葛 瑤,王春燕,劉 琦,郭 靜,熊 兵,劉淑鵬,程忠平

自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞是一群CD3-CD56+的先天免疫淋巴細(xì)胞,可以快速識(shí)別并殺傷病變細(xì)胞[1]。近幾年國(guó)內(nèi)外關(guān)于NK細(xì)胞回輸所開(kāi)展的臨床實(shí)驗(yàn)有很多,研究的疾病主要包括血液系統(tǒng)腫瘤和實(shí)體瘤[2]。用于臨床回輸?shù)腘K細(xì)胞來(lái)源廣泛,包括外周血來(lái)源、臍帶血來(lái)源和細(xì)胞系來(lái)源的NK細(xì)胞[3]。其中,外周血來(lái)源的NK細(xì)胞獲取簡(jiǎn)單,操作方便。外周血來(lái)源的NK細(xì)胞培養(yǎng)方法主要有飼養(yǎng)層培養(yǎng)法和因子激活法。其中,飼養(yǎng)層培養(yǎng)法雖然其擴(kuò)增NK細(xì)胞的作用十分顯著,但是K562細(xì)胞作為異源性細(xì)胞,存在一定的輸入安全隱患[4]。因子激活培養(yǎng)法是通過(guò)使用含有白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-2等細(xì)胞因子的培養(yǎng)基激活擴(kuò)增NK細(xì)胞,安全性較高,但此NK細(xì)胞純度存在較大的個(gè)體差異,嚴(yán)重影響后續(xù)治療效果[5]。為了對(duì)體外培養(yǎng)的NK細(xì)胞純度進(jìn)行預(yù)測(cè),該研究探討了影響NK細(xì)胞體外培養(yǎng)純度的相關(guān)因素,構(gòu)建一種預(yù)測(cè)NK細(xì)胞純度的模型,為后續(xù)臨床診療方案的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 捐獻(xiàn)者資料收集2020年1月—2022年3月在上海市第十人民醫(yī)院門診部體檢并同意捐贈(zèng)外周血用于NK細(xì)胞體外培養(yǎng)的93例健康人群的信息,其中男性23例,女性67例;年齡20～73(52±9.16)歲。本研究中93例健康捐獻(xiàn)者無(wú)家族病史以及無(wú)傳染病、心腦血管疾病、肝腎疾病或免疫學(xué)疾病,同時(shí)剔除其他相關(guān)人群,如吸煙、酗酒、藥物濫用史、懷孕。本研究經(jīng)上海市第十人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):20K180),患者簽署知情同意書。

1.2 NK細(xì)胞的體外培養(yǎng)及純度檢測(cè)按照藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(good manufacturing practice of medical products, GMP)要求,抽取捐獻(xiàn)者40～50 ml的外周血,通過(guò)密度梯度離心法獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞和血漿,使用添加100 IU/ml激活因子的培養(yǎng)基和10%的自體血漿重懸細(xì)胞(細(xì)胞原始密度為2×106/ml)。培養(yǎng)第0～7天,使用添加激活因子的培養(yǎng)液激活細(xì)胞;培養(yǎng)第8～14天使用添加200 IU/ml IL-2的擴(kuò)增培養(yǎng)液擴(kuò)增細(xì)胞。培養(yǎng)第14天時(shí),采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫分子CD3、CD56的表達(dá)情況。通過(guò)檢測(cè)CD3-CD56+的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比,分析NK細(xì)胞純度。

1.3 臨床指標(biāo)收集捐獻(xiàn)者外周血采樣前的檢查數(shù)據(jù),共138項(xiàng)指標(biāo)。① 血常規(guī)指標(biāo)包括:紅細(xì)胞(red blood cell,RBC)、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞平均體積、平均血紅蛋白量、平均血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞分布寬度(red blood cell distribution width,RDW)、紅細(xì)胞分布寬度標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation of red blood cell volume distribution width,RDW-SD)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比(percentage of lymphocytes,LY%)、嗜酸粒細(xì)胞百分比(percentage of eosinophils,EOS%)、嗜堿粒細(xì)胞百分比、嗜酸粒細(xì)胞數(shù)(number of eosinophils,EOS)、嗜堿粒細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞百分比、單核細(xì)胞數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血小板平均體積、血小板壓積、血小板分布寬度(width of platelet volume distribution, PDW)。② 生化指標(biāo)包括:丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、總蛋白、球蛋白、葡萄糖(glucose, Glu)、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、鉀、鈉、氯、三酰甘油、尿酸、尿素氮、肌酐(creatinine, Cr)。③ 其他指標(biāo)包括:凝血功能指標(biāo)、淋巴細(xì)胞亞群(T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞)、甲狀腺功能指標(biāo)、免疫抗體指標(biāo)和腫瘤標(biāo)志物指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理將93例捐獻(xiàn)者的體檢指標(biāo)及NK細(xì)胞純度信息隨機(jī)排列,抽取77例作為訓(xùn)練集,16例作為測(cè)試集。對(duì)訓(xùn)練集中138項(xiàng)臨床檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),按照缺失值占比超過(guò)0.4的原則進(jìn)行刪除。使用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn),將剩余的63項(xiàng)臨床指標(biāo)納入單因素分析,篩選出影響NK細(xì)胞純度的變量。多因素分析采用step AIC函數(shù)進(jìn)行逐步回歸,篩得變量重新建立回歸模型。在測(cè)試集中,分析NK index模型預(yù)測(cè)純度與真實(shí)純度的相關(guān)性;再對(duì)訓(xùn)練集中的自變量進(jìn)行二分類處理,以NK細(xì)胞實(shí)際純度的中位值為截?cái)帱c(diǎn),分高低兩組,分析訓(xùn)練集和測(cè)試集受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)下面積(area under the curve,AUC)。數(shù)據(jù)采用R語(yǔ)言、Prism 8.0和Excel軟件進(jìn)行分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NK細(xì)胞純度分布NK細(xì)胞純度流式檢測(cè)結(jié)果顯示,93例健康捐獻(xiàn)者中,2例捐獻(xiàn)者NK的細(xì)胞純度在0.8以上,17例捐獻(xiàn)者NK細(xì)胞的純度分布在0.6～0.8,36例捐獻(xiàn)者NK細(xì)胞的純度在0.4～0.6之間,26例捐獻(xiàn)者NK細(xì)胞的純度分布在0.2～0.4之間,12例捐贈(zèng)者NK細(xì)胞的純度小于0.2。以上結(jié)果說(shuō)明在相同的因子誘導(dǎo)條件下,NK的細(xì)胞純度存在個(gè)體間的差異。

2.2 影響NK細(xì)胞純度的單因素分析單因素分析結(jié)果顯示,年齡、三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine,T3)、RDW、RDW-SD、Cr、LY%、Glu、EOS%、EOS和PDW與NK細(xì)胞體外培養(yǎng)純度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。散點(diǎn)圖(圖1)進(jìn)一步分析了年齡、T3、RDW、RDW-SD、Cr、LY%、Glu、EOS%、EOS和PDW與NK細(xì)胞純度之間的線性關(guān)系,除了LY%與NK細(xì)胞純度之間存在負(fù)相關(guān)線性關(guān)系,其他指標(biāo)均與NK細(xì)胞存在正相關(guān)線性關(guān)系。

圖1 臨床檢測(cè)指標(biāo)與NK細(xì)胞純度的線性關(guān)系圖

表1 影響NK細(xì)胞純度的臨床檢測(cè)指標(biāo)單因素分析

2.3 影響NK細(xì)胞純度的多因素分析及預(yù)測(cè)模型的建立多因素變量回歸分析顯示,RDW-SD(P<0.001)、PDW(P<0.001)、Glu(P<0.001)和T3(P<0.1 )為影響NK細(xì)胞純度的關(guān)鍵變量,并以這4個(gè)變量重新建立回歸模型,最終建立預(yù)測(cè)模型NK index=-164.557+2.544×RDW-SD +3.730×PDW+4.389×Glu+10.237×T3(R2=0.494,P<0.05)。

2.4 NK index模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的相關(guān)分析在測(cè)試集中,對(duì)NK index模型的預(yù)測(cè)純度與真實(shí)純度做線性相關(guān)分析(R=0.725,P=0.001),說(shuō)明NK index模型預(yù)測(cè)純度與真實(shí)純度之間存在較強(qiáng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2。

圖2 NK index 模型預(yù)測(cè)值與真實(shí)值的線性關(guān)系圖

2.5 NK index模型在訓(xùn)練集和測(cè)試集中ROC曲線分析利用AUC分析NK index模型對(duì)于NK細(xì)胞純度高低的預(yù)測(cè)能力。結(jié)果顯示,訓(xùn)練集中NK index模型的AUC為0.815(95%CI=0.753～0.915),見(jiàn)圖3;測(cè)試集中NK index模型的AUC為0.938(95%CI=0.82.41～1.00),見(jiàn)圖4,說(shuō)明NK index模型對(duì)NK細(xì)胞純度高低有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值。

圖3 訓(xùn)練集中NK index模型的ROC曲線

圖4 測(cè)試集中 NK index模型的ROC曲線

3 討論

在NK細(xì)胞的臨床回輸中,通常需要在體外擴(kuò)增出大量高純度的NK細(xì)胞。使用因子誘導(dǎo)法培養(yǎng)NK細(xì)胞時(shí),NK細(xì)胞的純度和數(shù)量總是存在較大的個(gè)體間差異。通過(guò)收集捐獻(xiàn)者的外周血進(jìn)行14 d的體外因子刺激培養(yǎng),統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示NK細(xì)胞純度在個(gè)體間差異較大。為了找到影響NK細(xì)胞純度的指標(biāo),該研究收集了常見(jiàn)的臨床指標(biāo),通過(guò)對(duì)納入的68項(xiàng)臨床指標(biāo)進(jìn)行單因素分析,結(jié)果顯示,年齡、T3、RDW、RDW-SD、Cr、LY%、Glu、EOS%、EOS和PDW與NK細(xì)胞純度有相關(guān)性。研究[6]表明,年齡的增加會(huì)降低固有免疫系統(tǒng)功能,但同時(shí)也會(huì)增加疾病的易感性。與成人相比,老年人的促炎細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子和IL-6更高,NK細(xì)胞的數(shù)量也呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)。本研究顯示,年齡的增加也會(huì)提高NK細(xì)胞純度,說(shuō)明年齡的增加可以促進(jìn)促炎因子的升高,進(jìn)而增加NK細(xì)胞純度。T3為主要發(fā)揮生物活性的甲狀腺激素,在固有免疫系統(tǒng)中具有促炎作用,可以促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖和活性[7]。本研究顯示T3在數(shù)值較高時(shí),對(duì)應(yīng)的NK細(xì)胞純度值也較大,說(shuō)明甲狀腺原氨酸可能會(huì)促進(jìn)NK細(xì)胞相關(guān)受體的活化與表達(dá)。RDW為紅細(xì)胞大小的變異系數(shù),RDW-SD為紅細(xì)胞分布曲線寬度的實(shí)際測(cè)量值,兩者被廣泛應(yīng)用于炎癥性疾病的臨床檢驗(yàn),與炎癥標(biāo)志物密切相關(guān),如C反應(yīng)蛋白、IL-6和腫瘤壞死因子。目前很多學(xué)者提出RDW可以作為預(yù)測(cè)多種疾病的參數(shù),RDW越高,預(yù)后越差[8]。Lochowski et al[9]研究提示,RDW-SD>43時(shí),可以作為非小細(xì)胞肺癌預(yù)后不良的獨(dú)立因素。在本研究中,RDW和RDW-SD與NK細(xì)胞純度呈現(xiàn)正相關(guān),提示RDW和RDW-SD的升高會(huì)促進(jìn)體內(nèi)炎性因子的升高,進(jìn)而促進(jìn)NK細(xì)胞數(shù)量和純度的提高。血清Cr作為最常用的腎臟功能的生物學(xué)標(biāo)志物,用來(lái)評(píng)估慢性腎病[10]。研究[11]表明,在慢性腎病的研究中,輕度尿毒癥患者可以通過(guò)增加NK細(xì)胞的百分比來(lái)影響NK細(xì)胞的功能。本研究顯示Cr與NK細(xì)胞純度呈現(xiàn)正向相關(guān)性,提示Cr作為NK細(xì)胞純度的預(yù)測(cè)因素可能具有重要意義。Glu是一種關(guān)鍵的細(xì)胞燃料, 通過(guò)分解可以產(chǎn)生能量分子,促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖和代謝[12],因此推測(cè)Glu通過(guò)產(chǎn)生能量分子,進(jìn)而提高NK細(xì)胞純度。PDW被定義為血小板大小異質(zhì)性的指標(biāo), 作為血栓炎癥條件的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因子的有效性[13],可能會(huì)促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖和活性作用,在本研究結(jié)果中,PDW可能通過(guò)促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖和活性,進(jìn)而提高NK細(xì)胞的純度。淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞都屬于白細(xì)胞的一部分。研究[14]表明LY%的高低與病情嚴(yán)重程度相關(guān),通常認(rèn)為人體抵御外來(lái)病毒的侵襲主要依賴T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫作用,說(shuō)明LY%的升高可能主要與T淋巴細(xì)胞的激活有關(guān)。在本研究結(jié)果中,LY%與NK細(xì)胞純度數(shù)值呈負(fù)相關(guān),說(shuō)明T淋巴細(xì)胞的大量激活可能會(huì)抑制NK細(xì)胞的體外增殖。有研究[15]表明嗜酸粒細(xì)胞主要合成、儲(chǔ)存和分泌細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子,說(shuō)明嗜酸粒細(xì)胞可能促進(jìn)NK細(xì)胞的激活和擴(kuò)增。在本研究結(jié)果中,嗜酸粒細(xì)胞與NK細(xì)胞純度呈正相關(guān),推測(cè)嗜酸粒細(xì)胞可能促進(jìn)NK細(xì)胞的激活和擴(kuò)增來(lái)提高NK細(xì)胞純度。

通過(guò)對(duì)多因素變量的分析,篩選出RDW-SD、PDW、Glu和T3作為NK細(xì)胞純度的預(yù)測(cè)因素,最終建立了能夠較好預(yù)測(cè)NK細(xì)胞純度的NK index模型。對(duì)于純度不能達(dá)到臨床回輸要求的個(gè)體,可以提前告知患者,從而大大縮減了培養(yǎng)的成本。因此,獲取臨床可用的、簡(jiǎn)便有效的指標(biāo)構(gòu)建NK細(xì)胞純度預(yù)測(cè)模型具有潛在的科研和社會(huì)應(yīng)用價(jià)值。

本研究通過(guò)收集常見(jiàn)的臨床指標(biāo)來(lái)分析影響NK細(xì)胞純度的因素,但由于該模型還存在一些不足:由于缺少免疫相關(guān)的指標(biāo),如IgM、IgG、干擾素和腫瘤壞死因子等。本研究對(duì)捐獻(xiàn)者的免疫狀態(tài)描述不夠全面,后續(xù)可進(jìn)一步探索以免疫學(xué)指標(biāo)為變量所構(gòu)建模型的預(yù)測(cè)價(jià)值。因此,需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量和臨床檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行研究,以得到更理想的預(yù)測(cè)模型。