吳 錦,李嘉嘉,王笑薇,王 娟

腹膜透析是臨床治療終末期腎臟疾病的常用方法,但長期透析會引起腹膜纖維化,致使患者退出治療[1]。高糖刺激導致的腹膜間皮細胞外基質(zhì)沉積,是腹膜纖維化的病理變化之一[2]。腹膜間皮細胞上皮間質(zhì)轉化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)是腹膜纖維化的早期機制,有效抑制腹膜間皮細胞EMT對維持腹膜透析極為重要[3]。研究[4]表明,E3泛素蛋白連接酶(E3 ubiquitin-protein ligase,ZNRF3)能夠抑制鼻咽癌細胞EMT過程,調(diào)控相關蛋白的表達,在其遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用。

miRNA是長度約為22個核苷酸的非編碼RNA,能靶向mRNA調(diào)控基因表達,參與多種病理生理過程。Pellegrini et al[5]證明miR-146b-5p在腎損傷和纖維化進展的不同階段呈差異表達。同時,miR-146b-5p能靶向ZNRF3促進骨肉瘤細胞浸潤和轉移,并增強其耐藥性[6]。但miR-146b-5p與ZNRF3在腹膜纖維化中的作用和機制尚不清楚。因此,該研究通過高糖誘導構建小鼠腹膜纖維化動物和細胞模型,探討miR-146b-5p對其EMT進程的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 SPF級6周齡C57BL/6J小鼠12只,體質(zhì)量約20 g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,在22～26 ℃、50%～60%的相對濕度,人工光照明暗各12 h環(huán)境下飼養(yǎng)。實驗動物使用許可證號:SYXK(鄂)2018-0104。

1.1.2主要試劑和儀器 戊巴比妥鈉鹽、葡萄糖購自Sigma公司;4.25%腹膜透析液購自成都青山利康公司;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)購自阿拉丁公司;胎牛血清購自Gibco公司;青鏈霉素混合液、CCK-8、RIPA(強)組織細胞快速裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒、DAB濃縮型試劑盒、封閉山羊血清購自Solarbio公司;PVDF轉移膜和化學發(fā)光試劑購自Millipore公司;蘇木精購自雷根生物公司;兔抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體(PAB46194)、兔抗上皮鈣黏蛋白(epithelial cadherin,E-cadherin)抗體(PAB33542)、兔抗波形蛋白(Vimentin)抗體(PAB40605)和兔抗N-鈣黏蛋白(N-cadherin)抗體(PAB33543)購自Bioswamp公司;兔抗ZNRF3抗體(NBP3-03924)購自Novus公司;兔抗I型膠原(type I collagen,COL I)抗體(ab87913)購自Abcam公司;MaxVision二抗(KIT-5020)購自邁新公司;TRIzol購自Ambion公司;雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自碧云天公司;Transwell小室購自Corning公司;Matrigel膠購自BD公司。全自動化學發(fā)光分析儀(型號:Tanon-5200)購自上海天能公司;酶標儀(型號:MK3)購自芬蘭雷勃公司;PCR儀(型號:GE48527)購自杭州柏恒公司。

1.2 實驗方法

1.2.1模型構建及分組處理 12只C57BL/6小鼠隨機分為對照組和模型組,每組6只。參考文獻[7]方法構建腹膜纖維化小鼠模型,模型組小鼠腹腔注射4.25%葡萄糖透析液,每天100 ml/kg,持續(xù)4周,腹腔注射LPS,每天0.1 mg/kg,持續(xù)1周。對照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。造模結束后采用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,取腹膜組織保存?zhèn)溆?。Masson染色觀察腹膜組織膠原纖維變化,免疫組化檢測α-SMA和COL I表達,Western blot檢測腹膜組織E-cadherin、α-SMA和COL I蛋白表達驗證模型是否構建成功。

1.2.2免疫組化檢測 取對照組和模型組小鼠腹膜組織按常規(guī)步驟脫水浸蠟包埋,冷凍后切片,貼附于載玻片上烤片1 h。二甲苯浸泡,梯度乙醇溶液浸泡,1 mmol/L的Tris-EDTA緩沖溶液中高壓修復18 min,置于3%H2O2中濕盒孵育10 min,10%山羊血清濕盒孵育30 min,滴加α-SMA和COL I一抗(1 ∶50),濕盒孵育,4 ℃過夜,滴加 maxvision二抗,37 ℃孵育60 min。DAB和蘇木精染色,乙醇溶液浸泡脫水,二甲苯中透明,中性樹膠封片,顯微鏡拍照。

1.2.3qRT-PCR檢測 TRIzol提取腹膜組織樣本總RNA,反轉錄合成cDNA后進行PCR擴增。擴增體系:SYBR FAST qPCR Master Mix 10 μl,上游引物0.5 μl,下游引物0.5 μl,cDNA模板1 μl,ddH2O 8 μl。反應程序為:95 ℃ 3 min;95 ℃ 5 s;56 ℃ 10 s;72 ℃ 25 s;共40個循環(huán)。引物序列見表1,由武漢天一華煜基因科技有限公司合成。反應結束后獲取CT值,采用2-ΔΔCT法進行統(tǒng)計分析。

1.2.4小鼠腹膜間皮細胞原代分離 參考文獻[8]方法,無菌環(huán)境下取上述對照組小鼠大網(wǎng)膜,PBS漂洗3次,用含0.25%胰蛋白酶的PBS消化25 min后棄去消化液,加入含100 U/ml的青鏈霉素及15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化,15 min后移入離心管,4 ℃下800 r/min離心5 min。棄上清液,用完全培養(yǎng)液重懸細胞,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),72 h后換液,然后每2～3 d換液1次。

1.2.5CCK-8檢測 收集上述小鼠腹膜間皮細胞于96孔板,調(diào)整細胞懸液濃度為3×103個/孔,每孔100 μl,培養(yǎng)使細胞貼壁。將細胞分為對照組和不同濃度葡萄糖處理組(分別用含1%、2%、4%、6%、8%、10%葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞),培養(yǎng)24 h。取出細胞培養(yǎng)板,每孔加10 μl CCK-8溶液,培養(yǎng)4 h。450 nm處酶標儀檢測各孔吸光度值,選擇與對照組相比,增殖率下降最顯著的最低葡糖糖濃度用于后續(xù)的造模實驗。

1.2.6雙熒光素酶報告基因檢測 根據(jù)ZNRF3-3′ UTR野生型基因序列(5′-3′)為:GCTAGCGTGTGCTTGGGGTTCCGAGGTGTGGGATTGAGTTCTCTGCTTT-GTTTTTTTTTAAGATATTGTATGTCTAGA,ZNRF3-3′ UTR突變型對其進行定點突變,將ZNRF3-3′ UTR中堿基AGTTCTC突變?yōu)镚ACCAGA。構建含有miR-146b-5p結合位點的ZNRF3-3′ UTR野生型及突變型報告基因載體,進行酶切回收,連接目的基因片段與線性化載體,提取質(zhì)粒DNA,測序。在小鼠腹膜間皮細胞中轉染miR-146b-5p mimic,然后分別轉染野生型及突變型報告基因載體;另一組細胞轉染mimic-NC質(zhì)粒,再分別轉染ZNRF3-3′ UTR野生型及突變型載體,24 h按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行實驗操作。

1.2.7細胞分組與處理 將小鼠腹膜間皮細胞分為5組:對照組、模型組、mimic-NC組、miR-146b-5p-mimic組和miR-146b-5p-inhibitor組。將正常培養(yǎng)的小鼠腹膜間皮細胞作為對照組,模型組用含6%葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。構建miR-146b-5p-mimic NC質(zhì)粒、mimic質(zhì)粒、inhibitor質(zhì)粒,分別轉染小鼠腹膜間皮細胞纖維化模型,24 h后收集各組細胞,進行后續(xù)實驗。

1.2.8Western blot檢測 收集各組約1×106個細胞,加裂解液裂解細胞,12 000 r/min離心10 min,取上清液。BCA法進行蛋白定量。通過SDS-PSGE電泳分離,將蛋白轉移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉過夜,加一抗(E-cadherin、ZNRF3、Vimentin、N-cadherin,1 ∶1 000)室溫孵育1 h,洗膜,加HRP標記的二抗(1 ∶20 000)室溫孵育1 h,洗膜,ECL發(fā)光液顯影,TANON GIS軟件讀取相關條帶灰度值。

1.2.9Transwell小室檢測 細胞遷移實驗:調(diào)整細胞懸液濃度為1×102/L,取0.5 ml接種至Transwell小室內(nèi)。下層24孔板加0.75 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h,棄去培養(yǎng)基,PBS清洗,每孔加4%甲醛室溫固定20 min。PBS洗滌,加0.5%結晶紫溶液染色30 min,用棉簽擦去Transwell小室內(nèi)未遷移的細胞,置于200×顯微鏡下觀察,計數(shù)每個視野中的細胞數(shù)。

細胞侵襲實驗:接種前在小室中鋪80 μl Matrigel膠,37 ℃培養(yǎng)箱放置30 min。其余實驗步驟同細胞遷移實驗操作。

1.3 統(tǒng)計學處理用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示。兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 模型鑒定如圖1A所示,對照組小鼠腹膜組織薄,呈連續(xù)分布;模型組小鼠腹膜組織明顯增厚,膠原纖維明顯增多。如圖1B所示,模型組中,主要集中于腹膜組織中血管的管壁的α-SMA和間皮基質(zhì)中的COL I陽性表達明顯增多。

圖1 腹膜纖維化小鼠模型鑒定A:腹膜組織Masson染色 ×200;B:腹膜組織COL I和α-SMA免疫組化染色 ×200

2.2 腹膜纖維化小鼠模型中miR-146b-5p、ZNRF、COL I及α-SMA表達如圖2A所示,與對照組相比,模型組小鼠腹膜組織中E-cadherin表達降低(F=286.63),COL I(F=390.47)及α-SMA(F=663.10)表達升高(P<0.05)。如圖2B所示,與對照組相比,模型組小鼠腹膜組織中miR-146b-5p表達升高(F=405.66,P<0.05),ZNRF3表達降低(F=625.33,P<0.05)。

圖2 miR-146b-5p和ZNRF3在腹膜纖維化小鼠模型中的表達

2.3 miR-146b-5p靶向負調(diào)控ZNRF3表達如圖3A所示,miR-146b-5p與ZNRF3存在結合位點。如圖3B所示,與mimic-NC組相比,miR-146b-5p mimic可降低ZNRF3野生型3′-UTR熒光素酶活性(F=279.53,P<0.05),而ZNRF3突變型3′-UTR熒光素酶活性無變化(P>0.05)。如圖3C所示,與對照組相比,模型組和mimic-NC組ZNRF3表達降低。與mimic-NC組相比,轉染miR-146b-5p mimic的小鼠腹膜間皮細胞中ZNRF3表達降低,轉染miR-146b-5p inhibitor的小鼠腹膜間皮細胞中ZNRF3表達升高。

圖3 miR-146b-5p靶向負調(diào)控ZNRF3表達

2.4 高糖誘導小鼠腹膜間皮細胞纖維化并抑制ZNRF3表達如圖4A所示,與對照組相比,不同濃度(1%、2%、4%、6%、8%、10%)葡萄糖處理的小鼠腹膜間皮細胞增殖活性降低(F=446.47,P<0.05),且呈劑量依賴性,其中含6%的葡萄糖培養(yǎng)液處理后,細胞增殖活力下降17.17%,因此,選擇6%的葡萄糖進行后續(xù)實驗。如圖4B、4C所示,E-cadherin和ZNRF3表達也降低(F=220.72、246.33,P<0.05)。

圖4 高糖誘導小鼠腹膜間皮細胞纖維化并抑制ZNRF3表達

2.5 過表達miR-146b-5p促進小鼠腹膜間皮細胞遷移和侵襲如圖5所示,與對照組相比,模型組與mimic-NC組小鼠腹膜間皮細胞遷移和侵襲能力增強(P<0.05)。與mimic-NC組相比,轉染miR-146b-5p-mimic的小鼠腹膜間皮細胞遷移和侵襲能力增強(P<0.05),轉染miR-146b-5p-inhibitor的小鼠腹膜間皮細胞遷移和侵襲能力下降(P<0.05)。

圖5 過表達miR-146b-5p促進小鼠腹膜間皮細胞遷移和侵襲

2.6 過表達miR-146b-5p對EMT相關蛋白表達的影響如圖6所示,與對照組相比,模型組與mimic-NC組E-cadherin表達降低(F=714.62,P<0.05),Vimentin和N-cadherin表達升高(F=639.34、572.69,P<0.05)。模型組與mimic-NC組E-cadherin、Vimentin和N-cadherin的表達無顯著差異(P>0.05)。與mimic-NC組相比,miR-146b-5p-mimic組小鼠腹膜間皮細胞E-cadherin表達降低(F=714.62,P<0.05),Vimentin和N-cadherin表達升高(F=639.34、572.69,P<0.05),miR-146b-5p-inhibitor組小鼠腹膜間皮細胞E-cadherin表達升高(F=714.62,P<0.05),Vimentin和N-cadherin表達降低(F=639.34、572.69,P<0.05)。

圖6 過表達miR-146b-5p對EMT相關蛋白表達的影響

3 討論

腹膜透析作為終末期腎功能衰竭患者的替代療法,在世界范圍內(nèi)發(fā)展迅速,然而,進行性腹膜纖維化是長期腹膜透析患者無法避免的問題。miRNA在抑制腹膜透析相關腹膜纖維化的進展中起關鍵作用。He et al[9]研究認為,與正常對照組大鼠相比,腹膜透析組大鼠miR-15a-5p表達水平降低,血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)表達水平升高,miR-15a-5p可通過靶向VEGFR參與腹膜透析相關腹膜纖維化的EMT過程。Li et al[10]研究表明,腹膜透析患者miR-302c水平下調(diào),且miR-302c的表達與EMT相關因子的表達呈負相關。接受慢性高糖腹膜透析液輸注的小鼠具有腹膜纖維化的典型特征,并且α-SMA和COL Ⅰ的表達更高[11]。本研究構建的腹膜纖維化小鼠模型中小鼠腹膜組織明顯增厚,膠原纖維明顯增多,α-SMA和COL Ⅰ的表達較正常腹膜組織升高,miR-146b-5p表達也升高。這提示腹膜纖維化小鼠模型成功構建,且其miR-146b-5p表達較正常小鼠發(fā)生變化。同時,通過采用不同濃度葡萄糖誘導小鼠腹膜間皮細胞,構建體外纖維化模型,進一步探討miR-146b-5p在腹膜透析相關腹膜纖維化中的作用。

EMT是導致腹膜纖維化的關鍵過程,其特點是破壞細胞極性和黏附能力以獲得間充質(zhì)特征,如遷移和侵襲能力,在EMT過程中,上皮鈣黏附蛋白E-cadherin下調(diào),而間充質(zhì)標志物N-cadherin和Vimentin上調(diào)[12]。本研究中,模型組小鼠腹膜組織和腹膜間皮細胞中E-cadherin表達均降低,上調(diào)miR-146b-5p表達后,高糖誘導的小鼠腹膜間皮細胞遷移和侵襲能力增強,增殖活性下降,E-cadherin表達再次降低,Vimentin和N-cadherin表達升高,而抑制miR-146b-5p表達后,細胞遷移和侵襲能力下降,E-cadherin表達升高,Vimentin和N-cadherin表達下降,這表明miR-146b-5p促進高糖誘導的小鼠腹膜間皮細胞EMT進程。

ZNRF3是E3泛素連接酶家族成員,在多種癌細胞中下調(diào),通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路抑制細胞生長、侵襲并誘導細胞凋亡[13]。張鈺欣 等[14]利用葛根素上調(diào)miR-490的表達,降低ZNRF3的表達,調(diào)控細胞中EMT相關蛋白表達,抑制非小細胞肺癌的生長、侵襲和遷移。本研究中通過TargetScan預測網(wǎng)站和雙熒光素酶報告基因檢測,發(fā)現(xiàn)miR-146b-5p與ZNRF3存在結合位點,ZNRF3是miR-146b-5p的靶基因之一。在甲狀腺癌相關研究中,miR-146b被證明在癌組織中高表達,并能通過靶向作用于ZNRF3參與癌細胞EMT進程,促進其遷移和侵襲[15]。本研究中,高糖誘導降低了小鼠腹膜間皮細胞ZNRF3的表達,將miR-146b-5p mimic轉染至小鼠腹膜間皮細胞后,ZNRF3的表達下調(diào),而miR-146b-5p表達受到抑制時,ZNRF3的表達上調(diào),這提示miR-146b-5p靶向負調(diào)控ZNRF3的表達,進而調(diào)控小鼠腹膜間皮細胞EMT過程。

綜上所述,本研究顯示miR-146b-5p可靶向ZNRF3基因促進高糖誘導的小鼠腹膜間皮細胞EMT進程。盡管其機制需要進一步的探索,但miR-146b-5p可作為預防腹膜透析相關腹膜纖維化的作用靶點。