黃紫薇,趙殿元,徐 龍,唐 麗,

肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSC)起源于胚胎發(fā)育期間的間皮細(xì)胞,位于肝竇的內(nèi)皮下間隙。其特征是存在含有維生素A的脂滴,表達(dá)卵磷脂視黃醇?；D(zhuǎn)移酶Lrat、結(jié)蛋白desmin等[1]。HSC、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSEC)、肝臟巨噬細(xì)胞(Kupffer cells, KC)、肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞(hepatocytes,HC)共同構(gòu)成肝臟四大細(xì)胞群體。Zhou et al[2]觀察到HSC與巨噬細(xì)胞借助集落刺激因子1、血小板衍生生長(zhǎng)因子作用的雙向環(huán)路穩(wěn)定細(xì)胞種群密度;Bonnardel et al[3]研究表明死亡的Kupffer細(xì)胞釋放的腫瘤壞死因子激活星狀細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,免疫細(xì)胞及其微環(huán)境間的相互作用正被研究者們大量區(qū)域化解析中。但由于HSC在肝臟中占比較低,直接分離純度不高等特點(diǎn),相關(guān)研究常常受限或者鑒定清晰度不高。該研究使用Cre-Loxp技術(shù),將H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠與LratCre小鼠進(jìn)行雜交產(chǎn)生新的轉(zhuǎn)基因小鼠,直接定位HSC本身,進(jìn)而研究肝臟中HSC的分布以及HSC和其他肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠(Strain NO.T006163),雌性LratCre小鼠(Strain NO. T006205),體質(zhì)量均為20～22 g,購自江蘇集萃藥康生物有限公司,所有小鼠均在北京生命組學(xué)研究所SPF級(jí)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng),經(jīng)單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC:20210528-18-MBL)。

1.1.2儀器與試劑 2720 Thermal Cycler PCR儀、凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司),Cryotome FSE型冰凍切片機(jī)(美國Thermo公司),超高分辨率共聚焦顯微鏡成像系統(tǒng)(日本Nikon公司),英國牛津儀器Imaris分析系統(tǒng)。Mouse Tail Direct PCR Kit(成都福際生物技術(shù)有限公司),PCR引物(北京華大基因),OCT包埋劑(日本Sakura公司),Hochest染色劑(賽默飛公司),磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)(北京酷來搏科技有限公司),Triton X-100緩沖液和Tween-20緩沖液(北京索萊寶科技有限公司),抗熒光淬滅封片劑(翌圣生物科技有限公司),三溴乙醇(德國Sigma公司)。抗體:desmin(英國艾博抗貿(mào)易有限公司),F4/80、CD31-AF647(美國BioLegend生物科技公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠的構(gòu)建及鑒定策略 F0代LratCre小鼠與H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠交配得子代F1(圖1)。

圖1 LratCre小鼠與H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠交配得到子代小鼠LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato的構(gòu)建策略

在2周齡時(shí)剪腳趾編號(hào),加入直接鼠尾PCR基因組提取試劑,裂解釋放基因組,PCR鑒定小鼠基因型。LratCre上游序列:5′-TGAGCCAAGCACTTTGGCTTC-3′;下游序列:5′-TCACATCCTCAGGTTCAGCAGG-3′;反應(yīng)體系:2 μl引物,2 μl蒸餾水,2 μl鼠尾DNA模板,6 μl Mix;反應(yīng)條件:94 ℃、3 min;94 ℃、30 s,60 ℃、30 s,72 ℃、30 s,35個(gè)循環(huán)數(shù);72 ℃、5 min,20 ℃、∞。將PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣于2.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,并顯影記錄。將PCR鑒定得的LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠及其同窩對(duì)照H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠留籠,3周齡時(shí)分籠處理,8周齡用作實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2.2肝臟切片樣本前處理LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato實(shí)驗(yàn)小鼠及其同窩對(duì)照H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠稱重,用1.2%三溴乙醇腹腔注射麻醉小鼠(500 μl/只)。深度麻醉后,將小鼠固定于解剖臺(tái)打開腹腔,在心尖處扎入針頭,快速注入0.01 mol/L PBS(pH 7.2～7.4)至肝臟變白,同時(shí)剪破下腔靜脈。用PBS緩沖液灌注約20 ml,取出整個(gè)肝組織,4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定12 h,之后依次在含15%、30%蔗糖的PBS溶液中沉糖12 h,OCT包埋并于-80 ℃冰箱保存。使用冰凍切片機(jī)切片(厚度30 μm),貼片,-20 ℃冰箱保存。

1.2.3免疫熒光法觀察肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞分布 準(zhǔn)備試劑:Triton X-100與PBS按照1 ∶500體積比配制(Buffer 1);Tween-20與PBS按照1 ∶500體積比配制(Buffer 2);Buffer 2中按以下終濃度加入其他試劑:甘氨酸(0.3 mmol/L)+牛血清白蛋白(1%)+二抗同源血清(10%)(Buffer 3),4 ℃保存。復(fù)溫:-20 ℃取出冰凍切片置于濕盒中,用組化筆圈出組織,PBS覆蓋組織切片,室溫10 min。通透:吸棄PBS,使用Buffer 1覆蓋組織切片,室溫30 min。封閉:吸走Buffer 1,使用Buffer 3覆蓋組織切片,室溫2 h。一抗染色:吸棄Buffer 3,將一抗抗體稀釋于Buffer 2中,覆蓋組織切片,封口膜封片,4 ℃染色12 h。洗滌:PBS洗3次,每次5 min。二抗染色:將二抗稀釋于Buffer 2中,室溫染色2 h。洗滌。Hoechst染細(xì)胞核,覆蓋組織切片,室溫染色10 min。洗滌:PBS洗3次,每次5 min。封片:滴加約30 μl抗熒光淬滅封片劑,蓋玻片封片,使用激光共聚焦顯微鏡拍照,每層間距1.6 μm,共掃描15層,厚度約24 μm。

1.2.4觀察肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞相互作用 應(yīng)用Imaris軟件對(duì)激光共聚焦拍攝原件進(jìn)行3D渲染,得到約300 μm×300 μm×24 μm的長(zhǎng)方體,通過“surface”還原展現(xiàn)細(xì)胞原有形態(tài),觀察其定位與分布,通過“position of surface statistics”得到x、y、z值。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠LratCre小鼠與H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠交配獲得16只子代小鼠。子代小鼠2周齡時(shí)剪腳趾編號(hào),提取基因組DNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增和電泳后,鑒定出LratCre小鼠4只(1、9、12、15),同窩對(duì)照小鼠WT小鼠5只(3、7、8、10、11)。已知LratCre擴(kuò)增條帶分子量約391 bp,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。根據(jù)構(gòu)建策略,表達(dá)LratCre的小鼠亦表達(dá)tdTomato,表示為L(zhǎng)ratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠,不表達(dá)LratCre的小鼠則表示為H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato。

圖2 子代小鼠LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato的基因型鑒定結(jié)果M:marker;1、3、7、8、9、10、11、12、15:實(shí)驗(yàn)小鼠腳號(hào)

2.2 HSC表達(dá)與共定位分析HSC屬于肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞,被LSEC和HC包圍。其形態(tài)不規(guī)則,胞體呈圓形或不規(guī)則形,數(shù)個(gè)星狀胞突的立體分布和伸展足以覆蓋整個(gè)肝竇微循環(huán)。desmin屬于第三類中間絲蛋白,是HSC標(biāo)記蛋白之一。經(jīng)過免疫熒光染色,可以看到H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato對(duì)照小鼠desmin標(biāo)記情況(圖3A),LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato實(shí)驗(yàn)小鼠desmin與tdTomato共標(biāo)記情況(圖3E)。Hochest染核(圖3B、3F);desmin+HSC在肝實(shí)質(zhì)中散在分布(圖3D、3H);對(duì)照小鼠不表達(dá)tdTomato(圖3C),實(shí)驗(yàn)小鼠tdTomato+可直觀表示HSC的分布與大小:多呈紅色不規(guī)則狀圓點(diǎn)樣分布,各點(diǎn)周圍分別存在無規(guī)律的紅色絲狀線條,符合HSC星狀胞突特征(圖3G)。

圖3 對(duì)照小鼠H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato、實(shí)驗(yàn)小鼠LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato的desmin染色情況

保留實(shí)驗(yàn)小鼠desmin與tdTomato共標(biāo)記視野,觀察二者共定位情況(圖3I)。借助Imaris軟件3D還原圖3I各細(xì)胞及標(biāo)志物形態(tài),可以看到,粉紅透明的不規(guī)則形狀代表tdTomato+表示的HSC,綠色散在的不規(guī)則橢圓體則為desmin標(biāo)記的HSC(圖3J)。截取諸多HSC中的一個(gè),統(tǒng)計(jì)其Imaris上位置參數(shù),分析共定位位點(diǎn)?？梢钥吹絫dTomato+HSC重心為X=19 450、Y=2 730、Z=2 068(圖3K);desmin+HSC重心為X=19 450、Y=2 726、Z=2 067(圖3L),綜上,基本認(rèn)定兩種標(biāo)記方法確認(rèn)的HSC為同一個(gè)細(xì)胞,HSC標(biāo)記的desmin與LratCre誘導(dǎo)的tdTomato+表達(dá)基本重疊,則LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato報(bào)告基因小鼠能夠特異性示蹤HSC。

2.3 LSEC、HSC表達(dá)與分布LSEC是高度特化的內(nèi)皮細(xì)胞,具有特征性的形態(tài)和功能,構(gòu)成網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)重要組成部分,形成肝臟中最小血管的內(nèi)層,即肝竇。CD31又名PECAM1,主要在胞質(zhì)表達(dá),可作為內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志。肝竇周隙分布的另一細(xì)胞類型HSC,通過釋放細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)等成分,可維持肝竇功能和肝臟堅(jiān)硬度。經(jīng)過免疫熒光染色,可看到LSEC的區(qū)域連結(jié)性分布(圖4D、4H);Hochest染核(圖4B、4F);相比對(duì)照小鼠H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato,實(shí)驗(yàn)小鼠LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato多tdTomato+紅色圓點(diǎn)樣分布(圖4C、4G);同時(shí)實(shí)驗(yàn)小鼠可以通過HSC自定位,觀察其與肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞之一的LSEC的交互與表達(dá)(圖4A、4E)。觀察實(shí)驗(yàn)小鼠CD31與tdTomato+二者相互作用情況(圖4I),可以看到HSC胞突纏繞在LSEC之間(圖4J),黃色信號(hào)即為L(zhǎng)SEC與HSC的重合位點(diǎn),信號(hào)的交疊暗示著兩種細(xì)胞類型存在著較為緊密的相互作用,為定位分析肝臟纖維化的產(chǎn)生與發(fā)展提供了思路。

圖4 對(duì)照小鼠H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato、實(shí)驗(yàn)小鼠LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato的CD31染色情況

2.4 KC、HSC表達(dá)與分布KC是肝竇狀隙的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞,也是肝內(nèi)重要的天然免疫細(xì)胞。Kupffer極化和HSC活化在慢性肝損傷炎癥和纖維化的始動(dòng)和持續(xù)過程中發(fā)揮重要作用。免疫熒光染色后研究KC、HSC的相互接觸與各自分布(圖5A、5E),可觀察到Hochest染核皆呈深藍(lán)色(圖5B、5F);F4/80+標(biāo)記的綠色KC在肝臟組織中散在分布,細(xì)胞形態(tài)多不規(guī)則(圖5D、5H);tdTomato+代表的HSC仍僅存在于LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato實(shí)驗(yàn)小鼠中(圖5G),H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato對(duì)照小鼠中不存在Tdtomato的特異性標(biāo)記(圖5C),進(jìn)一步證實(shí)小鼠模型構(gòu)建成功。且通過KC和HSC的紅綠信號(hào)共定位可以直接觀察到二者非實(shí)質(zhì)細(xì)胞間的相互作用(圖5I),KC、HSC間的包繞交聯(lián)是細(xì)胞通訊等功能得以發(fā)揮的基礎(chǔ)(圖5J),是研究細(xì)胞間表型、功能改變后細(xì)胞分布及相互作用的良好模型。

圖5 對(duì)照小鼠H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato、實(shí)驗(yàn)小鼠LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato的F4/80染色情況

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過LratCre小鼠與H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠雜交獲得了LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato實(shí)驗(yàn)小鼠和其同窩對(duì)照H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠,用于HSC與LSEC、KC的定位和互作研究,以及HSC自身熒光標(biāo)記蛋白desmin的共定位研究?？梢杂^察到:① HSC占肝臟細(xì)胞總數(shù)的5%～10%[4],多在肝竇間隙中分布,呈梭形或多邊形,常伸出數(shù)個(gè)星狀胞突包繞著肝血竇。desmin作為經(jīng)典的HSC表面標(biāo)志物之一,被Nitou et al[5]確定其在HSC表達(dá)。此外,HSC還伸出胞突與HC、鄰近的星狀細(xì)胞相接觸。② LSEC位于肝血竇表面,是肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞中數(shù)量最多的一種細(xì)胞,胞質(zhì)高表達(dá)CD31[6]。其缺少基底膜,具有窗孔結(jié)構(gòu)、細(xì)胞通透性較高等特點(diǎn),決定了LSEC與肝臟微環(huán)境中各類型細(xì)胞的緊密聯(lián)系[7],實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示部分HSC與LSEC存在空間的交聯(lián)情況。③ KC形態(tài)不規(guī)則,常以板狀或絲狀偽足附著在內(nèi)皮細(xì)胞表面或伸出偽足穿過內(nèi)皮細(xì)胞窗孔或內(nèi)皮細(xì)胞間隙伸至竇周隙[8],CD64、VSIG4和F4/80可作為成熟KC的表面標(biāo)志物?？芍庇^看到KC、HSC都定位在肝臟竇周隙,存在明顯的勾連纏繞,存在相互作用。④ desmin標(biāo)記的HSC與tdTomato標(biāo)記的HSC共定位一致,且亦可直觀看到tdTomato、desmin的信號(hào)交疊,但tdTomato標(biāo)記的還原度更勝于desmin的胞質(zhì)蛋白標(biāo)記,則說明了該工具鼠的適用性較好,清晰度較高。⑤ HSC、LSEC、KC三種細(xì)胞類型的免疫熒光染色結(jié)果中LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato實(shí)驗(yàn)小鼠的特定性表達(dá)tdTomato證實(shí)了該工具鼠構(gòu)建的成功與特異性。以上全部結(jié)果證實(shí)該報(bào)告基因小鼠可精確示蹤HSC的表達(dá)與分布,以及表示與KC、LSEC的良好作用關(guān)系。

HSC是肝臟纖維化、肝癌等發(fā)生發(fā)展的重要因素。慢性肝病期間,HSC激活并轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的過程,在實(shí)驗(yàn)和人類肝損傷中被認(rèn)為是肝纖維化的中心細(xì)胞驅(qū)動(dòng)程序[9]。然而,HSC的一般標(biāo)記的定義是相當(dāng)復(fù)雜的。實(shí)際應(yīng)用中,圍繞HSC自身標(biāo)志物展開的小鼠模型仍然較少,在之前的研究中,Collagen-driven Cre或者Wt1Cre不能追蹤肌成纖維細(xì)胞的特定細(xì)胞來源或間皮細(xì)胞,hGFAPCre小鼠不能有效標(biāo)記HSC或產(chǎn)生膠原的肌成纖維細(xì)胞[10],GFAPCre小鼠靶向HSC的水平較低,以及有關(guān)纖維化和HSC衰老在肝癌發(fā)生中的爭(zhēng)議較多[11]。最終有研究者借助LratCre的新轉(zhuǎn)基因小鼠,證明在中毒性、膽汁淤滯性和脂肪肝疾病模型中,HSC可產(chǎn)生82%～96%的肌成纖維細(xì)胞[10]。近期更有研究者證實(shí)LratCre小鼠交配Trp53fl/fl或Relafl/fl小鼠后,HSC中Trp53和Rela mRNA水平降低了93%～99%[12]。有關(guān)HSC的現(xiàn)有研究中,使用LratCre小鼠進(jìn)行HSC的敲除或追蹤等逐步成為研究者們的共識(shí)。

圍繞H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato報(bào)告基因小鼠,國內(nèi)研究應(yīng)用較少,劉慧 等[13]構(gòu)建Gad2tdTomato/non-Gad2ZsGreen小鼠用于示蹤全腦 γ氨基丁酸能神經(jīng)元分布及形態(tài)。本研究借助報(bào)告基因小鼠實(shí)現(xiàn)了HSC的靶向定位,對(duì)照小鼠H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato、實(shí)驗(yàn)小鼠LratCreH11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato與不含報(bào)告基因的正常小鼠相比,在體質(zhì)量、體長(zhǎng)等方面無明顯差異,但外部瞳孔、外耳廓、腳趾皮膚、尾巴皮膚等部位可觀察到綠光。打開腹腔后可以發(fā)現(xiàn)小鼠肌肉組織、心臟、肝臟、腎臟、腸等均呈現(xiàn)綠色,腸系膜熒光綠色尤為明顯。這些大體觀察現(xiàn)象與之前相關(guān)報(bào)道[14]一致。

Cre-Loxp系統(tǒng)生成的小鼠可提供組織或器官中細(xì)胞的信息,是了解組織發(fā)育、探索調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)的機(jī)制和疾病發(fā)生發(fā)展的強(qiáng)有力工具[15]?？偟膩碚f,LratCre小鼠與H11LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato小鼠的雜交構(gòu)建,既保證了HSC標(biāo)志物應(yīng)用的典型性,又實(shí)現(xiàn)了特異性的熒光表達(dá),可以用做HSC發(fā)育分化、穩(wěn)態(tài)維持及功能研究的工具鼠。