李 輝,黃俊峰,周 靜,周廷棟,陳禮文

根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示,2020年中國肺癌新發(fā)病例82萬例,占新發(fā)癌癥的17.9%,肺癌死亡71萬例,占癌癥死亡總數(shù)的23.8%,均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他癌癥占比,其中肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)為最常見的病理類型[1]。LUAD的高侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致預(yù)后不良的主要原因,嚴(yán)重危害人類健康[2]。

腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移與經(jīng)典血管形成(毛細(xì)血管芽生方式)和血管擬態(tài)形成有密切聯(lián)系[3-4]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGFA)和基質(zhì)金屬蛋白酶-14(matrix metalloproteinase-14,MMP-14)分別參與芽生血管形成和血管擬態(tài)生成[5-6]。關(guān)于芽生血管形成和血管擬態(tài)在LUAD中的作用目前尚未闡明,該研究通過檢測LUAD患者外周血VEGFA和MMP-14水平及其與LUAD患者臨床病理特征的相關(guān)性,探討兩類血管生成方式在LUAD生長、侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用與臨床意義,并利用生物信息分析數(shù)據(jù)庫分析其表達(dá)情況及與生存預(yù)后的關(guān)系,為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源采用UALCAN(ualcan.path.uab.edu/analysis-prot.html)數(shù)據(jù)庫分析LUAD MMP-14和VEGFA蛋白表達(dá),TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov)數(shù)據(jù)庫分析LUAD MMP-14和VEGFA mRNA表達(dá)及其與生存預(yù)后相關(guān)性。

1.2 研究對象收集安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院2022年1—7月收治的69例患者(所有患者為經(jīng)病理證實(shí)的初診患者)的血清和臨床資料,其中男44例,女25例,年齡53～85歲,平均年齡(66.88±8.96)歲。其中LUAD早期患者(Ⅰ+Ⅱ期)11例,LUAD晚期患者(Ⅲ+Ⅳ期)58例。選擇同期20例健康個(gè)體為對照組,其中男12例,女8例,年齡54～75歲,平均年齡(65.85±7.10)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):所有患者均根據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)、病理及實(shí)驗(yàn)室檢查確診;對照組在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院體檢中心進(jìn)行體檢,結(jié)果正常,患者無其他類型腫瘤,無心、肝、腎等重要器官疾病。實(shí)驗(yàn)經(jīng)過受試者知情同意并經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號:YX2022014)。

1.3 儀器與試劑MMP-14試劑盒購于美國Omnimabs公司,VEGFA試劑購于威海威高生物科技有限公司,配套威海威高JR-1半自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)試劑盒及校準(zhǔn)品購于美國雅培公司,配套雅培化學(xué)發(fā)光免疫分析儀Alinity i。

1.4 方法收集研究對象空腹靜脈血,3 500 r/min離心5 min后分裝在一次性EP管,-80 ℃保存。實(shí)驗(yàn)前,先將試劑盒置于室溫(18～25 ℃)30 min,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。ELISA法檢測樣本血清中MMP-14水平,使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處定量檢測?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測樣本血清中VEGFA水平,若有樣本結(jié)果大于檢測上限,則用樣本稀釋液稀釋10倍后重測。

2 結(jié)果

2.1 LUAD組織MMP-14和VEGFA蛋白表達(dá)情況UALCAN數(shù)據(jù)庫中分析LUAD組織MMP-14和VEGFA蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示,原發(fā)性LUAD患者腫瘤組織中MMP-14和VEGFA蛋白水平均高于對照組(P<0.001),見圖1。

圖1 LUAD組織MMP-14和VEGFA蛋白表達(dá)情況

2.2 LUAD患者血清MMP-14和VEGFA表達(dá)水平LUAD早期組、晚期組和對照組在性別、年齡、吸煙史間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。三組受試者血清MMP-14(Z=16.207,P<0.001)及VEGFA(Z=25.494,P<0.001)表達(dá)水平之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血清MMP-14表達(dá)水平在LUAD早期組高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.684,P=0.006),LUAD晚期組略高于LUAD早期組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-0.820,P=0.412);血清VEGFA表達(dá)水平在LUAD早期組高于對照組(Z=-2.271,P=0.023),且LUAD晚期組高于LUAD早期組(Z=-2.082,P=0.037),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1、圖2。

表1 受試者基本信息及血清MMP-14、VEGFA表達(dá)水平比較

圖2 LUAD晚期組、LUAD早期組及對照組血清MMP-14、VEGFA表達(dá)水平A:受試者血清MMP-14水平比較;B:受試者血清VEGFA水平比較;與對照組比較:*P<0.05;與LUAD早期組比較:#P<0.05

2.3 MMP-14和VEGFA表達(dá)水平與LUAD臨床病理特征相關(guān)性LUAD患者血清MMP-14水平在T3/T4期水平高于T1/T2期(Z=-2.002,P=0.045),N2/N3期高于N0/N1期(Z=-2.106,P=0.035),胸膜轉(zhuǎn)移組高于未轉(zhuǎn)移組(Z=-2.118,P=0.034),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在臨床分期和M分期中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);VEGFA水平在M1期高于M0期(Z=-2.234,P=0.025),在臨床Ⅲ+Ⅳ期水平高于Ⅰ+Ⅱ期(Z=-2.082,P=0.037),在T和N分期中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);血清MMP-14和VEGFA表達(dá)水平在不同性別、年齡、吸煙史、骨轉(zhuǎn)移及腦轉(zhuǎn)移組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

2.4 VEGFA和MMP-14對LUAD的預(yù)測分析納入性別、年齡、VEGFA和MMP-14指標(biāo)構(gòu)建多因素Logistic回歸方程,結(jié)果顯示,VEGFA水平升高將增加患LUAD的風(fēng)險(xiǎn),MMP-14水平升高也將增加患LUAD的風(fēng)險(xiǎn),但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.387,95%CI0.579～3.324,P=0.463);相對男性,女性不會(huì)增加LUAD發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.459,95%CI0.138～1.525,P=0.203);年齡的增長也不增加LUAD發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.980,95%CI0.909～1.057,P=0.608)。見表3。

表3 相關(guān)參數(shù)多因素Logistic回歸分析結(jié)果

2.5 MMP-14、VEGFA單項(xiàng)或聯(lián)合CEA對LUAD的診斷效能評估以對照組為參考,ROC分析顯示,MMP-14、VEGFA和CEA單項(xiàng)診斷LUAD的曲線下面積(AUC)分別為0.793、0.849、0.851,95%CI分別為0.694～0.872,0.757～0.916,0.760～0.918,三者AUC之間兩兩比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;兩項(xiàng)聯(lián)合(MMP-14+VEGFA)及三項(xiàng)聯(lián)合(MMP-14+VEGFA+CEA)檢測AUC分別為0.893、0.952,95%CI分別為0.810～0.949、0.885～0.986,三項(xiàng)聯(lián)合檢測AUC均高于三項(xiàng)單項(xiàng)檢測及兩項(xiàng)聯(lián)合,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩項(xiàng)聯(lián)合檢測AUC高于三項(xiàng)單項(xiàng)檢測,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MMP-14、VEGFA、CEA、兩項(xiàng)聯(lián)合及三項(xiàng)聯(lián)合檢測診斷LUAD的最佳診斷界值分別為1.06 ng/ml、0.49 μg/ml、6.79 ng/ml、0.59及0.52,此時(shí)具有最佳診斷效能。見表4、5及圖3。

表4 MMP-14和VEGFA單項(xiàng)和聯(lián)合檢測對LUAD的診斷效能

圖3 MMP-14和VEGFA單項(xiàng)及聯(lián)合檢測診斷LUAD的ROC曲線兩項(xiàng)聯(lián)合:MMP-14+VEGFA;三項(xiàng)聯(lián)合:MMP-14+VEGFA+CEA

2.6 MMP-14和VEGFA mRNA表達(dá)水平與LUAD患者預(yù)后的關(guān)系通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析MMP-14和VEGFA mRNA表達(dá)水平與LUAD患者生存預(yù)后的關(guān)系,以表達(dá)水平低于中位數(shù)的為低表達(dá)組,高于中位數(shù)的為高表達(dá)組。結(jié)果提示MMP-14和VEGFA mRNA高表達(dá)組的OS與DSS均低于低表達(dá)組(P<0.05),見圖4。

表5 單項(xiàng)或聯(lián)合檢測診斷LUAD的ROC-AUC之間比較

圖4 TCGA數(shù)據(jù)庫分析MMP-14和VEGFA表達(dá)水平與LUAD患者OS和DSS的關(guān)系

3 討論

通過生物信息分析大樣本數(shù)據(jù)提示,LUAD患者腫瘤組織MMP-14和VEGFA 蛋白表達(dá)水平高于正常肺組織,體外血清試驗(yàn)也顯示,LUAD患者血清MMP-14和VEGFA水平均高于對照組,Pietrzak et al[7]研究也顯示,MMP-14在NSCLC患者的組織和血液表達(dá)水平均高于正常對照組。既往研究[8]顯示,VEGFA在包括肺癌在內(nèi)多種腫瘤中高表達(dá),但也有研究[9]顯示,正常肺組織中也高表達(dá)VEGFA。

新生血管形成在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中起著決定性作用。腫瘤新生血管形成包括經(jīng)典的內(nèi)皮性血管芽生和血管擬態(tài)兩種方式,VEGFA促進(jìn)經(jīng)典血管芽生,而MMP-14可促進(jìn)腫瘤組織血管擬態(tài)形成,降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)蛋白并增強(qiáng)細(xì)胞遷移,從而促進(jìn)腫瘤的侵襲性。本研究顯示,LUAD早期和晚期組患者血清VEGFA和MMP-14表達(dá)水平均高于對照組。血清VEGFA表達(dá)水平在LUAD晚期組高于LUAD早期組,而MMP-14水平在LUAD早期和晚期患者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示VEGFA和MMP-14在LUAD發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮一定作用。因此,推測經(jīng)典的芽生式血管形成在LUAD的發(fā)生、發(fā)展及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,而血管擬態(tài)更多地與LUAD生長及其向周圍侵襲有關(guān)。

進(jìn)一步研究顯示,LUAD患者血清MMP-14水平在T3/T4期水平高于T1/T2期,N2/N3期高于N0/N1期,胸膜轉(zhuǎn)移組高于未轉(zhuǎn)移組,在臨床分期和M分期中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;VEGFA水平在M1期高于M0期,在T和N分期中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了推測,即MMP-14可能與LUAD的生長及其向臨近組織和淋巴侵襲有關(guān),而腫瘤的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移更多與VEGFA有關(guān)。Xu et al[10]研究也表明非小細(xì)胞肺癌患者血清VEGFA水平高于對照組,但Liu et al[11]研究結(jié)果顯示,VEGFA在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)與腫瘤大小、惡性分化程度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),筆者分析結(jié)果差異的原因可能與研究對象的差異有關(guān),該研究以非小細(xì)胞肺癌整體作為對象,而本研究對象僅為LUAD。另外,MMP-14在LUAD組織中的表達(dá)高于正常組織[12],Yu et al[13]研究顯示MMP-14表達(dá)與大腸癌的腫瘤分期相關(guān),而關(guān)于MMP-14與LUAD的分期或轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究較少。因此,需要進(jìn)一步研究探討MMP-14在LUAD生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及其分子與細(xì)胞機(jī)制。

本研究納入性別、年齡、VEGFA和MMP-14等指標(biāo)構(gòu)建多因素Logistic回歸方程表明,MMP-14和VEGFA表達(dá)水平在不同性別、年齡、吸煙史、骨轉(zhuǎn)移及腦轉(zhuǎn)移組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是,VEGFA水平升高將增加患LUAD的風(fēng)險(xiǎn)(OR=7.517,P=0.002);MMP-14水平升高也將增加患LUAD的風(fēng)險(xiǎn),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.387,P=0.463)。這些結(jié)果提示血清VEGFA和MMP-14具有作為分子標(biāo)記診斷LUAD的潛力。需要注意的是,本研究為小樣本研究,因此在后續(xù)研究中需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以驗(yàn)證MMP-14在LUAD中的風(fēng)險(xiǎn)評估價(jià)值。

本研究中ROC分析顯示,血清VEGFA和MMP-14對LUAD均有一定診斷價(jià)值,AUC分別為0.849、0.793,與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物CEA診斷LUAD的AUC(0.851)相近,但三者之間兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩項(xiàng)聯(lián)合(MMP-14+VEGFA)及三項(xiàng)聯(lián)合(MMP-14+VEGFA+CEA)檢測AUC分別為0.893、0.952,兩項(xiàng)或三項(xiàng)聯(lián)合檢測均可提高其對LUAD的診斷效能,但三項(xiàng)聯(lián)合檢測診斷效能最高,可提高診斷敏感性,且與單項(xiàng)檢測和兩項(xiàng)聯(lián)合比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩項(xiàng)聯(lián)合檢測與單項(xiàng)檢測的AUC差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究還顯示MMP-14、VEGFA、CEA診斷LUAD的最佳診斷界值分別為1.06 ng/ml、0.49 μg/ml、6.79 ng/ml,此時(shí)具有最佳診斷效能。

本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析了LUAD患者M(jìn)MP-14和VEGFA表達(dá)水平與生存預(yù)后的關(guān)系,結(jié)果顯示MMP-14和VEGFA高表達(dá)組的OS與DSS均低于低表達(dá)組(P<0.05)。 Pietrzak et al[7]研究顯示MMP-14表達(dá)高于中位數(shù)的患者的OS明顯短于MMP-14表達(dá)低于中位數(shù)的患者,體外血清實(shí)驗(yàn)也顯示MMP-14在T和N分期較晚的患者水平較高,說明MMP-14用于肺癌臨床預(yù)后評估有一定意義。

綜上所述,LUAD患者VEGFA和MMP-14水平異常高表達(dá),VEGFA可能與LUAD遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移有關(guān),MMP-14可能與LUAD腫瘤生長、臨近組織和淋巴侵襲相關(guān)。血清VEGFA水平升高對LUAD有較高預(yù)測價(jià)值,MMP-14和VEGFA對LUAD均有一定診斷價(jià)值,且聯(lián)合CEA檢測后可提高診斷LUAD的效能,生物信息分析提示MMP-14和VEGFA水平對LUAD生存預(yù)后有一定意義。