孫衍昶,徐鵬翔,何青龍,歐陽一彬,莫業(yè)和

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是指由鈍性、穿透力、加速力或減速力等外部物理力量引起的顱腦損傷[1]。當(dāng)發(fā)生TBI后,激活的小膠質(zhì)細(xì)胞迅速遷移到損傷部位并釋放大量炎癥因子,破壞血腦屏障并誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡,進(jìn)一步加劇腦組織損傷[2-3]。因此,適當(dāng)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化能減少TBI后的腦組織病理損害。外泌體(exosome,Exo)是具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的微小囊泡,由于其體積小,可有效避免單核巨噬細(xì)胞的吞噬作用,并自由穿過血管壁和細(xì)胞外基質(zhì),因此可作為傳遞載體將信號(hào)分子運(yùn)轉(zhuǎn)至其他細(xì)胞,以影響或調(diào)控相關(guān)功能[4-5]。作為小的非編碼RNA分子,miRNA通過與靶標(biāo)mRNA 3′UTR區(qū)域配對(duì)結(jié)合進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控?，F(xiàn)已知多種miRNA在TBI后異常表達(dá)并參與調(diào)控病理進(jìn)程[6-7]。研究[8]表明,miR-223在腦損傷后表達(dá)異常,提高其表達(dá)可以抑制炎癥反應(yīng),減輕腦組織損傷并減少神經(jīng)元凋亡。基于此,該研究旨在明確Exo轉(zhuǎn)運(yùn)miR-223對(duì)TBI大鼠腦組織病變與小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響,并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只Sprague Dawley雄性大鼠,SPF級(jí),體質(zhì)量200～220 g,購自海南藥物研究所有限責(zé)任公司[許可證號(hào):SCXK(瓊)2020-0007],飼養(yǎng)在通風(fēng)良好、溫度20～25 ℃、相對(duì)濕度50%～60%、光照/黑暗12 h循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物飼養(yǎng)房內(nèi)。動(dòng)物飼養(yǎng)7 d后檢查無異常即可用于實(shí)驗(yàn),本研究方案經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號(hào):H20220124-1)。

1.1.2主要試劑 HEK293細(xì)胞(美國ATCC細(xì)胞庫),DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清及青-鏈霉素雙抗液(美國Gibco公司),Lipofectamine 2000試劑盒(美國Invitrogen公司),TRIzol(日本TaKaRa公司),MicroRNA反轉(zhuǎn)錄與定量檢測(cè)試劑盒(美國Applied Biosystems公司),通用型外泌體提取試劑盒(江蘇凱基生物公司),RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL超敏發(fā)光液及DAPI染料(上海碧云天生物研究所),HE染色液(北京百奧博萊生物公司),Nissl染色液(北京索萊寶生物公司),血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6) ELISA檢測(cè)試劑盒(上海酶研生物科技公司),Triton X-100(北京凱詩源生物科技公司),兔抗CD9多克隆抗體、兔抗CD63多克隆抗體、兔抗CD81多克隆抗體、兔抗Nod樣受體蛋白3(nod-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)多克隆抗體、兔抗凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-asociated speck-like protein containing,ASC)多克隆抗體、兔抗半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)多克隆抗體、小鼠抗離子鈣接頭蛋白(ionized calcium binding adaptor molecule 1,Iba-1)單克隆抗體、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗與異硫氰酸熒光素標(biāo)記的二抗(英國Abcam公司),miR-NC質(zhì)粒與miR-223 mimic質(zhì)粒交由廣州銳博生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將冷凍的HEK293細(xì)胞復(fù)蘇,添加DMEM 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清與1%青-鏈霉素雙抗液)后置于37 ℃、5%CO2環(huán)境下傳代培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔的密度接種至6孔板,過夜培養(yǎng),分為3組:對(duì)照組、miR-NC組、miR-223組。對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)不處理,miR-NC組與miR-223組按照Lipofectamine 2000試劑盒使用說明書步驟,分別轉(zhuǎn)染miR-NC質(zhì)粒、miR-223 mimic質(zhì)粒至細(xì)胞,轉(zhuǎn)染6 h后更換為完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR TRIzol法提取總RNA,1%凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量,紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度并記錄A260/A280值。選擇A260/A280值在1.8～2.1的RNA樣品,按照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription試劑盒說明書步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。再以第一條cDNA鏈為模板,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)測(cè)定miR-223表達(dá)水平,具體根據(jù)TaqMan MicroRNA assay試劑盒說明書配制反應(yīng)體系,在定量系統(tǒng)上設(shè)置程序進(jìn)行擴(kuò)增,以U6作為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,引物序列如下:miR-223上游引物5′-CGCUAUAUCUUUUAUAUAUA-3′,下游引物5′-CGCUAUCUUUCUAUUAUGACUCCAUAA-3′;U6上游引物5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATA-TAC-3′,下游引物5′-AAAAATATGGAACGCTTCAC-GAATTTG-3′。反應(yīng)結(jié)束后,采用比較循環(huán)閾值2-ΔΔCt法計(jì)算樣本內(nèi)miR-223相對(duì)表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3Exo的提取與鑒定 提取:PBS洗滌轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,將其置于高速低溫離心機(jī)中以4 ℃、3 000 r/min離心10 min,取上清液,移至干凈離心管;加入250 μl Exo分離試劑,輕輕混勻,4 ℃下靜置2 h,再以8 500 r/min離心30 min,棄去上清液,留沉淀,加入無菌PBS重懸,獲得Exo懸液,保存于-80 ℃中。鑒定:吸取10 μl Exo懸液滴入載樣銅網(wǎng)上,室溫吸附10 min,吸棄多余液體,滴加2%醋酸雙氧乙鈾溶液染色1 min,吸棄剩余染色液,自然晾干,將載樣銅網(wǎng)置于樣品室內(nèi),通過透射電子顯微鏡觀察Exo形態(tài)并攝取圖像。采用納米顆粒跟蹤分析對(duì)Exo的布朗運(yùn)動(dòng)進(jìn)行追蹤和分析,以計(jì)算直徑和濃度。收集提取的Exo,Western blot測(cè)定Exo標(biāo)志蛋白CD9、CD63及CD81表達(dá)情況,并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定miR-223的表達(dá)水平。

1.2.4Western blot 在Exo或腦組織中添加RIPA裂解液,提取總蛋白,BCA法對(duì)樣品進(jìn)行定量。100 ℃水浴煮沸使蛋白變性,室溫冷卻后,保存于-20 ℃。配置10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠,固定電泳裝置,向電泳槽注入電泳緩沖液,取等量蛋白樣品上樣至凝膠孔內(nèi),選擇適當(dāng)電壓進(jìn)行電泳分離蛋白。結(jié)束后,將分離的蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上,浸入5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉1 h。Exo鑒定中以兔抗人CD9、CD63、CD81多克隆抗體作為一抗(1 ∶1 000),細(xì)胞測(cè)定中兔抗人NLRP3、ASC、Caspase-1多克隆抗體作為一抗(1 ∶1 000),將膜與稀釋的一抗液置于4 ℃下共孵育過夜。次日,TBST洗膜,加入對(duì)應(yīng)二抗(1 ∶5 000),室溫孵育1 h,TBST清洗后,ECL超敏發(fā)光液發(fā)光顯影,觀察蛋白條帶,并通過Image Pro Plus軟件分析細(xì)胞內(nèi)蛋白條帶灰度值,以GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參蛋白,計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5TBI大鼠模型制備與分組處理 將40只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、NC-Exo組、miR-223-Exo組,每組10只。參考文獻(xiàn)[9],根據(jù)改良Feeney自由落體法制備TBI大鼠模型,將除假手術(shù)組外的其余3組大鼠通過腹腔注射10%水合氯醛麻醉,俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上,全身消毒,頭部備皮,沿大鼠顱骨正中線作一縱切口,完整暴露右側(cè)顱骨,于矢狀縫旁開3 mm位置應(yīng)用顱骨鉆制作直徑約5 mm的骨窗,將40 g砝碼自上方25 cm高度自由落下,撞擊腦組織,制備TBI大鼠模型,隨后止血并縫合。假手術(shù)組除不進(jìn)行撞擊操作外,其余操作相同。造模結(jié)束后,NC-Exo組和miR-223-Exo組大鼠分別通過尾靜脈注入轉(zhuǎn)染miR-NC質(zhì)粒、miR-223 mimic質(zhì)粒細(xì)胞來源的Exo(3×109個(gè)微粒),假手術(shù)組和模型組同時(shí)尾靜脈注射等量PBS溶液。

1.2.6HE染色 2周后,頸椎脫臼法處死各組大鼠,在冰盤上分離腦組織,清洗干凈后,置于4%多聚甲醛中固定過夜。將固定好的腦組織經(jīng)二甲苯透明和梯度乙醇溶液水化,OCT包埋,制備成4 μm厚的切片。切片進(jìn)行脫水與透明,蘇木精染色5 min,流水沖洗,1%鹽酸/乙醇溶液中分化數(shù)秒,流水沖洗,氨水返藍(lán),伊紅染色3 min,再用梯度乙醇溶液脫水,二甲苯透明,滴上中性樹膠覆蓋組織,封片,自然晾干,在光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病理學(xué)變化并拍攝圖像。

1.2.7Nissl染色 取制備的大鼠腦組織病理切片,二甲苯透明,梯度乙醇水化,加入Nissl染色10 min,蒸餾水洗滌,無水乙醇處理,二甲苯透明,滴上中性樹膠覆蓋組織,封片,自然晾干,在光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織染色情況并拍攝圖像,尼氏體呈淡紫藍(lán)色。

1.2.8ELISA法 2周后,各組大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,室溫靜置2 h,以4 000 r/min 4 °C離心10 min,獲得上清液。采用ELISA法對(duì)血清樣本中TNF-α、IL-1β、IL-6水平進(jìn)行測(cè)定,操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.9免疫熒光雙染法 取制備的各組大鼠腦組織切片,使用含有0.3%Triton X-100的PBS溶液浸泡透膜,冷丙酮固定10 min。滴加適量5%牛血清白蛋白溶液,室溫封閉30 min。棄去原液,滴加兔抗NLRP3多克隆抗體(1 ∶100)與小鼠抗Iba-1單克隆抗體(1 ∶100),進(jìn)行雙熒光標(biāo)記,置于4 ℃孵育過夜。PBS清洗切片3次,每次5 min。滴加異硫氰酸熒光素標(biāo)記的二抗(1 ∶500),室溫孵育1 h。PBS再次清洗切片,DAPI避光染核10 min,抗熒光淬滅封片劑封片,激光掃描共焦顯微鏡下觀察腦組織染色情況并拍攝圖像,通過Image Pro Plus軟件分析蛋白染色的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)束后,實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定結(jié)果顯示,3組細(xì)胞中miR-223相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=49.850,P<0.001)。miR-223組細(xì)胞中miR-223相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和miR-NC組(P<0.05),見圖1。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-223表達(dá)變化

2.2 Exo鑒定結(jié)果在透射顯微鏡下觀察到分離的顆粒物為球形囊泡,類似圓形小碟狀,由脂雙層密封,見圖2A,粒徑峰值大約處于120 nm,見圖2B;Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,Exo標(biāo)志蛋白CD9、CD63及CD81均明顯高表達(dá),見圖2C,以上結(jié)果說明成功分離到Exo。此外,經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定發(fā)現(xiàn),3組Exo中miR-223相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.205,P<0.001),miR-223組的miR-223相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組與miR-NC組(P<0.05),見圖2D,說明成功獲得高表達(dá)miR-223的Exo。

圖2 Exo鑒定

2.3 Exo轉(zhuǎn)運(yùn)miR-223改善TBI大鼠腦組織病理損傷通過HE染色觀察到假手術(shù)組大鼠腦組織內(nèi)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,大小較為一致,胞質(zhì)染色均勻;模型組大鼠腦組織間質(zhì)水腫,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,胞體腫脹或胞核皺縮、碎裂,且胞核呈深染色;與模型組比較,NC-Exo組大鼠腦組織損傷現(xiàn)象未得到明顯改善,而miR-223-Exo組大鼠腦組織間隙變小,細(xì)胞碎裂或胞核皺縮數(shù)目減少,損傷程度明顯減小。

經(jīng)Nissl染色后可見假手術(shù)組尼氏體染色均勻,細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰且分布均勻,數(shù)目較多;模型組大鼠尼氏體排列紊亂,出現(xiàn)壞死與胞核固縮、溶解的現(xiàn)象,數(shù)目也明顯減少;與模型組比較,NC-Exo組大鼠尼氏體仍表現(xiàn)為損傷,未發(fā)生明顯改變,miR-223-Exo組大鼠尼氏體數(shù)量明顯增加,細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常,見圖3。

圖3 HE染色和Nissl染色觀察各組大鼠腦組織病理學(xué)變化 ×200

2.4 Exo轉(zhuǎn)運(yùn)miR-223抑制TBI大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平ELISA法測(cè)定4組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平,結(jié)果顯示,各組間TNF-α、IL-1β、IL-6水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=426.975、559.172、299.013,P<0.001)。模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均高于假手術(shù)組(P<0.05);與模型組比較,miR-223-Exo組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低(P<0.05),NC-Exo組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 各組大鼠血清內(nèi)細(xì)胞因子水平比較

2.5 Exo轉(zhuǎn)運(yùn)miR-223抑制TBI大鼠腦組織NLRP3與Iba-1熒光表達(dá)4組大鼠腦組織切片經(jīng)免疫熒光染色后顯示,NLRP3與Iba-1的熒光染色強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=56.117、60.346,P<0.001)。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織內(nèi)NLRP3與Iba-1的熒光染色強(qiáng)度顯著增加(P<0.05);與模型組比較,miR-223-Exo組大鼠腦組織內(nèi)NLRP3與Iba-1的熒光染色強(qiáng)度顯著減少(P<0.05),NC-Exo組內(nèi)兩者的染色強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖4。

圖4 免疫熒光染色觀察各組大鼠腦組織NLRP3與Iba-1表達(dá) ×100

2.6 Exo轉(zhuǎn)運(yùn)miR-223抑制TBI大鼠腦組織內(nèi)NLRP3炎癥小體途徑相關(guān)蛋白表達(dá)Western blot測(cè)定4組大鼠腦組織內(nèi)NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示,各組間NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.546、47.051、41.359,P<0.001)。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織內(nèi)NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05);而與模型組比較,miR-223-Exo組大鼠腦組織內(nèi)NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05),NC-Exo組與模型組大鼠腦組織內(nèi)NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖5。

圖5 Western blot測(cè)定各組大鼠腦組織內(nèi)NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表達(dá)

3 討論

既往研究表明,miRNA表達(dá)水平改變與TBI密切相關(guān),例如,已在TBI大鼠腦組織中miRNA-21-5p表達(dá)水平增加,上調(diào)miRNA-21-5p表達(dá)可以通過抑制炎癥反應(yīng)和減少細(xì)胞凋亡來緩解受損腦微血管內(nèi)皮屏障的泄漏,改善大鼠神經(jīng)功能障礙[10];在TBI小鼠中上調(diào)miRNA-23a-3p表達(dá)能夠抑制皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡并改善神經(jīng)功能,有效減輕TBI小鼠腦組織病理損傷[11];上調(diào)miRNA-9-5p表達(dá)通過激活Hedgehog通路和抑制NF-κB/MMP-9通路來緩解血腦屏障損傷和神經(jīng)炎癥反應(yīng),從而促進(jìn)TBI后神經(jīng)功能的恢復(fù)[12]。目前,關(guān)于miR-223在各種腦損傷的研究報(bào)道也不斷增多,Sha et al[13]研究表明電針灸治療顯著降低了缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分和腦梗死面積,并揭示這一作用是通過提高梗死皮質(zhì)組織中miR-223表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的;Huang et al[14]研究發(fā)現(xiàn)在出血后丘腦痛小鼠模型中miR-223表達(dá)下降,注射miR-223 agomir能夠抑制炎癥因子表達(dá),并改善丘腦出血誘導(dǎo)的中樞性中風(fēng)疼痛;Zhao et al[15]研究指出miR-223-3p能夠通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活后介導(dǎo)的促炎反應(yīng),從而減輕大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注大鼠腦組織損傷。以上研究結(jié)果均提示,miR-223具有成為TBI診斷及治療靶標(biāo)的潛力。

Exo具有生物相容性好、免疫原性低、穩(wěn)定性高和能夠穿越血腦屏障等特點(diǎn),因而將其作為藥物或分子遞送載體在包括腦疾病在內(nèi)的靶向治療中獨(dú)具優(yōu)勢(shì)[16-17]。以Exo作為載體運(yùn)轉(zhuǎn)miRNA可以改變腦組織結(jié)構(gòu)及功能,這為TBI的治療提供新途徑。高迎吉 等[18]研究表明Exo能夠通過遞送miR-124抑制急性創(chuàng)傷性脊髓損傷大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化,減輕炎癥反應(yīng),從而對(duì)大鼠起到保護(hù)作用;Long et al[19]研究指出星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的Exo能夠通過運(yùn)轉(zhuǎn)miR-873a-5p抑制NF-κB信號(hào)通路,減弱小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥并改善了TBI后神經(jīng)缺陷;Zhang et al[20]研究表明富集miR-17-92的Exo能夠傳遞miR-17-92至TBI受損組織,從而改善運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能障礙,減少神經(jīng)炎癥和增強(qiáng)內(nèi)源性血管生成,并抑制神經(jīng)元丟失。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)Exo轉(zhuǎn)運(yùn)miR-223處理的TBI大鼠腦組織損傷明顯減輕,尼氏體數(shù)量增加且細(xì)胞形態(tài)趨于正常,這表明Exo轉(zhuǎn)運(yùn)miR-223能夠有效改善TBI大鼠腦部病理損傷。

TBI分為兩個(gè)階段,第一階段為原發(fā)性損傷,特征是血腦屏障改變和破壞,血流量減少以及對(duì)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的直接損傷。第二階段為繼發(fā)性損傷,發(fā)生在損傷后幾分鐘、幾小時(shí)、幾個(gè)月甚至幾年內(nèi),神經(jīng)炎癥反應(yīng)在該階段起核心作用,引起細(xì)胞變性以及神經(jīng)/突觸傳遞和可塑性的改變[21]。神經(jīng)炎癥反應(yīng)過程較為復(fù)雜,包括小膠質(zhì)細(xì)胞和外周中性粒細(xì)胞活化、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤、促炎和抗炎細(xì)胞因子釋放以及免疫細(xì)胞募集,其中,小膠質(zhì)細(xì)胞激活后誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的產(chǎn)生,導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和神經(jīng)功能障礙[3,22]。NLRP3是參與TBI中神經(jīng)炎癥反應(yīng)的主要成分之一,TBI發(fā)生后受傷腦皮層中NLRP3炎癥小體復(fù)合物形成增加,其激活被認(rèn)為是TBI后初始組織損傷擴(kuò)增的主要原因[23-24]。作為神經(jīng)炎癥信號(hào)通路的重要靶點(diǎn),靶向抑制NLRP3炎性小體的形成和激活是TBI的前瞻性療法。已有研究表明miR-223能夠調(diào)控NLRP3的表達(dá)水平及其相關(guān)途徑的激活,從而調(diào)控炎癥性損傷,例如,miR-223-3p能夠抑制梅毒螺旋體誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中NLRP3炎性小體活化,這為梅毒提供潛在的治療靶點(diǎn)[25];miR-223-3p可能通過靶向牙周炎中的NLRP3來調(diào)節(jié)GSDMD介導(dǎo)的神經(jīng)凋亡,并抑制NLRP3下游炎癥介質(zhì)IL-1β和IL-6的分泌[26];miR-223通過直接結(jié)合到NLRP3的3′-未翻譯區(qū)域來抑制其表達(dá),并降低慢性坐骨神經(jīng)損傷小鼠脊髓中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表達(dá)水平,增加了M2型巨噬細(xì)胞的比例,從而改善慢性坐骨神經(jīng)損傷小鼠的神經(jīng)性疼痛[27]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)Exo轉(zhuǎn)運(yùn)miR-223處理的TBI大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低,腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba-1與NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)均下降,由此說明,Exo轉(zhuǎn)運(yùn)miR-223能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活與NLRP3炎性小體活化,從而降低TBI大鼠神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

綜上所述,Exo轉(zhuǎn)運(yùn)miR-223能夠減輕TBI大鼠腦部病理損傷,抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活與炎癥反應(yīng),該作用可能與抑制NLRP3炎性小體活化有關(guān),本研究為TBI的治療提供了新思路。但在此過程中miR-223調(diào)控的具體靶標(biāo)或相關(guān)信號(hào)通路尚不清楚,有待后續(xù)進(jìn)一步探索。