 按性別分層的鏈霉素和乙胺丁醇耐藥結果2019—2021年,該地區(qū)共有2 941例非重復HRM陽性病例中SM、EMB耐藥率初診患者分別為17.3%和7.4%,復治患者分別為25.8%和12.1%,城市患者分別為21.3%和9.8%,農村患者分別為16.6%和6.9%,痰涂陽性人群分別為17.8%和6.9%,痰涂陰性分別為19.2%和9.0%。SM-R和EMB-R按性別分層檢出性差異見表1。

表1 HRM陽性人群特征及在不同因素下SM-R和EMB-R情況[n(%)]

2.2 不同變量下的鏈霉素和乙胺丁醇耐藥結果SM-R和EMB-R因性別、年齡、結核治療史及地區(qū)分布有關?？傮w而言,在結核分枝桿菌感染患者中,SM耐藥率男性為19.0%,女性為16.5% (χ2=2.309,P=0.129),EMB耐藥率男性為8.0%,女性為7.9%(χ2=0,P=0.987)。初診和復診群體中SM耐藥率分別為17.3%和25.8% (χ2=15.192,P<0.001),而EMB耐藥率則為7.4%和12.1%(χ2=9.557,P=0.002)。該研究對初復診群體不同性別的EMB-R和SM-R檢出率行χ2檢驗分析顯示,EMB-R差異存在于初診男性及復診男性之間(χ2=6.340,P=0.012)及初診女性與復診男性之間(χ2=5.786,P=0.016);SM在復診男女之間耐藥率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.690,P=0.406)。在城市和鄉(xiāng)村患者中SM的耐藥率分別為21.3%和16.6%(χ2=9.927,P=0.002),EMB的耐藥率分別為9.8%和6.9%(χ2=8.115,P=0.004)。SM-R的檢出無論是鄉(xiāng)村男女,還是城市與鄉(xiāng)村的男女之間均有差異,但在城市男女之間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.850,P=0.356);而EMB-R在城市與鄉(xiāng)村不同性別之間耐藥性差異更不明顯。痰涂陽性群體對SM和EMB耐藥率分別為17.8%、6.9%,而痰涂陰性為19.2%、9.0%。EMB-R在痰涂陽性和痰涂陰性群體之間的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=3.979,P=0.028),SM-R在痰涂陽性群體男女之間的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.974,P=0.015)。對不同年齡范圍群體的耐藥率分析可知,年齡<51歲群體對SM耐藥率高于年齡>50歲群體(χ2=12.572,P<0.001)。

2.3 按年齡分層的耐藥結果SM耐藥率最高的年齡范圍是31～35歲(32.2%),與其他所有年齡類別相比,31～35歲的男性(38.9%)及56～60歲女性(26.7%)對SM耐藥率最高。EMB耐藥率高峰出現(xiàn)在21～25歲(12.7%)的年齡范圍,男性對EMB耐藥率峰值(15.8%)與總體EMB耐藥率一致,均是21～25歲,女性對EMB耐藥率峰值的年齡范圍依舊是56～60歲,耐藥率為12.8%。按年齡類別分類的HRM陽性結果總數(shù)以條形圖表示,SM和EMB耐藥率以折線表示(第二y軸)。見圖1。

圖1 按年齡和性別分類的HRM陽性結果及SM-R和EMB-R的比例A:按年齡和性別分類的HRM陽性結果例數(shù)及SM耐藥率;B:按年齡和性別分類的HRM陽性結果例數(shù)及EMB耐藥率

2.4 多因素Logisitic回歸分析結果采用多因素Logisitic回歸分析來確定性別、年齡、治療史、地區(qū)、痰涂、年份是否與SM-R及EMB-R的檢出相關。結果顯示,男性、年齡<51歲、城市和結核治療史均與SM-R和EMB-R風險增加呈正相關(表2)。在調整了痰涂結果和檢測年份的影響后,男性被診斷為SM-R的可能性高于女性;51歲及以下被診斷為SM-R的可能性高于50歲以上個體;與無治療史個體相比,有結核治療史被診斷為SM-R及EMB-R的可能性更高;城市群體被診斷為SM-R和EMB-R的可能性高于鄉(xiāng)村。

表2 鏈霉素耐藥和乙胺丁醇耐藥的多項式Logistic回歸分析[n(%)]

2.5 引起鏈霉素和乙胺丁醇耐藥基因位點引起SM-R的基因突變中,單位點突變率為91.8%,其次是雙位點8.2%。在單位點突變中,rpsL 43位密碼子突變率最高,為59.0%,其次是rpsL 88和 rrs 905～908位點,在全部突變模式中分別占16.4%和13.1%,另外有rrs 513～517單位點突變率為3.3%;另外該研究表明rpsL 43聯(lián)合 rrs 905～908及rpsL 88聯(lián)合 rrs 905～908位點的雙位點突變率分別為4.9%、3.3%。而EMB-R的分子突變位點中,只發(fā)現(xiàn)了單位點突變,其中embB 306、embB 406、embB 497和embB 368/378/380的突變率分別為66.7%、18.4%、10.7%和4.3%。引起SM和EMB同時耐藥的分子模式,主要是rpsL 43聯(lián)合embB 306,rpsL 88聯(lián)合embB 497,rpsL 43聯(lián)合embB 406和rpsL 88聯(lián)合embB 306,分別占全部突變模式的52.1%、16.0%、10.5%和6.8%。見圖2。

圖2 結核分枝桿菌基因耐藥相關突變率

3 討論

本研究揭示了該地區(qū)高風險人群SM和EMB耐藥模式及耐藥相關的危險因素。該地區(qū)SM和EMB耐藥率分別是18.4%和8.0%,低于青海省的40.9%和30.3%[6],而高于山東省的14.7%和2.6%[7]。2019—2021年期間SM-R和EMB-R的檢出率均有下降趨勢。這說明近幾年來該地區(qū)在結核病督導短程化療DOTS戰(zhàn)略上的總體布局是有成效的。

第5次結核耐藥的全國調查報告顯示,初診病例SM和EMB的耐藥率分別為27.7%和4.9%,復治病例耐藥率分別是37.2%、17.2%[8],而在該地區(qū)SM和EMB的初診耐藥率分別是17.3%和7.4%,復診耐藥率則是25.8%和12.1%。該地區(qū)初診耐藥率從2019—2021年有下降趨勢,但初診群體中EMB的耐藥率依舊高于全國水平,說明仍需要通過加強結核患者的管理,降低耐藥率。該地區(qū)復診耐藥率明顯高于初診個體,且近3年來SM-R檢出率呈現(xiàn)升高趨勢(25.0%、19.4%、32.0%),提示該研究仍需要加強服藥依從性宣傳及管理,另外由于MTB藥敏結果耗時較長,臨床對于結核患者的初期治療更加依賴于經驗性用藥,這也在一定程度上增加了結核桿菌的獲得性耐藥,因此基層地區(qū)急需要更快速、更準確的藥敏檢測手段輔助臨床精準抗結核。

鄉(xiāng)村HRM檢出率卻遠低于城市,這可能是因為醫(yī)療水平的差異,鄉(xiāng)村在對高風險結核病例的初篩的確定性上有待進一步考證。城鎮(zhèn)群體SM和EMB耐藥率均高于鄉(xiāng)村,這說明城市是耐藥結核的高負擔地區(qū)。結核是聚集性傳染病,特別容易在高密度人群中播散。而城市人口密度相對較大,流動性強,而且因為醫(yī)療水平等差異可能會使得疑難、復雜結核感染病例更加向城市集中。另外據(jù)研究[9]表明,高精神壓力和低身體質量指數(shù)是結核感染的獨立危險因素。

雖然該地痰涂陰性群體的SM及EMB耐藥率均高于痰涂陽性群體,但只有EMB-R在痰涂陽性和痰涂陰性群體之間差異顯著,多因素回歸模型中痰涂陰性對結核耐藥風險增加的OR值比較接近于1,所以痰涂結果是否作為結核耐藥的危險因素,還有待在擴大標本量且排除抽樣偏倚等因素下再進一步考證。

多因素回歸模型顯示,男性、結核治療史、年齡<51歲及城市分布均是導致SM-R及EMB-R風險增加的因素。有學者表示結核耐藥風險與性別密切相關[10],有報道[11]則稱結核耐藥與性別無關。在該研究中,雖然男性對SM和EMB的耐藥率均高于女性,但其耐藥差異均無統(tǒng)計學意義,因此,性別是否能使結核耐藥風險增加,還需要進一步實驗數(shù)據(jù)的支持。SM和EMB耐藥率均出現(xiàn)在年輕的群體中(SM-R 31～35歲,EMB-R 21～25歲),年齡<51歲群體耐藥率高于年齡>50歲的群體,且年齡<51歲對SM-R和EMB-R的檢出均是危險因素,這與之前的研究[12]一致,但與安徽省及臺灣地區(qū)的耐藥性的年齡類別不一致[11,13],這說明通常被認為是低危人群的年輕人可能需要額外的耐藥結核檢測。該研究中由于年齡<15歲和年齡>85歲群體的結核耐藥性數(shù)據(jù)過少,該課題組將在今后的研究中進一步探究。

該地區(qū)SM耐藥機制復雜,其主要是rpsL 43和 rpsL 88突變引起的,其次是rrs 905～908,這與國內其他地方的報道[14]相似,另外還有部分SM-R是由rpsL聯(lián)合rrs突變引起,尤其是集中在rpsL 43、88位密碼子和 rrs 905～908位點的聯(lián)合突變。臨床上通常將embB 306作為 EMB 耐藥診斷標志物。在該地引起EMB-R的分子基礎主要是embB 306和embB 406的單基因突變,這與一些研究[15-16]結果相似。了解和阻斷rpsL 43、rpsL 48、rrs 905～908和embB 306的突變規(guī)律及傳播機制,對于阻止結核耐藥的發(fā)生及擴散都是十分重要且必須的。

該研究是首次較大范圍揭示該地區(qū)結核耐藥的分子基礎,可為后期探究耐藥結核的分子生物標志或者基因篩選提供初始數(shù)據(jù),另外對該地區(qū)結核病尤其是耐藥結核病的防治具有重要意義。研究未通過基因測序來進一步確認HRM檢測到的單個核苷酸突變多態(tài)性或與耐藥相關的多個突變的準確性,該課題組會在今后的研究中繼續(xù)探明。