謝絲雨,張 英,陳 繁

子癇前期是一種常見的妊娠特有的多系統(tǒng)疾病,它影響全世界1.5%～16.7%的孕婦[1]。正常成功妊娠依賴于母體的免疫耐受機制,抑制對胎兒和胎盤的不良免疫反應,并為胎兒生長發(fā)育提供營養(yǎng)支持[2]。正常妊娠的維持是由多種免疫細胞共同參與,傳統(tǒng)研究[3]認為,T細胞1/T細胞2(T helper 1/T helper 2,Th1/Th2)在維持正常妊娠起主要作用。而另一對輔助性T細胞,T細胞17/調節(jié)性細胞(T helper 17/tegulatory cells,Th17/Treg)在維持母嬰免疫耐受中發(fā)揮重要作用,研究[4]表明Th17/Treg失衡參與子癇前期的發(fā)病機制。白介素-23(interleukin-23,IL-23)作為促炎性細胞因子決定Th17細胞的致病性,而白介素-10(interleukin-10,IL-10)作為抑炎性細胞因子,可由Treg細胞分泌并反過來調節(jié)Treg細胞的數(shù)量,白介素-2受體(interleukin-2 recepter,IL-2R)作為白介素-2(interleukin-2,IL-2)的受體,在子癇前期患者體內表現(xiàn)出差異表達[5]。該研究通過測定子癇前期患者血清及胎盤蛻膜組織中Th17/Treg相關細胞因子的表達,進一步探究其在子癇前期的發(fā)病機制中的作用,并通過分析細胞因子的差異表達,以期尋找子癇前期生物標志物,對子癇前期早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象收集在安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2020年10月—2022年3月住院分娩孕婦80例,其中50例子癇前期孕婦,30例正常孕婦,所有參與患者均為剖宮產(chǎn)方式終止妊娠并均簽署知情同意書。子癇前期組納入標準:選取標準參照《婦產(chǎn)科學》第 9 版教材對子癇前期的診斷,即妊娠 20 周后出現(xiàn)收縮壓≥18.67 kPa和(或)舒張壓≥12 kPa,伴尿蛋白≥0.3 g/24 h,或隨機尿蛋白陽性。或雖無蛋白尿但合并下列任何一項者:血小板減少(血小板<100×109/L);肝功能損害(轉氨酶水平為正常值2倍以上);腎功能損害(血肌酐水平大于)0.11 mg/L或為正常值2倍以上;肺水腫;新發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙或視覺障礙。排除標準:妊娠血小板減少、妊娠糖尿病(血糖控制不佳)、妊娠肝內膽汁淤積癥以及慢性腎功能損害等疾病,以及近期存在感染性疾病或服用免疫相關藥物。本課題經(jīng)安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查通過(批號: P2020-12-22)。

1.2標本收集與處理① 血清標本的采集與處理:采集孕婦空腹肘靜脈血3 ml,室溫離心(3 000 r/min,15 min),收取上清液,分裝后置于-80 ℃冰箱中保存待檢。② 用于免疫組化檢測的胎盤及蛻膜組織的標本采集與處理:術中從胎盤母體面正中取1 cm×1 cm×1 cm大小新鮮組織,用PBS緩沖液漂洗去除血污后用10%甲醛溶液固定24 h后石蠟包埋保存?zhèn)溆?另外,取胎盤娩出后宮腔擦拭取出的蛻膜組織,同法保存?zhèn)溆?。?用于實時熒光PCR(QPCR)檢測的胎盤及蛻膜組織的標本采集與處理:術中收集胎盤及蛻膜組織用PBS緩沖液漂洗去除血污后浸泡5倍體積的RNAlater液中,4 ℃過夜,轉移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自 R&D system 公司;細胞微球芯片技術(CBA) Th1/Th2/Th17細胞因子試劑盒購于美國BD公司;抗體購自美國GeneTex公司,貨號如下:IL-23(GTX85496),IL-2R(GTX60792),IL-10(GTX632359);RNA快速提取試劑盒購自TIANGEN公司;組織RNAFixer儲存液購自北京普魯頓生物科技有限公司;引物由上海生工生物工程有限公司設計,并購自該公司。

1.4 ELISA法在進行ELISA 實驗前,將血清樣本置入冰上解凍,渦旋混勻;IL-2R:在每孔中添加100 μl的RD1-1稀釋液,標準孔中加入50 μl的標準品,實驗孔加入50 μl的血清樣本,向每孔加入 200 μl的IL-2R結合物,混勻后室溫孵育3 h。每孔加入350 μl的洗滌液,洗滌4次,最后一次洗滌完成后完全傾倒洗滌液,并用吸水紙擦干。再分別添加200 μl提前配好的顯色液,室溫避光孵化20 min,每孔中添加50 μl的終止液?；旌暇鶆颉L-23:在每孔中添加100 μl的RD1-22稀釋液,標準孔加入 100 μl標準品,實驗孔加入100 μl的血清樣本,室溫震動器上孵化2 h。每孔中加入350 μl的洗滌液,洗滌4次,最后一次洗滌完成后完全傾倒洗滌液,并用吸水紙擦干。每孔中加入200 μl提前配好的顯色劑,室溫振動器上孵化2 h。重復第三步洗滌后,每孔加入200 μl的IL-23結合物,在室溫下避光孵化30 min。每孔加入50 μl的終止液,混合均勻。酶標儀上立刻測定吸光度,根據(jù)標準孔計算標準曲線,根據(jù)標準曲線計算每個孔對應的濃度值。

1.5 細胞微球芯片技術(cell microsphere array,CBA)制備Th1/Th2/Th17細胞因子標準品,濃度按照說明書等比例配制,制備Th1/Th2/Th17細胞因子捕獲微球混懸液,將微球混勻后,每管加入 50 μl捕獲微球混懸液,再依次加入50 μl的 Th1/Th2/Th17 PE信號標記熒光抗體并混勻。每管加入50 μl相應的Th1/Th2/Th17細胞因子標準品稀釋液,及50 μl待檢測血清。在室溫避光孵育3 h后各管加入1 ml洗液,3 000 r/min離心5 min。棄上清液后各管加入300 μl洗液,重新懸浮微球,使用流式細胞儀分析樣本,根據(jù)檢測獲取的數(shù)據(jù),用CBA專用軟件自動繪制標準曲線,根據(jù)標準曲線自動計算出樣本中各細胞因子含量。

1.6 QPCR取保存于RNAlater液中的胎盤及蛻膜組織,嚴格按照動物組織RNA快速提取試劑盒說明書,提取組織中RNA并測定 RNA 濃度和純度;按照試劑盒說明書嚴格操作,將 RNA 逆轉錄合成 cDNA,引物序列見表1。PCR 反應體系為 20 μl,反應條件 95 ℃,30 s,95℃,5 s,60 ℃,34 s,40 個循環(huán);同時每個樣本設置復孔,采用2-ΔΔCt法計算IL-10、IL-23、IL-2R的表達水平,其中Ct值為循環(huán)閾值。

表1 細胞因子及內參引物序列

1.7 免疫組化將石蠟切片放置于60 ℃烤箱烤片30～60 min,而后依次將其放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min,乙醇溶液(濃度梯度高至低:100%、95%、80%、70%)浸泡各2 min,水洗5 min,PBS洗3次,5 min/次進行脫蠟及水化。用預熱的封閉通透液浸潤切片30 min,PBS洗3次;將切片浸入pH 6.0的檸檬酸鈉緩沖液,在微波爐里高火4 min至沸騰后,取出自然冷卻至室溫,重復2次,PBS洗3次。山羊血清 37 ℃封閉 1 h,輕輕甩去血清,一抗按照抗體說明書進行稀釋(IL-10按1 ∶500稀釋,IL-2R按照1 ∶500稀釋,IL-23按照5 μg/ml進行稀釋),陰性對照采用 PBS 代替一抗,4 ℃過夜。對圈內的組織滴加稀釋好的二抗,37 ℃孵育30 min,PBS洗3次,5 min/次。用DAB-H2O2顯色10 min;結果判定由本院病理科醫(yī)師閱片后判定。以細胞膜出現(xiàn)黃色棕褐色顆粒者為陽性細胞,根據(jù)每份標本中的陽性細胞染色強度所占百分比進行評定;采用 Image J 進行平均吸光度值分析。

2 結果

2.1 兩組孕婦一般臨床資料的比較對納入研究的兩組孕婦進行年齡、體質量指數(shù)(body mass index, BMI)、孕期體質量增長量、終止孕周、收縮壓、舒張壓、新生兒出生體質量、Apagar評分、隨機尿尿蛋白等臨床信息進行統(tǒng)計,見表2。

表2 兩組孕婦臨床參數(shù)比較

2.2 兩組血清IL-23、IL-10、IL-6、IL-2R表達水平比較IL-23、IL-6、IL-10 結果的數(shù)據(jù)資料顯示為非正態(tài)分布,其子癇前期患者血清中IL-23、IL-6、IL-10的濃度高于正常孕婦組,運用非參數(shù)檢驗曼-惠特尼U檢驗,兩組差異有統(tǒng)計學意義,結果見表3。IL-2R結果的數(shù)據(jù)資料顯示其為正態(tài)分布,子癇前期組為(700.37±212.85)pg/ml,正常孕婦組為(360.58±127.03)pg/ml,子癇前期患者血清中IL-2R的濃度高于正常孕婦組,差異有統(tǒng)計學意義(t=6.250,P=0.001)。

表3 兩組血清IL-23、IL-10、IL-6表達水平比較[pg/ml,P50(P25～P75)]

2.3 兩組胎盤組織中IL-10、IL-23、IL-2R mRNA的表達在子癇前期組胎盤組織中,IL-10表達較正常孕婦組明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而IL-2R在子癇前期組胎盤組織中表達升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);IL-23在子癇前期組胎盤組織中表達降低,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1A-1C。

圖1 IL-10、IL-23、IL-2R mRNA在子癇前期和正常孕婦胎盤蛻膜中的表達A、B、C:胎盤;D、E、F:蛻膜;與正常孕婦組比較:*P<0.05,***P<0.001

2.4 兩組蛻膜組織中IL-10、IL-23、IL-2R mRNA的表達在子癇前期組胎盤組織中,IL-10表達較正常孕婦組明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而IL-2R在子癇前期組胎盤組織中表達升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);IL-23在子癇前期組胎盤組織中表達降低,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1D-1F。

2.5 IL-10、IL-23、IL-2R在胎盤中的表達IL-10在正常孕婦胎盤中表達高于子癇前期組孕婦,通過測量平均吸光度值進行比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=-3.134,P=0.014)。IL-23在子癇前期患者胎盤中表達高于正常孕婦組,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.217,P=0.008);IL-2R在子癇前期患者胎盤中表達高于正常孕婦組,差異有統(tǒng)計學意義(t=3.421,P=0.003)。見圖2。

圖2 免疫組化檢測子癇前期和正常孕婦中IL-10、IL-23、IL-2R的表達 ×40

2.6 IL-10、IL-23、IL-2R在蛻膜中的表達IL-10在正常孕婦蛻膜中表達高于子癇前期組孕婦,通過測量平均吸光度進行比較,差異有統(tǒng)計學意義(t=-3.062,P=0.012);IL-23及IL-2R在子癇前期患者與正常孕婦蛻膜中表達差異無統(tǒng)計學意義。見圖2。

3 討論

免疫系統(tǒng)通過自我調節(jié)來維持正常妊娠過程,傳統(tǒng)研究認為Th1/Th2在整個妊娠期發(fā)揮主要作用,Th17/Treg軸彌補了單一Th1/Th2軸的不足。在正常妊娠期間,為了調節(jié)孕婦對胎兒免疫耐受反應,母體胎盤蛻膜及外周血中Treg細胞數(shù)量顯著增加。然而Th17細胞過度激活高表達促炎因子則會進一步招募免疫效應細胞,從而導致一系列炎癥性疾病,如子癇前期等[6]。

子癇前期的發(fā)病機制目前尚不明確,而輔助性T細胞在子癇前期患者的免疫調節(jié)中起到核心作用[7]。子癇前期患者外周血中Th17細胞百分率及Th17/Treg比值明顯高于正常孕婦[8],外周血中促進Th17細胞生成的細胞因子也呈升高趨勢,而與Treg生成的相關細胞因子呈下降趨勢,Treg細胞下降并向Th17細胞偏移會導致子癇前期[9]。在子癇前期患者表現(xiàn)出臨床癥狀之前,已存在輔助性T細胞以Treg向Th17分化增多,并伴隨相關細胞因子的變化,細胞因子通常分為促炎因子和抗炎因子,并與表達他們的Th細胞亞群相關聯(lián),Th17及Treg都有其特定的細胞因子譜,由這些輔助性T細胞亞群產(chǎn)生的細胞因子在免疫細胞分化和效應細胞反應中起重要作用。

IL-6、IL-23是誘導T細胞分化為Th17細胞必須的,IL-23對Th17起到穩(wěn)定活化及擴增的作用,IL-23能將CD4(+)T細胞誘導為高致病性Th17,阻斷IL-23能夠有效抑制如子癇前期等疾病的發(fā)生及進展[10]。IL-10具有強大的抗炎效應,不僅可以影響Th17細胞的分化,IL-10同樣是Treg細胞發(fā)揮抗炎作用并維持動態(tài)平衡所必須的[11]。

IL-2R即白細胞介素2受體,介導了IL-2的作用,它與血清中的IL-2結合抵消了細胞因子與細胞表面受體的結合,影響了白介素特異性的細胞反應。在子癇前期以及多種妊娠期疾病中均有較高的表達[12]。

本研究通過測定子癇前期和正常孕婦血清及胎盤蛻膜組織中Th17/Treg相關性細胞因子的濃度,進一步分析Th17/Treg細胞軸在子癇前期發(fā)病機制中所起的作用。本研究中子癇前期組外周血中IL-10、IL-6、IL-23、IL-2R濃度明顯高于正常孕婦組,IL-23、IL-6作為炎性細胞因子,是促進Th17分化及誘導其致病性的關鍵細胞因子,其濃度升高提示子癇前期組患者外周血中Th17細胞占主導地位,以炎癥反應為主。IL-10作為一種抗炎性細胞因子,其在子癇前期組表達上升,與傳統(tǒng)觀點不符,由于子癇前期患者往往終止孕周較小,而IL-10在外周血中的含量受到孕周影響[13],因此孕周差異可能是導致結果與其他學者結論不一致的原因,需要擴大樣本量來驗證。子癇前期患者往往在表現(xiàn)出臨床癥狀之前,已出現(xiàn)特殊標志物改變,研究[14]表明IL-2R可在子癇前期患者體內表現(xiàn)出差異表達。本研究中子癇前期患者血清中IL-2R水平明顯高于正常孕婦組,作為免疫細胞激活標志物,其含量明顯上升,可通過進一步研究子癇前期嚴重程度與IL-2R表達水平是否存在相關性,來檢驗其能否作為子癇前期診斷以及分類的重要指標。

QPCR結果提示IL-10 mRNA在子癇前期組胎盤及蛻膜中明顯低于正常孕婦組,進一步免疫組化驗證結果與QPCR一致。這與傳統(tǒng)研究認為IL-10作為Treg相關細胞因子,與Treg細胞數(shù)量下降相符。作為一種抗炎性細胞因子,其表達含量在子癇前期中下降,提示Treg細胞被抑制,體內存在抗炎與抑炎反應失衡,可能是導致胎盤功能受損的原因之一。子癇前期患者胎盤及蛻膜組織中IL-23表達差異與血清中不同。IL-23在子癇前期患者胎盤及蛻膜組織中表達情況尚不明確[15],IL-23作為Th17致病性的關鍵性細胞因子在子癇前期患者胎盤及蛻膜組織中表達升高。而本研究胎盤及蛻膜組織中IL-23 mRNA的表達水平差異無統(tǒng)計學意義,進一步通過免疫組化法檢測Th17相關細胞因子IL-23的表達,結果顯示與正常孕婦相比,子癇前期組胎盤中IL-23表達含量增多,提示Th17細胞數(shù)量增多可能導致IL-23表達升高,而本研究QPCR結果在兩組中表達無差異,提示胎盤及蛻膜組織中可能存在其他細胞因子影響IL-23的表達。IL-2R作為T淋巴細胞激活的標志物,其表達含量在胎盤蛻膜中均呈現(xiàn)上升趨勢。這種差異表達可以進一步為評估子癇前期發(fā)病機制及進展提供思路。而免疫組化結果提示胎盤中子癇前期組表達增多,與QPCR結果一致,而蛻膜中兩組差異無統(tǒng)計學意義,可能與蛻膜組織難以處理有關。

綜上所述,在子癇前期與正常孕婦的體內,Th17/Treg相關細胞因子存在差異表達,促炎因子IL-23表達含量的改變與子癇前期中Th17細胞活化、炎癥過度激活有關。IL-10作為抑炎性細胞因子,與Treg數(shù)量下降有直接關系,進而參與子癇前期的發(fā)病機制。本研究中IL-2R在子癇前期中表達水平存在明顯差異,證明其表達增多參與子癇前期的發(fā)病機制,而這種差異表達可將其作為預測并診斷子癇前期重要標志物,為早診斷、早期發(fā)現(xiàn)子癇前期提供新思路。