羅 清,張 露,黃自坤,符碧琪,李俊明

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種病因不明的、以免疫性炎癥為突出表現(xiàn)的自身免疫性疾病,其特征是出現(xiàn)多種致病性自身抗體,導(dǎo)致多器官、多組織損傷[1]。雖然SLE的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,但大量研究[2]證實(shí)濾泡輔助性T細(xì)胞與SLE的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來發(fā)現(xiàn)在自身免疫性疾病炎癥組織和外周血中存在一種新型CD4+T細(xì)胞亞群,定義為“外周輔助性T細(xì)胞”,即程序性死亡因子1(programmed death 1, PD1)陽性的CXCR5-CD4+T細(xì)胞(PD1+CXCR5-CD4+T)[3-4]。且研究[5-7]表明PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞的功能與濾泡輔助性T細(xì)胞類似,可促進(jìn)B細(xì)胞向漿細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和致病性自身抗體的產(chǎn)生從而參與SLE的致病。但目前并未見系統(tǒng)性的探討PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞上PD1表達(dá)平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity, MFI)的臨床意義。

目前用于SLE診斷的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查會造成一定程度的SLE漏診和誤診[8-9]。近期,有研究者提出可采用免疫細(xì)胞和常規(guī)指標(biāo)的聯(lián)合建模來預(yù)測疾病以及評估疾病的嚴(yán)重程度[10-11]。該研究首次以PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞為研究目標(biāo),聯(lián)合常規(guī)指標(biāo)建模,探討CXCR5-CD4+T細(xì)胞上PD1的表達(dá)含量以及預(yù)測模式在SLE預(yù)測中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料本研究募集了2019年5—9月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的SLE患者47例(男3例,女44例),平均年齡(36.9±13.4)歲,采用的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)為1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)制定的SLE分類(診斷)標(biāo)準(zhǔn)[12],并排除腫瘤、感染、腎功能衰竭、其他自身免疫性疾病等。詳細(xì)收集SLE患者相關(guān)臨床信息及實(shí)驗(yàn)室檢查數(shù)據(jù),并根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算其疾病活動性評分(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)[13],平均SLEDAI(10.3±5.9)分,按SLEDAI是否≥10分,將SLE患者分為活動組22例和非活動組25例。SLE患者根據(jù)病情嚴(yán)重程度采用激素和(或)免疫抑制藥物(SLEDAI<9分病情輕度活動者用潑尼松或糖皮質(zhì)激素+羥氯喹/甲氨蝶呤/來氟米特,SLEDAI為10～14分的病情中度活動者用糖皮質(zhì)激素+環(huán)磷酰胺/霉酚酸酯,SLEDAI≥15分病情重度活動者先用糖皮質(zhì)激素沖擊加環(huán)磷酰胺,再按病情中度活動治療方案)進(jìn)行治療。入選的47例SLE患者有6例在治療前后(至少治療1周)均收集了血液樣本。同時(shí)期,收集了35例健康志愿者作為健康對照(healthy control, HC)組(男4例,女31例),并排除具有風(fēng)濕病史和有風(fēng)濕病家族史,平均年齡(41.7±9.2)歲。兩組在性別、年齡上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究獲得了醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號:(2022)CDYFYYLK(06-005)]。

1.2 試劑和儀器本研究采用的流式細(xì)胞抗體:鼠抗人PD1抗體(fluorescein isothiocyanate-PD1,FITC-PD1)、CXCR5抗體(PC7-CXCR5)購于美國eBioscience公司;鼠抗人CD4抗體(phycoerythrin-texas red,ECD-CD4)及相應(yīng)的同型對照抗體FITC-IgG1購自美國Beckman Coulter公司?？购丝贵w(antinuclear antibodies, ANA)、抗雙鏈DNA抗體(anti-double strand DNA antibody, anti-dsDNA)、抗Sm抗體(anti-Smith antibody, anti-Sm)、抗SSA抗體(anti-Sj?gren syndrome A antigen antibody, anti-SSA)、抗SSB抗體(anti-Sj?gren syndrome B antigen antibody, anti-SSB)、anti-Ro52、抗組蛋白抗體(anti-Histone)、抗核小體抗體(anti-nucleosome, anti-AnuA)、抗抗糖體蛋白P抗體(anti-ribosomal P-protein antibody, anti-Rib-P)檢測試劑盒購自歐蒙(杭州)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司。外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)分離液(Ficoll-Paque)購于美國Sigma公司。流式細(xì)胞儀Cytomics FC 500購于美國Beckman Coulter公司,采用的分析軟件為儀器自帶的CXP分析系統(tǒng),動態(tài)血沉儀購自北京普利生公司,IMMAGE800購自美國Beckman Coulter公司,XN-10型儀器購自日本 Sysmex公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)本采集及外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)提取 分別空腹采集每例HC和SLE患者5 ml 乙二胺四乙酸抗凝外周血,采集當(dāng)天對抗凝全血標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測。按照PBMC Ficoll-Paque分離液操作規(guī)程,將收集的新鮮受試者全血、磷酸鹽緩沖液、Ficoll-Paque分離液按照三者同等比例混合,常溫1 500 r/min離心20 min后緩慢降速至停止,吸出的中間白膜層即為PBMC,采用磷酸鹽緩沖液洗滌后重懸,用于后續(xù)流式檢測。

1.3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測PBMC表面分子 各取受試者100 μl 生理鹽水重懸的PBMC(2×105)加入3個(gè)待測試管中,分別加入以下組合流式檢測抗體各10 μl:ECD-CD4、PC7-CXCR5、FITC-IgGl;ECD-CD4、PC7-CXCR5、FITC-PD1;PC5-CD19、PE-CD27、FITC-CD38在4 ℃條件下避光孵育30 min,如有殘留的紅細(xì)胞,則需采用紅細(xì)胞裂解處理,再生理鹽水洗滌,1 500 r/min離心5 min,棄上清液,重懸后用Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀檢測分析,使用自帶分析軟件分析PD1在CXCR5-CD4+細(xì)胞上的表達(dá)情況以及漿母細(xì)胞(CD19+CD27+CD38+)的比例。

1.3.3SLE的其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測 采用動態(tài)血沉儀法檢測紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR);采用速率散色比濁法檢測C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)、補(bǔ)體C3(complement 3, C3)和補(bǔ)體C4(complement 4, C4);采用間接免疫熒光法檢測ANA和anti-dsDNA,采用線性印記法檢測anti-Sm、anti-SSA、anti-SSB、anti-Ro52、anti-Histone、 anti-AnuA、anti-Rib-P;采用XN-10型儀器檢測血常規(guī)指標(biāo),獲取白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell, WBC)、血小板計(jì)數(shù)(platelet, PLT)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(lymphocyte, L)、淋巴細(xì)胞百分比(percentage of lymphocyte, L%)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)(monocyte, M)、單核細(xì)胞百分比(percentage of monocyte, M%)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(neutrophil, N)、中性粒細(xì)胞百分比(percentage of neutrophil, N%)、血紅蛋白(hemoglobin, HGB)、血細(xì)胞比容(hematocrit, HCT),并根據(jù)這些指標(biāo)計(jì)算LMR(L/M)、NLR(N/L)、PLR(PLT/L)、SII(PLT×N/L)、dNLR[N/(WBC-N)]、MNR(M/N)、PMR(PLT/M)、PNR(PLT/N)。

2 結(jié)果

2.1 PD1在SLE患者和HC外周血CXCR5-CD4+T 細(xì)胞的表達(dá)水平SLE患者PD1+CXCR5-CD4+T 細(xì)胞百分率[(25.27±12.65)%vs(17.75±8.42)%]高于HC,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008 3,U=540.5),見圖1B;SLE 患者CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI[(2.23±0.57)vs(1.61±0.22)]高于HC,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1,U=187.0),見圖1C。

2.2 SLE患者外周血CXCR5-CD4+T 細(xì)胞PD1表達(dá)水平與疾病活動性指標(biāo)、漿母細(xì)胞比例相關(guān)將反映SLE患者疾病活動性指標(biāo)(SLEDAI、ESR、CRP、WBC、紅細(xì)胞(red blood cell,RBC)、HGB、HCT、PLT、L、L%、M、M%、N、N%、NLR、PLR、LMR、dNLR、SII、MNR、PMR、PNR、IgG、C3、C4、ANA、anti-dsDNA、anti-Sm、anti-SSA、anti-SSB、anti-Ro52、anti-Histone、anti-AnuA、anti-Rib-P、治療、關(guān)節(jié)炎、皮疹、脫發(fā)、漿膜炎、口腔潰瘍、腎臟損傷等)與CXCR5-CD4+T 細(xì)胞PD1表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示,PD1+CXCR5-CD4+T 細(xì)胞百分率與C3呈負(fù)相關(guān),與LMR有負(fù)相關(guān)的趨勢,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1。PD1+CXCR5-CD4+T 細(xì)胞百分率在anti-SSA、anti-Histone陽性的SLE患者高于陰性者,治療后PD1+CXCR5-CD4+T 細(xì)胞百分率低于治療前,見表2;并未發(fā)現(xiàn)PD1+CXCR5-CD4+T 細(xì)胞百分率與其他指標(biāo)相關(guān);CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI與SLEDAI、ESR、CRP、N%、NLR、dNLR呈正相關(guān),與RBC、HGB、HCT、L、L%、LMR呈負(fù)相關(guān),見表1。CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI在anti-SSA陽性的SLE患者有高于陰性者的趨勢,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI在anti-Ro52陽性的SLE患者高于陰性者,治療后CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI低于治療前,CXCR5-CD4+T 細(xì)胞PD1表達(dá)的MFI在腎臟損傷SLE患者有高于陰性者的趨勢,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表3;并未發(fā)現(xiàn)CXCR5-CD4+T 細(xì)胞PD1表達(dá)的MFI與其他指標(biāo)相關(guān)。

表1 SLE患者外周血CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1的表達(dá)與疾病活動性指標(biāo)、漿母細(xì)胞比例相關(guān)性分析

表2 SLE患者外周血PD1+CXCR5-CD4+T 細(xì)胞百分率與疾病活動性指標(biāo)的關(guān)系

表3 SLE患者外周血CXCR5-CD4+T 細(xì)胞PD1表達(dá)的MFI與疾病活動性指標(biāo)的關(guān)系

自身抗體的產(chǎn)生與B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿母細(xì)胞(CD19+CD27+CD38+)的能力有關(guān),進(jìn)一步分析SLE患者外周血CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)水平與漿母細(xì)胞比例的關(guān)系發(fā)現(xiàn),SLE患者外周血PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞百分率、CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI均與漿母細(xì)胞比例呈正相關(guān),見表1。

表4 納入PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞百分率、CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI的方程

2.4 CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI和常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對SLE的預(yù)測價(jià)值采用ROC評估CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)水平對SLE的預(yù)測價(jià)值,結(jié)果顯示PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞百分率、CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI、聯(lián)合PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞百分率和CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI預(yù)測SLE的AUC分別為0.671、0.886、0.878,敏感度分別為36.17%、87.23%、65.96%,特異度分別為97.14%、77.14%、97.14%,見圖2、表5。

表5 外周血CXCR5-CD4+T 細(xì)胞PD1表達(dá)水平對 SLE患者的預(yù)測效能

圖2 外周血CXCR5-CD4+T 細(xì)胞PD1表達(dá)水平對 SLE患者的預(yù)測作用

如表6所示,SLE患者與HC的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)中,RBC、HGB、HCT、PLT、L、L%、M%、N%、NLR、PLR、LMR、dNLR、SII、PMR、PNR在兩組之間存在差異(P<0.05)。ROC曲線分析這些差異常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對SLE的預(yù)測價(jià)值發(fā)現(xiàn),RBC、HGB、HCT、L、L%、NLR、LMR的AUC大于0.800。由于標(biāo)本量不夠大,本研究選擇SLE的危險(xiǎn)因素CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI和AUC大于0.800的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)(RBC、HGB、HCT、L、L%、NLR、LMR)進(jìn)行單因素和多因素分析,篩選出可用于SLE預(yù)測建模的指標(biāo),如表7所示,CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI和HGB用于預(yù)測建模。根據(jù)邏輯回歸系數(shù),本研究構(gòu)建的SLE預(yù)測模型為:P=8.41×CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI-0.27×HGB+19.80,P值為預(yù)測數(shù)值。計(jì)算各個(gè)樣本的預(yù)測數(shù)值,SLE患者的預(yù)測數(shù)值[(9.17±9.07)vs(-3.86±2.39)]高于HC(P<0.000 1,U=35.0),見圖3A。采用ROC曲線分析預(yù)測模式對SLE的預(yù)測價(jià)值,發(fā)現(xiàn)Cut-off值為-0.204時(shí),其AUC、敏感度、特異度分別為0.979、95.74%、97.14%,見圖3B。且預(yù)測模式與SLEDAI呈正相關(guān)(rs=0.313 6,P=0.030 3),見圖3C。

表6 SLE患者和HC常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)特點(diǎn)和指標(biāo)預(yù)測價(jià)值

表7 單因素和多因素分析與SLE相關(guān)的危險(xiǎn)因素

圖3 基于CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI和HGB預(yù)測模式的預(yù)測價(jià)值

3 討論

外周輔助性T細(xì)胞(PD1+CXCR5-CD4+T)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一群CD4+T細(xì)胞亞群,其可促進(jìn)B細(xì)胞向漿細(xì)胞轉(zhuǎn)化和致病性自身抗體的產(chǎn)生[3-4]。國外學(xué)者Bocharnikov et al[6]和國內(nèi)學(xué)者[5, 7]的報(bào)道均表明PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞比例在SLE的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。但關(guān)于PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞上PD1表達(dá)MFI與SLE的關(guān)系卻鮮為報(bào)道。本研究對SLE患者和HC外周血PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞比例和PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示兩組外周血PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞比例和PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI均不相同,SLE患者PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞比例和PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI顯著高于HC,且隨著疾病活動度的增加而升高;在抗體陽性患者組,PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞比例和PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI均高于對應(yīng)陰性組,提示PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞比例越高、PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI越高,患者體內(nèi)的自身抗體越多,SLE病情越活躍。進(jìn)一步研究分析發(fā)現(xiàn),PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞比例、PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI均與促進(jìn)抗體產(chǎn)生的漿母細(xì)胞比例呈正相關(guān)。此外,SLE患者外周血PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞比例、PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI均與SLE治療相關(guān),治療緩解后PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞比例、PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI均下降。這些關(guān)于SLE患者中PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞比例的研究結(jié)果與相關(guān)研究[5-7]是一致的。此外,本研究結(jié)果還表明PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI越強(qiáng),產(chǎn)生的自身抗體越多、SLE患者活動性和疾病嚴(yán)重程度越高。這與張力 等[14]關(guān)于濾泡輔助性T細(xì)胞上PD1表達(dá)可以作為評估自身免疫病疾病嚴(yán)重程度和活動性指標(biāo)相一致。

雖然PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞比例、PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI均與SLE患者活動性和疾病嚴(yán)重程度相關(guān),但PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI與更多的SLE患者活動性和疾病嚴(yán)重程度指標(biāo)(SLEDAI、ESR、CRP、RBC、HGB、HCT、L、L%、N%、NLR、LMR、dNLR)相關(guān),表明PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI可能在SLE致病中所起的作用更強(qiáng)。且進(jìn)一步邏輯回歸分析上調(diào)的PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞比例、CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI是否為SLE的發(fā)病危險(xiǎn)因素,結(jié)果表明上調(diào)的CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI是SLE發(fā)病的危險(xiǎn)因素,而PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞比例并不是。這些研究結(jié)果表明PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)強(qiáng)弱在SLE致病中起主導(dǎo)作用。

近年來,有學(xué)者致力于探討免疫細(xì)胞以及免疫細(xì)胞結(jié)合常規(guī)指標(biāo)對免疫相關(guān)性疾病的預(yù)測價(jià)值[10, 15-16]。本研究采用ROC曲線分析PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞比例、CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI、聯(lián)合兩者對SLE的預(yù)測價(jià)值發(fā)現(xiàn),CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI的AUC最高(0.886),敏感度和特異度分別為87.23%、77.14%。 此外有研究[11]表明血常規(guī)以及相關(guān)比值等指標(biāo)可用于疾病以及疾病嚴(yán)重程度的預(yù)測,考慮到SLE患者血常規(guī)指標(biāo)存在異常,并且血常規(guī)指標(biāo)是簡便、低廉、易獲取的指標(biāo),本研究分析這些指標(biāo)對SLE的預(yù)測價(jià)值發(fā)現(xiàn),RBC、HGB、HCT、L、L%、NLR、LMR的AUC大于0.800。進(jìn)一步采用單因素和多因素分析篩選CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI、RBC、HGB、HCT、L、L%、NLR、LMR是否為SLE相關(guān)危險(xiǎn)因素時(shí),發(fā)現(xiàn)CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI和HGB是其危險(xiǎn)因素。本研究將CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI和HGB納入SLE預(yù)測模型,升高的預(yù)測數(shù)值對SLE具有明顯的預(yù)測作用,其AUC、敏感度、特異度分別為0.979、95.74%、97.14%,并且與SLE疾病活動性明顯相關(guān)。這些結(jié)果表明包含CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI和HGB的預(yù)測模型不僅可以用于SLE的預(yù)測,還可以用于疾病活動性的評估。

此外,本文還存在一些不足之處:一是標(biāo)本量太少;二是未探討SLE預(yù)測模型在疾病對照組中的數(shù)值以及區(qū)分SLE與其他疾病的能力。

綜上所述,SLE患者升高的外周血PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞比例、PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI與疾病嚴(yán)重程度及活動性相關(guān),升高的PD1+CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI是SLE的危險(xiǎn)因素,基于CXCR5-CD4+T細(xì)胞PD1表達(dá)MFI和HGB的SLE預(yù)測模型既可以用于SLE的預(yù)測,也可以用于疾病活動性的評估。但仍需進(jìn)一步探討SLE預(yù)測模型在SLE預(yù)測及疾病活動性評估中的作用。