陳 萍,王慧之,王德強(qiáng),劉駿強(qiáng)

胃癌的全球發(fā)病率在癌癥中居第5位,易導(dǎo)致患者死亡,預(yù)后不佳[1]。目前早期胃癌的診療以內(nèi)鏡下手術(shù)和外科手術(shù)為主,治療可達(dá)到完全切除效果[2]。進(jìn)展期患者失去了胃癌根治機(jī)會,存在轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)可能,預(yù)后及生存質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及早癌患者。

蛋白翻譯后修飾是腫瘤表觀遺傳改變研究的重要領(lǐng)域之一,其中甲基化、磷酸化、羥基化等修飾形式受到廣泛關(guān)注[3]。蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族(protein arginine methyltransferases,PRMTs)被認(rèn)為將甲基轉(zhuǎn)移至精氨酸殘基上,通過不同的甲基化修飾影響腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展[4]。依據(jù)催化形成的不同產(chǎn)物,PRMTs家族大致分成4型,其中Ⅱ型PRMTs主要催化修飾形成對稱性二甲基,包括PRMT5和PRMT9[5]。有研究[6]表明PRMT5在肺癌細(xì)胞中高表達(dá),促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移。同時有研究[7]表明PRMT5通過ERK信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖,另外,PRMT5是乳腺癌干細(xì)胞增殖以及自我更新的重要調(diào)控因子[8],因此,PRMT5扮演著癌基因角色,以PRMT5作為靶點(diǎn)的分子抑制劑的抗腫瘤研究也日益增多[9]。該研究通過相關(guān)腫瘤數(shù)據(jù)庫分析PRMT5在胃癌組織中表達(dá),體外實(shí)驗分析PRMT5在不同胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)差異及其相關(guān)生物學(xué)作用,進(jìn)而為胃癌診療提供可行性參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人源胃癌細(xì)胞(AGS、BGC823、SGC7901、MGC803)均來自江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗室細(xì)胞保存庫。質(zhì)粒均由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究所保存提供。胎牛血清購自美國Gibco公司,PRMT5抗體購自美國Santa Cruz公司,基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2,MMP2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP9)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)相關(guān)蛋白抗體以及內(nèi)參抗體β-Tubulin均購自美國CST公司,蛋白Marker 以及Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司,ECL發(fā)光液購自美國Millipore公司,CCK-8試劑盒購自上海酶聯(lián)生物研究所。

1.2 方法

1.2.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞消化接種培養(yǎng),待其鋪滿約60%單孔面積可開始轉(zhuǎn)染。把5 μl的LipofectamineTM2000與2 μg質(zhì)粒各自加進(jìn)含有100 μl培養(yǎng)液滅菌EP管中,各自充分重懸后放置5 min,將兩者輕柔充分混合并靜置25 min。隨后吸取轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒的混合液加進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)板中,放入溫箱里孵育6 h。

1.2.2細(xì)胞克隆形成實(shí)驗 將細(xì)胞消化種板后放置溫箱中孵育培養(yǎng),間隔2 d行半換液,約2周待細(xì)胞克隆集落出現(xiàn)后移去培養(yǎng)基,用PBS輕柔清洗,沿板壁添入提前配制的4%多聚甲醛試劑固定細(xì)胞30 min,PBS洗滌2次,控干并添加0.1%結(jié)晶紫試劑,室溫控干后在顯微鏡下拍照后計數(shù)。

1.2.3Transwell遷移實(shí)驗及侵襲實(shí)驗 將細(xì)胞消化種板后放置溫箱中孵育培養(yǎng)。各組消化計數(shù) 50 000 個/孔種于Transwell小室中,并以5%胎牛血清配置的條件培養(yǎng)基定容為200 μl,下室則以10%胎牛血清配置的條件培養(yǎng)基定容為800 μl。放置12 h后移出小室,使用棉簽小心擦拭上室底膜,孔內(nèi)沿板壁加入多聚甲醛試劑,30 min后棄液加入結(jié)晶紫試劑,控干后將下室放在顯微鏡下計數(shù)。侵襲實(shí)驗中提前使用基質(zhì)膠在小室底膜加入100 μl, 于37 ℃中靜置30 min待其凝固,剩余步驟同上。

1.2.4CCK-8實(shí)驗 將細(xì)胞消化種板后放置溫箱中孵育培養(yǎng)。各組消化計數(shù)1 000個/孔種在96孔板內(nèi),同時設(shè)置5個復(fù)孔。在溫箱中孵育24、48、72、96 h等不同時間段,按照說明書分別在每孔加入10 μl CCK-8試劑并在溫箱中避光培育2 h, 隨后立即測450 nm處的吸光度。

1.2.5定量PCR實(shí)驗 使用RNeasy Minikit試劑盒分離總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBRGreen PCR Master Mix進(jìn)行實(shí)時PCR,并通過ABI Prism 7900工具進(jìn)行分析。PRMT5引物正向序列為5′-CGATCAGACCTACTGCTGTCA-3′,反向序列為5′-CTCGGAGTTCCTGCGAATCT-3′;GAPDH引物的正向序列為5′-GCCACCCAGAAGCATGTGGATGGC-3′,反向序列為:5′-CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC-3′。

1.2.6蛋白免疫印跡法 用預(yù)冷PBS洗滌培養(yǎng)板,按配比加入提前煮沸的2×SDS-Loading Buffer細(xì)胞裂解液,隨后用細(xì)胞刮仔細(xì)刮下孔內(nèi)貼壁細(xì)胞,將混合液體吸入準(zhǔn)備好的EP管中,隨后將其放進(jìn)100 ℃容器內(nèi)5 min,瞬離EP管10 s,使用超聲破碎EP管內(nèi)細(xì)胞10 s,將EP管在4 ℃、11 000 r/min離心10 min,最后標(biāo)本置于冰箱冷凍后擇期盡快實(shí)驗。按照說明書準(zhǔn)備試劑分別制備不同濃度的分離膠和濃縮膠,提前取出所需蛋白樣品室溫融化并瞬離10 s,在膠孔內(nèi)加入樣本蛋白后進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜。依據(jù)蛋白分子量和Marker切取所需檢測條帶,室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h,在目的蛋白條帶上滴加相應(yīng)抗體,4 ℃下?lián)u床過夜,次日TBST溶液清洗條帶后按配比滴加適量的二抗,將條帶放置搖床上室溫孵育2 h,用TBST溶液清洗。最后配制好一定量的顯影液,曝光條帶顯色。

1.2.7生信GEO數(shù)據(jù)庫分析 從GEO數(shù)據(jù)庫中搜索“Gastric Cancer scRNA”后下載GSE134520數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù),讀入矩陣后使用Seurat工具創(chuàng)建對象后對其進(jìn)行聚類降維,將所需數(shù)據(jù)樣本來源進(jìn)行可視化,繪制成小提琴圖和直方散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果

2.1 GEO數(shù)據(jù)庫研究PRMT5在胃癌組織中表達(dá)胃癌前病變包括腸化生(intestinal metaplasia,IM)和慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG),該研究在數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)讀取GSE134520數(shù)據(jù)集,該數(shù)據(jù)集分別對3例慢性非萎縮性胃炎(non-atrophic gastritis,NAG)、3例慢性萎縮性胃炎、6例腸上皮化生、1例早期胃癌(early gastric cancer,EGC)患者的胃病理組織進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序,通過該數(shù)據(jù)集的結(jié)果分析顯示PRMT5在慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎至腸上皮化生逐級演變至早期胃癌中均有表達(dá),其中在早期胃癌及胃癌前病變組織中表達(dá)較慢性非萎縮性胃炎增高,并且早期胃癌組織中表達(dá)水平最高。見圖1。

2.2 Ualcan、HPA數(shù)據(jù)庫研究PRMT5在胃癌組織中表達(dá)通過數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu)繼續(xù)研究正常胃和胃癌組織中PRMT5在mRNA表達(dá)水平,統(tǒng)計結(jié)果顯示胃癌組織中PRMT5在mRNA水平高于正常胃組織(圖2A),而且在不同腫瘤TNM臨床分期(Stage1～4)胃癌組織中的PRMT5在mRNA水平均高于正常胃組織(圖2B)。通過數(shù)據(jù)庫(http://Human Protein Atlas)分析PRMT5在正常胃組織和胃癌組織中的蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示胃癌組織中PRMT5蛋白水平明顯高于正常胃組織(圖2C)。

2.3 PRMT5在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平為了繼續(xù)探究PRMT5在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用,首先通過Western blot測定PRMT5在4種不同胃癌細(xì)胞(AGS、BGC823、SGC7901、MGC803)中蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示,PRMT5在MGC803細(xì)胞株中表達(dá)最高,在AGS細(xì)胞株中表達(dá)最低(圖3A)。

圖3 PRMT5在胃癌組織中的表達(dá)水平

該研究在相對高表達(dá)PRMT5的MGC803細(xì)胞株中通過質(zhì)粒(sh-PRMT5)敲低PRMT5表達(dá)水平,為了驗證質(zhì)粒干擾效率,篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株后,通過Western blot以及Real-time PCR分別檢測PRMT5在MGC803中蛋白及mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與對照組sh-EGFP組相比, sh-PRMT5組PRMT5細(xì)胞中蛋白及mRNA水平明顯降低(P<0.05)(圖3B)。同時在相對低表達(dá)PRMT5的AGS細(xì)胞株中通過質(zhì)粒(pHA-PRMT5)促進(jìn)PRMT5表達(dá),為了驗證質(zhì)粒過表達(dá)效率,篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株后,通過Western blot以及Real-time PCR分別檢測PRMT5在AGS中蛋白及mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與對照組pHA-Venus組相比, pHA-PRMT5組細(xì)胞中PRMT5蛋白及mRNA水平明顯升高(P<0.05)(圖3C)。

2.4 PRMT5對胃癌細(xì)胞增殖的影響利用CCK-8實(shí)驗以及克隆實(shí)驗分析PRMT5對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響。敲低PRMT5表達(dá)后,與對照組sh-EGFP相比, 實(shí)驗組sh-PRMT5組細(xì)胞增殖率明顯下降(P<0.001)(圖4A),同時sh-EGFP組(225±23)比sh-PRMT5組(128±13)細(xì)胞克隆數(shù)目減少(t=6.359,P<0.01)(圖4B)。增強(qiáng)PRMT5表達(dá)后,實(shí)驗組pHA-PRMT5細(xì)胞增殖率較對照組pHA-Venus明顯升高(P<0.001)(圖4C),同時pHA-PRMT5組(310±25)比pHA-Venus組(104±9)細(xì)胞克隆數(shù)目增多(t=13.43,P<0.001)(圖4D)。

2.5 PRMT5對胃癌細(xì)胞遷移與侵襲的影響利用劃痕實(shí)驗探究PRMT5對胃癌細(xì)胞遷移能力的影響。敲低PRMT5表達(dá)后24 h,sh-PRMT5組細(xì)胞遷移速度低于sh-EGFP組(t=25.98,P<0.001)。過表達(dá)PRMT5后24 h,pHA-PRMT5組中細(xì)胞遷移速度明顯高于pHA-Venus組(t=5.824,P<0.01)(圖5A)。繼續(xù)通過Transwell試驗驗證PRMT5對胃癌細(xì)胞遷移能力以及侵襲能力的影響。敲低PRMT5表達(dá)后,sh-PRMT5組細(xì)胞遷移(84±5)(t=21.17,P<0.001)及侵襲數(shù)目(108±7)(t=16.81,P<0.001)小于sh-EGFP組遷移數(shù)目(336±20)和侵襲數(shù)目(360±25)。過表達(dá)AGS細(xì)胞株P(guān)RMT5后,pHA-PRMT5組中細(xì)胞遷移(192±11)(t=22.79,P<0.001)以及侵襲(168±10)(t=24.12,P<0.001)數(shù)目大于pHA-Venus組遷移數(shù)目(38±4)和侵襲數(shù)目(26±2)(圖5B)。

圖5 PRMT5促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移與侵襲

利用Western blot分析各組胃癌細(xì)胞中MMP2和MMP9侵襲蛋白的表達(dá),繼續(xù)驗證PRMT5促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲。結(jié)果顯示:敲低PRMT5表達(dá)后,與對照組相比,sh-PRMT5組細(xì)胞MMP2和MMP9侵襲蛋白表達(dá)水平下降。而增強(qiáng)表達(dá)PRMT5后,與對照組相比,pHA-PRMT5組細(xì)胞MMP2和MMP9侵襲蛋白表達(dá)水平升高(圖5C)。

2.6 PRMT5對胃癌EMT的影響利用Western blot實(shí)驗檢測PRMT5對胃癌上皮細(xì)胞相關(guān)蛋白和間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)影響。實(shí)驗結(jié)果顯示,與sh-EGFP組相比, 敲低PRMT5表達(dá)后sh-PRMT5組N-cadherin、β-catenin、Vimentin等間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)明顯下降,而上皮細(xì)胞蛋白E-cadherin表達(dá)水平上升(圖6A);同時與pHA-Venus組相比, 過表達(dá)PRMT5后pHA-PRMT5組N-cadherin、β-catenin、Vimentin等間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)明顯升高,而上皮相關(guān)蛋白E-cadherin水平明顯下降(圖6B)。結(jié)果顯示,PRMT5可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞EMT過程。

圖6 Western blot檢測PRMT5對胃癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)影響A:MGC803;B:AGS

3 討論

胃癌一直是威脅人類生命健康的嚴(yán)重疾病之一,雖然近年因生活條件的改善,內(nèi)鏡檢查需求較前增多,胃癌患病率及病死率較前有所下降,5年生存率相對升高,但由于胃癌患者早期僅有噯氣、飽脹等不典型臨床表現(xiàn),同時部分患者對內(nèi)鏡檢查存在恐懼心理,當(dāng)患者出現(xiàn)腹痛加重、嘔血黑便、體質(zhì)量明顯減輕等嚴(yán)重癥狀時,往往已錯過最佳手術(shù)診療時期且預(yù)后差,由此可見早期胃癌的診斷尤其重要。臨床中除傳統(tǒng)的放療化療外,免疫治療、分子靶向治療、術(shù)前新輔助治療等手段也發(fā)揮重要作用。胃癌的局部進(jìn)展以及轉(zhuǎn)移一直是學(xué)術(shù)界關(guān)注的焦點(diǎn),其相關(guān)的蛋白以及分子靶點(diǎn)具有一定的研究潛力。PRMT5是一種將精氨酸殘基催化形成對稱二甲基化的相關(guān)蛋白,在家族中屬于Ⅱ型。近年來研究顯示該蛋白在不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,如肺癌[10]、乳腺癌[11]、肝癌[12]、胰腺癌[13]。作為熱點(diǎn)腫瘤癌基因,可繼續(xù)研究其在胃惡性腫瘤發(fā)生演變中的作用。該研究首先通過生信分析顯示PRMT5在早期胃癌組織中表達(dá)較慢性萎縮性胃炎以及腸化生癌前病變組織表達(dá)升高,通過不同數(shù)據(jù)庫檢索,與正常胃黏膜組織進(jìn)行比較后顯示,各個胃癌分期組織中PRMT5在mRNA以及蛋白表達(dá)水平升高,由此該實(shí)驗提出假說PRMT5在胃癌的演變進(jìn)展機(jī)制中具有相關(guān)作用。通過Western blot測定PRMT5在4種不同胃癌細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平,由此該實(shí)驗選出PRMT5表達(dá)量較高的MGC803細(xì)胞株與表達(dá)量較低的AGS細(xì)胞株。隨后該實(shí)驗在MGC803細(xì)胞株中通過質(zhì)粒(sh-PRMT5)敲低PRMT5表達(dá)水平并在AGS細(xì)胞株中通過質(zhì)粒(pHA-PRMT5)促進(jìn)PRMT5表達(dá)。穩(wěn)定篩選及轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后,該實(shí)驗利用CCK-8與成克隆形成實(shí)驗顯示PRMT5具有提升胃癌細(xì)胞的增殖能力。同時在相關(guān)實(shí)驗中表明PRMT5具有提升胃癌細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力。該研究通過對胃癌細(xì)胞EMT相關(guān)上皮間質(zhì)蛋白進(jìn)行檢測顯示,PRMT5可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞EMT過程。

綜上所述,該研究闡明了PRMT5對胃癌細(xì)胞具有促進(jìn)其增殖、遷移、侵襲以及EMT能力,在胃癌的早期診斷以及預(yù)后評估中,PRMT5也有很好的研究前景,其相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。