付貴強(qiáng),鄒多宏,2

骨缺損是一種骨質(zhì)缺失導(dǎo)致骨不連或不愈合進(jìn)而引起功能障礙疾病[1]。引起骨缺損常見(jiàn)的原因有創(chuàng)傷、炎癥和腫瘤等[2]。一般輕微的骨缺損可以由自身組織修復(fù)再生,但是嚴(yán)重骨缺損超越了自身愈合的極限,必須采用骨移植或生物材料促進(jìn)缺損修復(fù)。因此,開(kāi)發(fā)一種新型骨移植系統(tǒng),包括理想的支架材料及優(yōu)異的種子細(xì)胞[3]等,在組織工程中尤為重要。間充質(zhì)干細(xì)胞是組織工程中最有潛力的種子細(xì)胞。隨著研究的深入,越來(lái)越多的口腔來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)[4],這些干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有著類(lèi)似的細(xì)胞表面標(biāo)志物、克隆增殖能力和多向分化潛能,已被研究應(yīng)用于骨、血管、神經(jīng)等疾病。

人根尖乳頭干細(xì)胞(human apical papilla stem cells,SCAPs)、牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞(dental pulp mesenchymal stem cells,DPSCs)和牙槽骨間充質(zhì)干細(xì)胞(alveolar bone mesenchymal stem cells,ABMMSCs)取材便宜、易培養(yǎng),能夠穩(wěn)定傳代擴(kuò)增,可以作為骨組織工程中優(yōu)異的種子細(xì)胞庫(kù)。為了研究三者之間的差異,該實(shí)驗(yàn)通過(guò)衰老檢測(cè)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、成骨誘導(dǎo)后染色和成骨相關(guān)基因檢測(cè)來(lái)研究3種細(xì)胞之間的異同。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器Ⅰ型膠原酶(美國(guó)西格瑪公司), 胎牛血清(中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司),青-鏈霉素、ALP染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),0.25%胰蛋白酶(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),CD24、CD90、CD34、CD73(美國(guó)博奧派克生物科技有限公司),RNAiso Plus(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司),CCK-8試劑(日本同仁化學(xué)研究所),成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(蘇州賽業(yè)生物科技有限公司),SYBR Green master mix(上海弈圣生物科技有限公司),LightCycler 96(瑞士羅氏公司),酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默世爾科技有限公司)。

1.2 細(xì)胞分離與培養(yǎng)供體年齡為14～20歲,采用來(lái)自第3磨牙的健康牙齒和牙槽骨。將牙根面牙髓組織、根尖乳頭組織用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后剪成小塊,分離培養(yǎng)DPSCs和SCAPs。用3 mg/ml Ⅰ型膠原酶消化,在37 ℃下孵育40 min。1 200 r/min離心5 min,重懸于含20%胎牛血清和100 U/ml青-鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中。隨后將牙槽骨夾碎成小塊,接種在上述培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞在37 ℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。在約80%融合時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化分離細(xì)胞,并按1 ∶3傳代。培養(yǎng)基每3 d更換1次,取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 流式檢測(cè)用胰蛋白酶消化收集第3代細(xì)胞,1 200 r/min離心5 min,然后用PBS重懸細(xì)胞轉(zhuǎn)移到測(cè)試管中。使用FITC偶聯(lián)CD24、CD90和PE偶聯(lián)CD34、CD73以及相應(yīng)的同型抗體作為對(duì)照,避光孵育30 min,收集到流式細(xì)胞儀中,用CytExpert軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.4 細(xì)胞衰老檢測(cè)當(dāng)?shù)?代細(xì)胞生長(zhǎng)至90%時(shí),胰酶消化離心。新鮮培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù),按照2×105個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種在6孔板中。待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%時(shí)吸棄培養(yǎng)基,PBS清洗2次,加入RNAiso Plus裂解細(xì)胞,提取RNA。

1.5 細(xì)胞增殖當(dāng)?shù)?代細(xì)胞生長(zhǎng)至90%時(shí),胰酶消化離心。新鮮培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù),按照1 500個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種在96孔板中,設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,每孔加入10 μl的CCK-8試劑37 ℃孵育2 h,接種細(xì)胞24 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下的吸光度,連續(xù)檢測(cè)7 d,繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6 成骨分化在6孔板中以2×105個(gè)/孔接種3種細(xì)胞,用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞達(dá)到60%融合時(shí),更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基,每3 d更換新鮮的培養(yǎng)基,誘導(dǎo)14 d。

1.7 ALP染色和茜素紅染色成骨誘導(dǎo)7 d后,按照ALP染色試劑盒染色,PBS清洗2次,加入染色固定液固定15 min,PBS清洗2次,加入染色液,避光孵育10 min后PBS清洗2次。使用掃描儀捕捉數(shù)字圖像。吸棄培養(yǎng)基,PBS清洗2次,加入RNAiso Plus裂解細(xì)胞,提取RNA。

1.8 茜素紅染色誘導(dǎo)成骨14 d后,PBS清洗2次,加入染色固定液固定15 min,PBS清洗2次,加入染色液染色5 min,PBS清洗2次。使用掃描儀捕捉數(shù)字圖像。吸棄培養(yǎng)基,PBS清洗2次,加入RNAiso Plus裂解細(xì)胞,提取RNA。

1.9 提取RNA和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)用RNAiso Plus提取RNA。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA濃度和純度。用Yeasen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,使用SYBR Green master mix和LightCycler 96進(jìn)行qRT-PCR。引物序列在表1中列出。各基因的相對(duì)表達(dá)量以GAPDH RNA歸一化得到的2-ΔΔCt值作為對(duì)照。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 SCAPs、DPSCs和ABMMSCs的細(xì)胞形態(tài)提取3種細(xì)胞的原代,在培養(yǎng)基中傳代擴(kuò)增,用倒置顯微鏡觀察P0和P3代細(xì)胞形態(tài)。P0代細(xì)胞從組織塊中爬出,成放射狀生長(zhǎng),細(xì)胞的形態(tài)類(lèi)似成纖維細(xì)胞,長(zhǎng)梭形,密度較高時(shí)表現(xiàn)為漩渦狀。傳代后細(xì)胞形態(tài)光滑,繼續(xù)保持成纖維細(xì)胞樣外觀,3種細(xì)胞的形態(tài)無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖1。

圖1 SCAPs、DPSCs 和 ABMMSCs原代和P3代細(xì)胞的形態(tài)特征 ×40

2.2 流式結(jié)果分析數(shù)據(jù)顯示內(nèi)皮細(xì)胞和造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD24和CD34為低表達(dá),而間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物CD73和CD90呈現(xiàn)高表達(dá)(圖2)。該結(jié)果表明提取的3種細(xì)胞均為間充質(zhì)干細(xì)胞,細(xì)胞免疫表型無(wú)明顯差異。

圖2 SCAPs、DPSCs 和 ABMMSCs 表面抗原標(biāo)志物的表達(dá)

2.3 衰老相關(guān)基因檢測(cè)圖3顯示qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,衰老相關(guān)基因p16(F=3.386,P=0.103 7)、p21(F=4.004,P=0.078 6)、p53(F=1.997,P=0.216 4)在3種細(xì)胞的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明體外培養(yǎng)的P2代3種細(xì)胞狀態(tài)良好,無(wú)衰老差異。

圖3 3種細(xì)胞衰老相關(guān)基因的表達(dá)

2.4 患者SCAPs、DPSCs和ABMMSCs增殖能力曲線用P3代的SCAPs、DPSCs和ABMMSCs連續(xù)測(cè)量7 d的吸光度,如圖4顯示,3種細(xì)胞在前3 d的生長(zhǎng)能力相似,但在5 d后DPSCs和SCSPs的增長(zhǎng)能力明顯高于ABMMSCs,且SCAPs的生長(zhǎng)快于DPSCs,說(shuō)明SCAPs具有很強(qiáng)的生長(zhǎng)潛力,而ABMMSCs的增殖能力較弱,見(jiàn)圖4。5 d(F=105.5,P<0.000 1),6 d(F=26.53,P<0.001),7 d(F=197.4,P<0.000 1)。

圖4 第三代SCAPs、DPSCs和ABMMSCs的增殖曲線

2.5 成骨誘導(dǎo)和相關(guān)基因檢測(cè)成骨誘導(dǎo)7 d后進(jìn)行ALP染色,ABMMSCs的藍(lán)色范圍最廣,染色最深,DPSCs次之,SCAPs染色最淺(圖5A)。誘導(dǎo)3周后茜素染色與7 d的ALP 染色一致,ABMMSCs紅色最深,SCAPs與其他2種細(xì)胞相比染色較少(圖5B),且在顯微鏡下觀察細(xì)胞形成紅色礦物質(zhì)結(jié)節(jié),ABMMSCs明顯多于SCAPs和DPSCs(圖6)。qRT-PCR結(jié)果表明成骨誘導(dǎo)7 d和14 d后ALP、OSX、COL-1、OCN、OPN在ABMMSCs中的表達(dá)均高于其他2種細(xì)胞,DPSCs次之,SCAPs中上述成骨基因的表達(dá)在3種細(xì)胞中的表達(dá)最低(圖7)。ALP(F=523.8,P<0.000 1),OSX(F=21.17,P<0.001 9),COL-1(F=51.35,P<0.000 2),OCN(F=638.6,P<0.000 1),OPN(F=2 659,P<0.000 1)。

圖5 3種細(xì)胞成骨誘導(dǎo)7 d和14 d后ALP和茜素紅染色A:ALP染色;B:茜素紅染色

圖6 茜素紅染色鏡下觀察 ×40

圖7 qPCR定量檢測(cè)成骨誘導(dǎo)7 d和14 d后成骨相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)骨組織工程的相關(guān)研究中已得到了廣泛的應(yīng)用[5-10]。但不同的間充質(zhì)干細(xì)胞有著不同的分化潛能和特性,因此挑選合適的干細(xì)胞作為種子細(xì)胞尤為重要。

該實(shí)驗(yàn)主要研究作為骨組織工程的種子細(xì)胞SCAPs、DPSCs和ABMMSCs 在體外生物學(xué)特性方面之間的不同。將來(lái)自14～20歲供體的牙齒和牙槽骨通過(guò)酶消化-組織塊法提取原代SCAPs、DPSCs和ABMMSCs。經(jīng)過(guò)體外傳代培養(yǎng)后,細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,類(lèi)似成纖維細(xì)胞,形態(tài)均一穩(wěn)定。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34陰性,CD90和CD73陽(yáng)性率高達(dá)90%以上。說(shuō)明此方法分離得到的細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。

骨組織工程需要大量的細(xì)胞,因此,細(xì)胞狀態(tài)和增殖能力關(guān)系到其在組織工程中的治療效果。細(xì)胞衰老是指細(xì)胞出現(xiàn)持續(xù)性的周期阻滯[11],其中衰老相關(guān)標(biāo)志物p53、p21、p16發(fā)揮重要的作用。腫瘤抑制因子p53介導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)(DDR)通路在細(xì)胞對(duì)基因組不穩(wěn)定性的內(nèi)在反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,包括短暫的細(xì)胞周期阻滯、衰老和凋亡,p21和p16作為一種細(xì)胞周期依賴(lài)性激酶抑制劑阻礙細(xì)胞周期加速衰老進(jìn)程[12-13]。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了3種細(xì)胞的衰老相關(guān)標(biāo)志物p53、p21、p16的表達(dá),結(jié)果顯示3者之間無(wú)顯著差異,表明P2代的3種細(xì)胞之間狀態(tài)一致。貼壁培養(yǎng)后連續(xù)7 d檢測(cè)3種間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示所有間充質(zhì)干細(xì)胞在第3天均達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,此后快速生長(zhǎng),SCAPs生長(zhǎng)速度最快,DPSCs次之,ABMMSCs生長(zhǎng)最慢。

作為骨組織工程的種子細(xì)胞,其成骨分化能力也發(fā)揮重要的作用。為了進(jìn)一步探究SCAPs、DPSCs和ABMMSCs 3種細(xì)胞成骨能力的差異,該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了體外成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。成骨誘導(dǎo)7 d后,ALP染色可見(jiàn),ABMMSCs的染色范圍最廣,顏色最深,其次是DPSCs,SCAPs的染色最淺。誘導(dǎo)14 d后進(jìn)行茜素紅染色,與ALP染色一致,ABMMSCs染色最強(qiáng),SCAPs染色最弱。鏡下觀察在成骨誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)形成礦物質(zhì)結(jié)節(jié),其中ABMMSCs形成的鈣結(jié)節(jié)最多,對(duì)成骨分化誘導(dǎo)最為敏感。ALP、OSX、COL-1、OCN、OPN是成骨分化過(guò)程中重要的調(diào)控因子[14-15]。通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平上分析這些標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)一步探究三者之間成骨分化的能力。ALP是成骨細(xì)胞合成礦化骨基質(zhì)的早期經(jīng)典標(biāo)志物,是反映成骨分化程度的良好指標(biāo);成骨分化過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子OSX特異性表達(dá)于成骨細(xì)胞,并調(diào)控成骨標(biāo)志物的表達(dá);Ⅰ型膠原COL-1是骨基質(zhì)中主要的膠原成分;骨鈣素(OCN)、骨橋蛋白(OPN)是成骨后期指標(biāo);這些因子可以相互協(xié)同共同促進(jìn)成骨分化。qRT-PCR檢測(cè)顯示, 7 d成骨誘導(dǎo)后ABMMSCs中ALP 的表達(dá)水平最高,SCAPs最低,隨著誘導(dǎo)至14 d,差異更加顯著,OSX和COL-1也表現(xiàn)出類(lèi)似的趨勢(shì)。晚期指標(biāo)OCN和OPN在14 d誘導(dǎo)后達(dá)到較高水平,且ABMMSCs和DPSCs中的表達(dá)量顯著高于SCAPs。

以上研究結(jié)果表明,口腔來(lái)源的3種細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增后狀態(tài)良好,均可保持穩(wěn)定的增殖能力。SCAPs相比DPSCs和ABMMSCs更容易生長(zhǎng)擴(kuò)增,但是體外成骨誘導(dǎo)后顯示,ABMMSCs的成骨能力較強(qiáng),表明該細(xì)胞治療骨相關(guān)疾病更有效,是骨組織工程最為理想的種子細(xì)胞。該結(jié)果為臨床上培養(yǎng)和選用種子細(xì)胞提供了理論支持,未來(lái)還需要開(kāi)展更多的體內(nèi)研究為最佳種子細(xì)胞的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。