陳阿圓,許 媛,許和鵬,魏 偉,常 艷

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性炎癥性疾病,其特征是關(guān)節(jié)腫脹、壓痛和滑膜關(guān)節(jié)破壞。犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)通路為色氨酸(tryptophan, Trp)代謝的主要途徑,與自身免疫病發(fā)病密切關(guān)聯(lián)[1]。研究[2-3]表明,RA患者血清和關(guān)節(jié)滑液中Kyn水平升高,且與患者疾病活動性和炎癥指標(biāo)相關(guān)。

色氨酸2,3-雙加氧酶2(tryptophan 2,3-dioxygenase, TDO2)作為Kyn通路的主要限速酶,對Trp催化具有高度專一性。TDO2主要在肝臟和大腦中表達(dá),本課題組前期研究[4]顯示TDO2在T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞中表達(dá)。近年來,TDO2作為神經(jīng)精神疾病、癌癥和自身免疫病治療的可能性潛在靶點(diǎn)引起了越來越多的關(guān)注[5],但目前TDO2在RA中的表達(dá)和作用研究未見報道。本課題組前期研究表明,抑制TDO2可緩解佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞[6],可能與TDO2介導(dǎo)成纖維樣滑膜細(xì)胞異?；罨嘘P(guān)。然而,在RA患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)和滑膜組織中TDO2的表達(dá)以及臨床意義尚不明確。該研究采用流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光法檢測TDO2在RA患者和健康人PBMC以及滑膜組織中的表達(dá),對RA患者PBMC中TDO2表達(dá)與其炎癥指標(biāo)之間進(jìn)行相關(guān)性分析,為初步探索TDO2在RA中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2021年4月—2022年4月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院診治的40例RA患者,年齡36～77(57.8±9.0)歲,男12例,女28例。RA組患者均符合2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會制定的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)[7],并排除其他自身免疫病、腫瘤等嚴(yán)重性疾病。正常對照組均為健康人,共36例,年齡23～75(53.4±10.9)歲,男14例,女22例,排除存在感染、腫瘤和其他免疫性疾病。正常對照組和RA組之間年齡和性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。收集RA組相關(guān)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)類風(fēng)濕因子 (rheumatoid factor, RF),C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)、抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體(anti-cyclic citrulline peptide,anti-CCP)、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)。本課題由安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:20210085)。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1主要試劑 Ficoll-Hypaque人淋巴細(xì)胞分離液購于上海達(dá)科為生物技術(shù)有限公司,固定液(Fixation/Perm Diluent 和 Fixation/Permeabilization Concentrate)和破膜液(Permeabilization Buffer 10×)購于美國Invitrogen公司;人源TDO2-APC 流式抗體購于美國R&D公司;TDO2(15880-I-AP)抗體購于中國武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;DAPI溶液和抗熒光衰減封片劑購自中國北京索萊寶公司;山羊抗兔IgGAF594購于中國上海Abmart醫(yī)藥科技有限公司。

1.2.2主要儀器 十色流式細(xì)胞儀(型號:Waters XEVO, TQ-S MS/MS)購于美國貝克曼公司;激光共聚焦顯微鏡(型號:Leica sp8)購于德國萊卡公司。

1.3 方法

1.3.1人PBMC的標(biāo)本采集與處理 用冰盒保存EDTA抗凝管收取的正常對照組和RA組外周血樣本,4 h內(nèi)用Ficoll-Hypaque人淋巴細(xì)胞分離液分離提取正常對照組和RA組的PBMC。

1.3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測PBMC中TDO2表達(dá) 顯微鏡下觀察提取的正常對照組和RA組PBMC細(xì)胞形態(tài),調(diào)整細(xì)胞密度為2×106,重懸于100 μl磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution, PBS)中。每管加入100 μl固定液,室溫避光孵育15 min。用PBS洗滌后,加入破膜液95 μl,室溫避光孵育10 min后,加入5 μl人源TDO2-APC流式抗體,4 ℃避光孵育30 min。PBS洗滌并重懸后,過200目紗網(wǎng)轉(zhuǎn)移至流式管中上機(jī)檢測并分析TDO2表達(dá)比例和平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity, MFI)。

1.3.3免疫熒光法檢測滑膜組織中TDO2表達(dá) 將取得的正常對照組和RA組滑膜組織固定、包埋和切片后,進(jìn)行脫蠟水化。4 ℃孵育一抗TDO2(1 ∶200)過夜。次日室溫避光孵育熒光二抗(山羊抗兔IgGAF594,1 ∶200)2 h,PBS洗滌3次后,室溫避光孵育DAPI 8 min。PBS洗滌3次,用抗熒光淬滅劑進(jìn)行封片,激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍片。

1.3.4Image J分析滑膜組織中TDO2 MFI 在免疫熒光染色中,單通道(單色)的熒光圖片每個像素的灰度值代表了該點(diǎn)的熒光強(qiáng)度大小,特定區(qū)域的熒光強(qiáng)度公式:平均熒光強(qiáng)度(mean gray value, Mean)=該區(qū)域熒光強(qiáng)度總和(integrated density, IntDen)/該區(qū)域面積(Area)。在Image J中打開拍攝好的圖片,圖片格式設(shè)置成8-bit,提取單一通道,調(diào)整圖片閾值,控制每張圖片的閾值在統(tǒng)一的范圍內(nèi),并選擇合適的閾值算法。設(shè)定檢測參數(shù)Mean、InDen、Area,最后分析Mean值,即TDO2 MFI。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果均用Mean±SEM表示。兩組數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較組間差異,采用Pearson和Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TDO2在RA患者PBMC中的表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明,與正常對照組相比,RA組PBMC中TDO2表達(dá)水平顯著升高,TDO2 MFI與正常對照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.920,P<0.001),見圖1。

圖1 RA患者PBMC中TDO2的表達(dá)

2.2 TDO2在RA患者滑膜組織中的表達(dá)在RA疾病進(jìn)程中,滑膜組織生理學(xué)功能被破壞,轉(zhuǎn)化為增生性侵襲組織。此外,滑膜組織中成纖維樣滑膜細(xì)胞功能異常和免疫細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)浸潤,導(dǎo)致軟骨和骨骼的破壞。免疫熒光結(jié)果顯示,TDO2在RA組滑膜組織中表達(dá)增加,MFI顯著高于正常對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.600,P<0.001),見圖2。

圖2 兩組滑膜組織中TDO2的表達(dá) ×630

2.3 RA患者PBMC中TDO2表達(dá)與炎癥指標(biāo)的關(guān)系為了研究TDO2表達(dá)與患者炎癥指標(biāo)之間的關(guān)系,對RA患者PBMC中TDO2表達(dá)與ESR、RF、CRP和anti-CCP之間進(jìn)行了相關(guān)性分析。Pearson分析結(jié)果顯示,RA組PBMC中TDO2表達(dá)與ESR呈正相關(guān)(r=0.405,P=0.045),見圖3A。而Spearman分析結(jié)果顯示,RA組PBMC中TDO2表達(dá)與RF、CRP和anti-CCP無顯著相關(guān)性(rs=0.359,P=0.078;rs=0.093,P=0.658;rs=-0.289,P=0.162),見圖3B-3D。

圖3 RA患者PBMC中TDO2表達(dá)與炎癥指標(biāo)的相關(guān)性分析(n=25)

3 討論

RA作為一種慢性自身免疫病,其臨床表現(xiàn)主要為晨僵/關(guān)節(jié)痛與壓痛/關(guān)節(jié)腫脹。慢性滑膜炎癥作為RA的主要病理特征,在晚期治療不足的情況下,最終形成軟骨破壞和骨侵蝕,從而出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形。Kyn通路作為Trp代謝的主要代謝途徑,在RA疾病進(jìn)程中可能發(fā)揮重要作用。研究[8]表明,在RA患者關(guān)節(jié)滑液和尿液中Kyn水平升高,提示Kyn通路在RA患者體內(nèi)代謝異常。Kyn通路在三種同工酶吲哚胺2,3雙加氧酶1(indoleamine-2,3-dioxygenase1, IDO1)、IDO2和TDO2的催化下,將Trp轉(zhuǎn)化生成Kyn。IDO1廣泛表達(dá)于組織、器官和細(xì)胞中,除Trp外,IDO1還可催化多種含吲哚結(jié)構(gòu)的底物。IDO2作為IDO1同源類似物(43%的同源性),主要表達(dá)于腎臟、大腦和附睪[9]。在RA疾病進(jìn)程中,IDO1的作用存在爭議,它既有促炎表現(xiàn)[10],也有抗炎作用[11]。IDO2在RA中的研究較少,近年來研究[12]顯示在RA中具有促炎作用。

Lanz et al[13]發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型小鼠中,肝臟TDO2表達(dá)和活性增加,從而激活脊髓神經(jīng)元的興奮性毒性受體,致使神經(jīng)變性和脫髓鞘。TDO2缺失的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠焦慮相關(guān)行為和神經(jīng)變性癥狀減輕,表明TDO2可能參與了自身免疫病疾病進(jìn)程。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),TDO2不僅在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞中表達(dá)增加,并且抑制TDO2的表達(dá)可抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[6,14],改善滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞,提示TDO2在RA機(jī)制中可能是一個新的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。為進(jìn)一步了解TDO2與RA之間的關(guān)系,本研究探討了TDO2在RA患者外周血和滑膜組織中的表達(dá)以及與炎癥指標(biāo)是否具有相關(guān)性。

本研究從臨床角度出發(fā),檢測RA患者和健康人PBMC中TDO2的表達(dá),結(jié)果顯示RA患者PBMC中TDO2表達(dá)顯著高于正常對照組,提示TDO2介導(dǎo)的Kyn代謝通路可能參與了RA炎癥免疫反應(yīng)。此外,在對RA患者PBMC中TDO2表達(dá)與炎癥指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn),RA患者PBMC中TDO2表達(dá)與炎癥指標(biāo)ESR呈正相關(guān)。滑膜組織主要由襯里層和襯里下層組成。在RA中,成纖維樣滑膜細(xì)胞功能異常致使襯里層擴(kuò)張?jiān)錾?大量免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞募集在襯里下層浸潤,產(chǎn)生大量促炎因子,最終導(dǎo)致持續(xù)性滑膜炎癥和軟骨、骨侵蝕[15]。免疫熒光結(jié)果顯示,TDO2在RA患者滑膜組織中表達(dá)增加,提示TDO2可能通過調(diào)控成纖維樣滑膜細(xì)胞和免疫細(xì)胞異?；罨?促進(jìn)慢性滑膜炎癥。

綜上所述,在關(guān)節(jié)損傷過程中,TDO2可能參與了RA的病理機(jī)制,介導(dǎo)持續(xù)性滑膜炎癥生成。TDO2介導(dǎo)的Kyn通路在RA中發(fā)生代謝失衡,并參與炎癥免疫反應(yīng)進(jìn)而促進(jìn)RA進(jìn)展。