王 剛,李 思,吳雨峰,吳明月

鈦金屬及合金由于其優(yōu)良的生物相容性和機(jī)械性能,已被廣泛應(yīng)用于口腔種植領(lǐng)域,但是鈦金屬表面屬于生物惰性材料,影響了臨床骨結(jié)合的速度和質(zhì)量[1]。研究[2]顯示,對(duì)鈦種植體表面進(jìn)行生物化改性,可使其獲得更好的骨誘導(dǎo)性,植入機(jī)體后能主動(dòng)與周圍骨組織特異結(jié)合,促進(jìn)骨結(jié)合,實(shí)現(xiàn)早期良好的種植體穩(wěn)定性。

緩釋系統(tǒng),是指通過(guò)一定方法將生物因子與種植體表面緩釋載體結(jié)合并植入體內(nèi)時(shí),可使該生物因子持續(xù)釋放延長(zhǎng)其作用時(shí)間。層層自組裝( layer-by-layer self-assembly,LbL) 是 Decher et al[3]于20世紀(jì)90年代所提出的一種在材料表面通過(guò)交替吸附帶相反電荷的聚電解質(zhì)以形成自組裝多層聚電解質(zhì)復(fù)合物(polyelectrolyte complex, PEC)薄膜的方法,通過(guò)LbL技術(shù)所形成的多層膜結(jié)構(gòu)可作為生物因子的緩釋載體[4]。該研究通過(guò)LbL技術(shù)將海藻酸鈉、殼聚糖交替吸附沉積于鈦種植體表面,形成聚電解質(zhì)多層膜結(jié)構(gòu)并裝載成骨細(xì)胞特異性多肽,構(gòu)建其緩釋系統(tǒng),評(píng)價(jià)其緩釋效應(yīng),為鈦種植體表面生物化改性研究提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 鈦片(陜西省寶雞市泰宇鑫金屬材料有限公司);氫氧化鈉(合肥諾一生物科技有限責(zé)任公司);異硫氰酸(fluorescein isothiocyanate,FITC)熒光標(biāo)記的成骨細(xì)胞特異性識(shí)別多肽(上?？齐纳锟萍加邢薰?;羥甲基殼聚糖、藻酸鈉、賴氨酸(合肥苗茁生物科技有限公司);其余一般試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,且試劑均為分析純。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器 Sirion-500場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(美國(guó)FEI公司FESEM);X射線光子能譜儀、傅里葉紅外光譜(美國(guó)Thermo-VG Scientific 公司);接觸角測(cè)量?jī)x(成德市成慧實(shí)驗(yàn)機(jī)器有限責(zé)任公司);UV-1800可見(jiàn)光分光光度計(jì)(日本島津公司)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1鈦表面堿熱處理 將純度99.99%、厚度0.3 mm、直徑15 mm圓形成品鈦片經(jīng)400、600、800、1 000、1 200目金剛砂紙打磨光滑后,依次放入丙酮、75%乙醇溶液、去離子水中,各超聲清洗20 min。干燥后放入濃度為5.0 mol/L氫氧化鈉溶液中,烘箱中60 ℃恒溫浸泡24 h,取出鈦片,用去離子水清洗、烘干;再將鈦片加熱到200 ℃保溫2 h,自然冷卻,獲得堿熱處理鈦片,備用。

1.2.2鈦表面組裝PEC多層膜結(jié)構(gòu) 將堿熱處理后的鈦片放入濃度為2.5 mg/ml多聚賴氨酸溶液中浸泡30 min,0.9%生理鹽水漂洗3次,60 ℃恒溫箱烘干10 min,從而在鈦表面獲得一層穩(wěn)定的帶正電荷薄膜,并以此作為層層自組裝的啟動(dòng)基礎(chǔ);將烘干后鈦片放入濃度為5 mg/ml海藻酸鈉溶液中浸泡30 min,取出鈦片漂洗干燥,使其表面吸附一層帶負(fù)電荷的薄膜;隨后將其浸入5 mmol/L的氯化鈣溶液10 min,對(duì)海藻酸鈉進(jìn)行交聯(lián),漂洗干燥;最后將鈦片置入1 mg/ml殼聚糖溶液10 min,漂洗干燥,鈦表面再次吸附一層正電荷薄膜。以上步驟循環(huán)操作10次,最終獲得理想的多層聚電解質(zhì)復(fù)合物多層膜,最外層為殼聚糖。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為3組:光滑鈦片組(Ti組),堿熱處理組(PTi組),堿熱處理-海藻酸鈉/殼聚糖組(PTi/PSC組)。

1.2.4復(fù)合特異性多肽緩釋結(jié)構(gòu)的制備 將上述3組樣品完全浸入濃度為10-5mol/L成骨細(xì)胞特異性識(shí)別多肽溶液中,浸泡 2 h后,取出鈦片,去離子水沖洗,干燥,備用。

1.2.5樣品表征及緩釋檢測(cè) SEM觀察各組樣品表面形貌;測(cè)量材料表面接觸角分析親水性;FTIR、XPS及熒光顯微鏡對(duì)樣品表面成分進(jìn)行分析;紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣品表面成骨細(xì)胞特異性識(shí)別多肽的釋放曲線(將上述3組樣品置于12孔板中,并分別加入1 ml PBS緩沖液,將孔板固定于恒溫?fù)u床,溫度恒定為37 ℃,于1、2、4、8、12、24 h和2、3、4～7 d分別取出200 μl釋放液以檢測(cè)特異性多肽濃度,然后向孔板中重新加入200 μl PBS緩沖溶液)。

2 結(jié)果

2.1 鈦表面形貌特征掃描電鏡顯示:Ti組表面呈光滑鏡面狀,見(jiàn)圖1A;堿熱處理后PTi組表面呈粗糙多孔狀,見(jiàn)圖1B;構(gòu)建多層膜結(jié)構(gòu)后PTi/PSC組表面呈多孔狀,且部分孔隙被充填,形成一層不均勻膜性結(jié)構(gòu),見(jiàn)圖1C,該膜性結(jié)構(gòu)放大至60 000倍顯示為類似立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),見(jiàn)圖1D。

圖1 鈦表面形貌

2.2 材料表面親水性分析Ti組接觸角較大,顯示出一定疏水性能,見(jiàn)圖2A;相較于Ti組,PTi組材料表面接觸角明顯減小,親水性增強(qiáng),見(jiàn)圖2B;加載多層膜后,PTi/PSC組接觸角較PTi組大,小于Ti組,親水性相較于PTi組有所下降,但較Ti組仍明顯改善,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=162.38,P<0.05),見(jiàn)圖2C。各組樣品接觸角角度見(jiàn)表1。

表1 樣品表面接觸角角度

圖2 接觸角測(cè)量圖片A:Ti組;B:PTi 組;C:PTi/PSC組

2.3 X射線光電子能譜分析結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)堿熱處理后 Ti 的特征峰強(qiáng)度下降,表明鈦表面形成二氧化鈦薄膜,見(jiàn)圖3A、3B;PTi/PSC組可見(jiàn) Ti 2p減少和 N1s峰出現(xiàn),表明海藻酸鈉和殼聚糖已成功修飾鈦表面,見(jiàn)圖3C;在400 eV,多肽修飾組N1s峰升高表明特異性多肽已成功搭載至殼聚糖-海藻酸鈉聚合多層膜內(nèi),見(jiàn)圖3D。

圖3 XPS分析圖譜A: Ti組;B: PTi 組;C: PTi/PSC組;D: 多肽修飾組

2.4 傅里葉紅外光譜檢測(cè)結(jié)果與Ti組相比,PTi組FTIR光譜于3 000～3 500 cm-1處出現(xiàn)寬峰,該吸收峰是鈦片堿熱處理后所形成的弱堿性鈦酸鹽上羥基伸縮震動(dòng)造成的,表明堿熱處理后鈦表面出現(xiàn)了-OH特征官能團(tuán);PTi/PSC組在1 620 cm-1、1 403 cm-1處出現(xiàn)吸收峰,見(jiàn)圖4A,表明在鈦表面已成功構(gòu)建殼聚糖-海藻酸鈉多層膜結(jié)構(gòu)。搭載特異性多肽后,當(dāng)吸收波為1 630 cm-1時(shí),PTi/PSC組的波峰與標(biāo)準(zhǔn)多肽基本一致,證實(shí)特異性多肽已成功搭載于鈦基材表面,見(jiàn)圖4B。

圖4 FTIR檢測(cè)結(jié)果A-a:Ti組;A-b:PTi 組;A-c:PTi/PSC組; B-d:多肽修飾組;B-e:多肽標(biāo)準(zhǔn)光譜

2.5 免疫熒光分析3組材料表面均可見(jiàn)不等量的熒光,Ti組材料表面見(jiàn)極少量熒光分布;PTi組及PTi/PSC組表面熒光分布量較Ti組明顯增多,其中PTi/PSC組表面熒光分布量最多且均勻,證實(shí)已成功于鈦表面固定目的多肽,見(jiàn)圖5。

圖5 熒光分析圖片 ×200A: Ti組;B: PTi 組;C: PTi/PSC組

2.6 多肽釋放量分析由釋放曲線可見(jiàn):多肽的釋放量隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加,釋放速度逐漸減慢。最初24 h時(shí)內(nèi),多肽釋放量迅速增加,其中Ti組最少且后續(xù)未見(jiàn)明顯上升,表明24 h基本完全釋放;PTi組多肽釋放速度及釋放量介于Ti組與PTi/PSC組之間,持續(xù)釋放至第4天;PTi/PSC組多肽釋放過(guò)程持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng),至第7天釋放量仍持續(xù)增加,緩釋效果較其他兩組更為理想,見(jiàn)圖6。

圖6 特異性多肽釋放曲線

3 討論

鈦種植體表面改性的方法主要有物理方法、化學(xué)方法和生物學(xué)方法,其中運(yùn)用生物學(xué)技術(shù)對(duì)種植體表面進(jìn)行生物化改性成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[5]。概括而言,生物化改性就是通過(guò)組織工程學(xué)方法,將具有特異性識(shí)別功能的生物活性因子吸附到材料表面,形成一個(gè)與生物活體相適應(yīng)的材料表面過(guò)渡層以控制骨整合的過(guò)程,該方法具備如下優(yōu)點(diǎn):① 可利用的生物活性分子有多種,包括膠原、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞自分泌胞外全基質(zhì)、細(xì)胞識(shí)別短肽、釉原蛋白等;② 通過(guò)一定的方法,采用生物可降解材料在鈦表面構(gòu)建載負(fù)生物活性分子的微結(jié)構(gòu),形成具備較好骨誘導(dǎo)性的種植體表面結(jié)構(gòu),促進(jìn)骨結(jié)合[2,6]。本研究所選擇的生物活性分子為人成骨細(xì)胞特異性識(shí)別多肽,是通過(guò)噬菌體展示技術(shù)及噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)篩選方法,獲得的特定多肽結(jié)構(gòu),為課題組前期研究成果,且經(jīng)體內(nèi)、體外系列研究均證實(shí)該多肽結(jié)構(gòu)可以顯著促進(jìn)骨結(jié)合[7-9]。

如何將生物活性分子與種植體結(jié)合,在鈦種植體表面構(gòu)建目的因子的緩釋系統(tǒng)并充分發(fā)揮其活性,是鈦種植體表面生物化改性研究的重要環(huán)節(jié)。緩釋系統(tǒng)可以模擬體內(nèi)環(huán)境,將活性因子與緩釋載體結(jié)合后植入體內(nèi)以持續(xù)保持其活性并延長(zhǎng)其作用時(shí)間,維持生物活性分子最佳的生物學(xué)功能。緩釋系統(tǒng)的功能有如下三個(gè)方面:① 可載負(fù)生長(zhǎng)因子并使之與周圍組織均勻接觸;② 對(duì)周圍細(xì)胞的增殖分化具備誘導(dǎo)功能;③ 作為支架結(jié)構(gòu)以促進(jìn)組織生長(zhǎng)[10]。目前,在鈦種植體表面吸附和釋放生物大分子的方法主要包括:物理吸附法、化學(xué)固定法、載體法[11]以及層層自組裝法。其中,層層自組裝法是目前在材料表面構(gòu)建生物因子緩釋系統(tǒng)應(yīng)用較多較為成熟的方法,已成功應(yīng)用于有機(jī)材料及金屬無(wú)機(jī)材料的表面改性研究[12]。該方法具有如下優(yōu)點(diǎn):① 不受基材形狀的限制,制備條件簡(jiǎn)單溫和且緩釋薄膜具有較高的熱力學(xué)穩(wěn)定性;② 緩釋效果顯著,可通過(guò)調(diào)節(jié)涂層循環(huán)次數(shù)以控制涂層的量并由此實(shí)現(xiàn)對(duì)目的因子載負(fù)量的可控。因此,本研究采用LbL技術(shù)在鈦種植體表面構(gòu)建聚電解質(zhì)多層膜結(jié)構(gòu)。鈦片經(jīng)過(guò)堿熱處理后,表面富含帶負(fù)電荷的Ti-OH基團(tuán)的鈦酸鈉凝膠,由此可作為層層自組裝的啟動(dòng)基礎(chǔ)[13],聚賴氨酸溶液浸泡后,在Ti-OH基團(tuán)的作用下,使鈦表面獲得一層穩(wěn)定的正電荷薄膜,此時(shí)再將海藻酸鈉、殼聚糖在鈦表面進(jìn)行交替吸附沉積,最終獲得理想的聚電解質(zhì)復(fù)合物多層膜,在此多層膜基礎(chǔ)上搭載多肽,如此成功實(shí)現(xiàn)鈦種植體表面對(duì)特異性多肽良好的緩釋效應(yīng)。由釋放曲線可見(jiàn):光滑鈦片組多肽突釋明顯,釋放速度最快,在24 h內(nèi)幾乎釋放殆盡;堿熱處理組樣品所吸附多肽釋放較光滑組變慢且持續(xù)時(shí)間也較長(zhǎng);相比之下,層層自組裝組樣品在3組中對(duì)多肽的緩釋效果最為理想,其釋放速度明顯慢于前兩組,雖然在前24 h內(nèi)也有部分突釋,但后續(xù)釋放隨之減緩且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),延續(xù)至第7天仍可見(jiàn)多肽釋放,由此可見(jiàn),層層自組裝組樣品對(duì)多肽的緩釋效果最為理想。究其原因,主要是層層自組裝樣品的制備有別于前兩組,首先是在堿熱處理的基礎(chǔ)上,形成多孔的鈦表面結(jié)構(gòu),相較于光滑表面,該多孔結(jié)構(gòu)可吸附一定量的多肽;其次,因?qū)訉幼越M裝樣品制備的多個(gè)循環(huán),可以盡可能多的將多肽吸附在多層膜內(nèi);再者,層層自組裝的多層膜結(jié)構(gòu)具備良好的熱力學(xué)穩(wěn)定性以及半透膜性,由此,可實(shí)現(xiàn)載負(fù)多肽量較好的穩(wěn)定性及可控性,且3組樣品中其緩釋效果最佳。

研究[14]表明,生物因子的緩釋系統(tǒng)應(yīng)該具備以下標(biāo)準(zhǔn):緩釋系統(tǒng)載體及其降解產(chǎn)物應(yīng)為生物可吸收材料,可抑制各種病理過(guò)程,便于使用且無(wú)菌半透,有利于愈合與再生且可以作為新生組織的結(jié)構(gòu)支撐。殼聚糖、海藻酸鈉是天然多糖類高分子聚合物,具備良好的生物相容性、易生物降解性及可加工成型性,目前被廣泛應(yīng)用于骨組織工程領(lǐng)域支架材料的制備[15]。由于海藻酸鈉的分子鏈上有大量的羧基,殼聚糖分子鏈上有大量的伯氨基,因此,可以通過(guò)正負(fù)電荷的吸引形成殼聚糖和海藻酸鈉相互吸附的聚電解質(zhì)膜結(jié)構(gòu)[16],此類膜結(jié)構(gòu)可作為生物因子的釋放載體,因此,本研究采用殼聚糖和海藻酸鈉作為構(gòu)建緩釋系統(tǒng)的基本材料。 SEM結(jié)果顯示:PTi/PSC組表面形成一層不均勻的膜性結(jié)構(gòu),經(jīng)放大后顯示為類似立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);XPS結(jié)果也證明海藻酸鈉-殼聚糖多層膜已成功修飾鈦表面(圖3C)。以此多層膜結(jié)構(gòu)作為載體,構(gòu)建載負(fù)成骨細(xì)胞特異性識(shí)別多肽的緩釋系統(tǒng),XPS圖譜見(jiàn)400 eV處多肽組N1s峰明顯升高(圖3D),同時(shí)FTIR光譜顯示,吸收波為1 630 cm-1時(shí)多肽修飾組波峰與標(biāo)準(zhǔn)多肽基本一致,均表明特異性多肽已成功復(fù)合至殼聚糖-海藻酸鈉多層膜內(nèi)(圖4B)。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)在鈦種植體表面成功構(gòu)建具備良好緩釋效應(yīng)的多肽緩釋系統(tǒng)。

本研究依據(jù)生物材料表面改性理論,運(yùn)用靜電自組裝技術(shù),選擇天然可生物降解材料海藻酸鈉以及類似于細(xì)胞外多糖的天然氨基多糖殼聚糖作為生物涂層的基本成分,在活化(堿熱處理)的鈦種植體表面進(jìn)行細(xì)胞外基質(zhì)化的構(gòu)建,形成多層膜結(jié)構(gòu),同時(shí)利用此多層膜裝載成骨細(xì)胞特異性識(shí)別多肽,由此構(gòu)建成骨細(xì)胞特異性多肽的緩釋系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)對(duì)生物涂層量的可控和生物活性分子的緩釋,本研究構(gòu)建的鈦種植體表面緩釋涂層的生物學(xué)效應(yīng)尚有待相關(guān)的體外體內(nèi)系列實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。