劉 敏,高南南,王 崇,蔡亦紅

剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)是一種能在絕大多數(shù)溫血?jiǎng)游镏袀鞑サ膶Ｐ园麅?nèi)寄生蟲(chóng)[1]。免疫力正常的人群感染弓形蟲(chóng)后,一般不會(huì)出現(xiàn)明顯的臨床癥狀,但是在免疫力受損個(gè)體,如艾滋病患者[2]等,潛伏的蟲(chóng)體會(huì)被再次激活,從而引起弓形蟲(chóng)病,甚至致命。鐵(Fe)是人體必須的微量元素,其主要儲(chǔ)存在肝臟中。既往研究表明鐵是宿主與病原體相互作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑之一[3],如細(xì)菌必須從宿主體內(nèi)攝取鐵才能完成自身的增殖從而引起疾病[4]。本課題組前期研究[5]表明,弓形蟲(chóng)感染可影響小鼠體內(nèi)諸多器官中多種金屬元素的組織留存,但是肝臟中鐵元素的改變?cè)诠蜗x(chóng)肝病中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。1,2-二甲基-3-羥基-4-酮(deferione,DFP)是美國(guó)EMA和 FDA批準(zhǔn)使用的藥物,被廣泛應(yīng)用于治療鐵過(guò)載及其相關(guān)疾病。有研究[6]表明,DFP對(duì)輸血性鐵過(guò)載和去除心臟中鐵過(guò)載都有很好的療效。此外,DFP、去鐵胺等鐵螯合劑能從瘧原蟲(chóng)寄生的細(xì)胞中降低鐵含量來(lái)抑制蟲(chóng)體的生長(zhǎng)[7]。

鐵蛋白是體內(nèi)廣泛存在的鐵貯存蛋白,是由不同比例的24個(gè)肽亞基組成的納米籠構(gòu)成,在鐵代謝中起重要作用。γ干擾素(γ interferon,IFN-γ)是由肝巨噬細(xì)胞分泌并位于肝竇內(nèi)表面的細(xì)胞因子,其負(fù)責(zé)誘導(dǎo)肝臟損傷,引起炎癥反應(yīng)[8]。該研究利用我國(guó)優(yōu)勢(shì)基因蟲(chóng)株Chinese1型弱毒株TgCtWh6構(gòu)建弓形蟲(chóng)慢性感染模型,檢測(cè)小鼠肝臟中多種元素組織留存情況,觀察DFP對(duì)弓形蟲(chóng)慢性感染小鼠肝臟鐵代謝的影響,探討弓形蟲(chóng)感染導(dǎo)致肝損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 弓形蟲(chóng)我國(guó)流行的弓形蟲(chóng)Chinese1的優(yōu)勢(shì)基因型TgCtwh6蟲(chóng)株來(lái)自人獸共患病安徽高校省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,通過(guò)小鼠傳代保種。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡雌性C57BL/6雌鼠分為4組,每組6只,20～25 g,按照安徽醫(yī)科大學(xué)《研究動(dòng)物護(hù)理和使用指導(dǎo)原則》進(jìn)行飼養(yǎng),正常采食飲水。飼養(yǎng)的環(huán)境溫度保持在20～25 ℃,相對(duì)濕度為40%～70%。

1.3 主要試劑濃硝酸(HNO3,優(yōu)級(jí)純)和30%雙氧水(30%H2O2,分析純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;20 mg/L 24種多元素混合外標(biāo)溶液、2 μg/L 7種多元素混合內(nèi)標(biāo)溶液購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心;實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.25 MΩ);SteadyPure通用型RNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)主要試劑和蛋白標(biāo)志物購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司;TRIzol、oligo(dT)磁珠、逆轉(zhuǎn)錄酶、dUTP Solution購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司;Western blot配膠主要試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;BCA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自山東思科捷生物技術(shù)有限公司;鼠源辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的甘油醛-3-磷酸脫氫(glyceraldehyde-3-phosphatedehydroge-nase,GAPDH)單抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;引物由通用生物(安徽)股份有限公司合成,內(nèi)參引物GAPDH由上海生工合成,見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR反應(yīng)引物

1.4 主要儀器Clin-CP-QMS-Ⅰ微量元素分析儀(北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司),DigiBlock電熱消解儀(ST36-iTouch)(北京萊伯泰科儀器股份有限公司),ME 104分析天平(上海梅特勒-托利多有限公司),HK-UV-20型純水儀(合肥宏科科技有限公司),微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)賽默飛公司),LightCycler?96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司),TBA法(南京建成生物工程研究所有限公司),Infinite 200 PRO多功能微孔板酶標(biāo)儀(上海帝肯貿(mào)易有限公司),電泳儀(北京六一公司),凝膠成像儀(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.5 小鼠肝臟組織中的鐵及其他金屬元素的檢測(cè)將冷凍后的肝組織取出,用超純水沖洗2～3次,然后用濾紙將肝臟組織表面的水分吸干,精確稱取0.05 g的肝臟組織,用混合的消化液,體積比為硝酸 ∶雙氧水=2 ∶1,在電熱消解器中消解,再用超純水進(jìn)行定容。經(jīng)Clin-ICP-QMS-Ⅰ微量元素分析儀測(cè)定并計(jì)算鐵元素及其他金屬元素含量,鐵元素(其他金屬元素)含量=CV/m,其中C為樣品中鐵元素(其他金屬元素)濃度(μg/ml),V為樣品定容體積(ml),m為樣品質(zhì)量(g)。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)小鼠肝臟中Fth和IFN-γ相對(duì)濃度根據(jù)RNA提取試劑盒的方法,從小鼠肝組織中提取 RNA,利用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA的濃度,然后將合成的cDNA于-20 ℃保存,將其余RNA于-80 ℃保存。10 μl逆轉(zhuǎn)錄體系:5×Evo M-MLV RT Master Mix 2 μl,依據(jù)RNA濃度添加RNA(500 ng總RNA),無(wú)酶水補(bǔ)足至10 μl;反應(yīng)條件:37 ℃15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃。10 μl qRT-PCR反應(yīng)體系:2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 5 μl、cDNA模板2 μl、Premix F 0.3 μl、Premix R 0.3 μl,無(wú)酶水補(bǔ)足至10 μl;反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min預(yù)變性,95 ℃ 10 s,60 ℃ 10 s,72 ℃ 10 s,共40次循環(huán)?；趦?nèi)參基因GAPDH分析PCR結(jié)果,并通過(guò)2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 Western blot檢測(cè)小鼠肝臟中Fth和IFN-γ相對(duì)濃度取小鼠約50 g肝臟組織,加入RIPA裂解緩沖液提取總蛋白,通過(guò) BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白煮沸變性后用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)對(duì)4組小鼠肝組織進(jìn)行測(cè)定,然后用標(biāo)準(zhǔn)程序轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用5%脫脂牛奶封閉1.5 h,封閉完成后用TBST洗膜3次,每次10 min。在4 ℃下與兔源IFN-γ或Fth(稀釋1 000倍)孵育過(guò)夜后,用TBST洗膜3次,每次10 min。在室溫條件下孵育二抗1.5 h(1 ∶10 000稀釋),再用TBST洗膜3次,每次10 min,最后用凝膠成像儀成像,其結(jié)果采用ImageJ 1.8.0軟件對(duì)Western blot進(jìn)行分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 6.02軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩間比較采用LSD法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝臟組織中Fe2+含量經(jīng)ICP-MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn),4組小鼠肝臟中Fe2+含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.22,P<0.05)。與control組相比,control+DFP組小鼠肝臟組織中Fe2+含量明顯上調(diào)(P<0.05),control組與TgCtwh6組相比,發(fā)現(xiàn)TgCtwh6組小鼠肝臟中Fe2+含量明顯上調(diào)(P<0.05)。經(jīng)DFP治療后,TgCtwh6+DFP組肝臟中的Fe2+含量與TgCtwh6組相比顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖1A。

圖1 肝臟中各種金屬元素含量水平

2.2 小鼠肝臟組織中多種金屬元素含量通過(guò)ICP-MS檢測(cè)發(fā)現(xiàn),4組小鼠肝臟組織中的Al、Cu、Mn、Zn、Mg五種金屬元素,除了Zn和Mn元素在TgCtwh6組有所上調(diào)以外(P<0.05),其余組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖1B。

2.3 小鼠肝臟組織中Fth mRNA相對(duì)表達(dá)量通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),4組小鼠肝臟組織中Fth mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=74.70,P<0.05)。與control組相比,control+DFP組小鼠肝臟組織中Fth mRNA含量無(wú)明顯變化(P>0.05)。control組與TgCtwh6組相比小鼠肝臟組織中Fth mRNA含量上調(diào)(P<0.05)。在使用DFP后,與感染組相比,Fth mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 四組小鼠肝臟中Fth、IFN-γ mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.4 小鼠肝臟組織中IFN-γ相對(duì)表達(dá)量qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),4組小鼠肝臟組織中IFN-γ相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=368.5,P<0.05)。與control組相比,control+DFP組小鼠肝臟組織中IFN-γ含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TgCtwh6感染后,小鼠肝臟組織中IFN-γ含量上調(diào)(P<0.05),TgCtwh6組與TgCtwh6+DFP組相比小鼠肝臟組織中IFN-γ含量下調(diào)(P<0.05),見(jiàn)圖2。

2.5 小鼠肝臟組織中Fth蛋白檢測(cè)結(jié)果4組小鼠的Fth蛋白相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.3,P<0.05)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)control組和control+DFP組Fth蛋白含量相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與control組相比,TgCtwh6組Fth蛋白含量明顯上調(diào)(P<0.05),應(yīng)用DFP后,TgCtwh6+DFP組的小鼠肝臟中Fth蛋白含量明顯下調(diào)(P<0.05),見(jiàn)圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)4組小鼠肝細(xì)胞中Fth、IFN-γ蛋白表達(dá)水平

2.6 小鼠肝臟組織中IFN-γ的檢測(cè)結(jié)果4組小鼠IFN-γ的相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=142.3,P<0.05)。Western blot檢測(cè)顯示,control組和control+DFP組相比,IFN-γ表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但TgCtwh6組與control組相比IFN-γ含量明顯上調(diào)(P<0.05),與TgCtwh6組相比,TgCtwh6+DFP組的小鼠肝臟中IFN-γ含量明顯下調(diào)(P<0.05),見(jiàn)圖3。

3 討論

肝臟在鐵代謝中發(fā)揮重要作用,它不僅是鐵元素的主要儲(chǔ)存場(chǎng)所,也參與鐵運(yùn)輸和鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的復(fù)雜分子體系[9]。弓形蟲(chóng)可以在肝細(xì)胞中寄生,造成肝臟受損,影響肝組織中微量元素的穩(wěn)定,干擾機(jī)體蛋白質(zhì)及酶的合成以及相關(guān)的生化反應(yīng)[10]。健康小鼠體內(nèi)的鐵代謝與儲(chǔ)存處于一個(gè)平衡狀態(tài),在服用DFP后肝臟中鐵元素含量上升,推測(cè)可能是由于DFP與Fe3+具有親和力,其結(jié)合形成的復(fù)合物在廣泛的 pH 值范圍內(nèi)穩(wěn)定,能快速通過(guò)細(xì)胞膜而清除細(xì)胞內(nèi)的鐵,再通過(guò)尿液排出[11]。由于DFP螯合了肝臟中一部分游離的Fe3+,影響了健康小鼠肝臟內(nèi)鐵的平衡,促使肝臟進(jìn)一步加快對(duì)鐵的吸收,造成肝臟中鐵元素含量上升,但其具體機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究。弓形蟲(chóng)寄生于機(jī)體內(nèi),為滿足自身生長(zhǎng)繁殖,就必須從宿主體內(nèi)攝取微量金屬元素,宿主自身細(xì)胞為清除蟲(chóng)體也會(huì)影響微量金屬元素的含量,寄生蟲(chóng)與宿主之間的相互作用勢(shì)必會(huì)打破原有的微量金屬元素平衡[12]。弓形蟲(chóng)感染后小鼠肝臟組織中鐵元素含量上升,造成鐵代謝紊亂。對(duì)感染小鼠給予DFP治療后,肝臟組織中鐵元素含量顯著下降。提示DFP可有助于改善弓形蟲(chóng)感染所導(dǎo)致的鐵紊亂。

肝臟內(nèi)可貯存和代謝部分鐵,鐵水平變化可影響肝臟損傷的發(fā)生和發(fā)展,因此肝臟中鐵蛋白水平可以很好地反映肝臟的損傷程度。鐵蛋白的肽亞基包括Fth和鐵蛋白輕鏈(ferritin light chain,Ftl)兩種類型,并且Fth中的含鐵量高于Ftl[13]。相關(guān)研究表明Fth水平與肝臟多種疾病的發(fā)生和發(fā)展呈正相關(guān)[14],同時(shí),Fth還具有鐵氧化酶活性[15],可以將Fe2+氧化成Fe3+,將多余的鐵儲(chǔ)存在納米鐵蛋白中,阻止鐵過(guò)量造成的器官損傷[16]。因此課題組檢測(cè)Fth蛋白用于衡量實(shí)驗(yàn)中各組小鼠的肝臟對(duì)鐵的代謝能力,以此來(lái)評(píng)估小鼠的肝臟損傷程度。本研究顯示,弓形蟲(chóng)慢性感染可以上調(diào)小鼠肝組織中Fth蛋白表達(dá)水平,但經(jīng)DFP治療后促進(jìn)了肝臟組織鐵的排泄,使肝臟組織中鐵蛋白含量下調(diào)。

弓形蟲(chóng)可導(dǎo)致肝臟炎癥和脂質(zhì)過(guò)氧化[17],機(jī)體受到弓形蟲(chóng)感染后免疫細(xì)胞被激活釋放炎癥因子如IFN-γ。有研究[18]表明,IFN-γ能夠激活肝內(nèi)皮細(xì)胞的NF-κB信號(hào)途徑,誘導(dǎo)肝細(xì)胞調(diào)亡,上調(diào)炎性基因表達(dá),損害肝臟細(xì)胞。本研究顯示,經(jīng)過(guò)DFP治療后的小鼠可以下調(diào)肝組織中IFN-γ的表達(dá)水平。既往研究[19]顯示,使用DFP干預(yù)后可減輕非酒精性脂肪肝病小鼠肝臟的炎癥因子含量,進(jìn)而改善非酒精性脂肪肝病。由此可知DFP可有效緩解肝臟的炎癥反應(yīng),減少炎癥因子的產(chǎn)生。

在本研究中,TgCtwh6組與control組相比,其肝臟細(xì)胞中Fth mRNA含量明顯上調(diào),但Western blot結(jié)果顯示,與TgCtwh6組相比,TgCtwh6+DFP組Fth蛋白含量明顯下調(diào),其肝臟細(xì)胞中鐵元素含量也減少,造成這種情況的原因可能是:① 過(guò)量的鐵在合成Fth蛋白過(guò)程中被排出。細(xì)胞中鐵含量過(guò)高會(huì)刺激Fth mRNA部分翻譯[20],但由于TgCtwh6組小鼠在服用DFP后促進(jìn)了肝臟中鐵排泄,使得TgCtwh6+DFP組與TgCtwh6組相比細(xì)胞中鐵含量明顯減少,這也相應(yīng)導(dǎo)致了TgCtwh6+DFP組的Fth蛋白合成量下調(diào),但由于只是翻譯部分的Fth mRNA,因此TgCtwh6組和TgCtwh6+DFP組兩組的Fth mRNA無(wú)明顯變化。② 細(xì)胞中的炎癥因子對(duì)Fth mRNA的轉(zhuǎn)錄具有刺激作用[21],炎癥因子誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄Fth蛋白,相關(guān)研究[22]表明炎癥可以影響Fth mRNA的翻譯的,因此使Fth蛋白的合成量也發(fā)生改變。本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TgCtwh6+DFP組小鼠肝臟中IFN-γ的含量,其與TgCtwh6組相比明顯下調(diào),且IFN-γ等炎癥因子可以影響Fth mRNA的翻譯[19],TgCtwh6+DFP組在服用DFP后減輕了肝臟細(xì)胞的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致肝臟細(xì)胞分泌的IFN-γ含量減少,因此對(duì)Fth mRNA的刺激轉(zhuǎn)錄作用減輕,使部分細(xì)胞進(jìn)入翻譯沉默,這也導(dǎo)致了TgCtwh6+DFP組與TgCtwh6組相比Fth mRNA含量無(wú)明顯變化但Fth蛋白的合成減少,這與課題組用Western blot檢測(cè)肝臟細(xì)胞中的Fth蛋白結(jié)果吻合。