許 媛,魏 偉,常 艷

色氨酸 2,3-雙加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase, TDO2)是犬尿氨酸代謝通路的限速酶之一,是調(diào)節(jié)系統(tǒng)色氨酸(tryptophan, Trp)水平的關(guān)鍵酶[1]。與對(duì)照組小鼠相比,TDO2基因敲除(TDO2 knockout, TDO2-KO)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育正常,血漿Trp濃度高于對(duì)照組小鼠8～9倍[2]。TDO2介導(dǎo)的犬尿氨酸代謝通路異常在癌癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和自身免疫病中發(fā)揮重要作用。研究[3]顯示,TDO2代謝產(chǎn)物激活芳香烴受體,從而參與腫瘤免疫逃逸。TDO2-KO小鼠的海馬體神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng),表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)現(xiàn)象[4]。在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型研究中發(fā)現(xiàn)TDO2缺失緩解了神經(jīng)炎癥[5]。研究[6-7]表明TDO2在佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)表達(dá)升高可能介導(dǎo)了滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞。為了進(jìn)一步研究TDO2在特定組織和細(xì)胞類型上的生物學(xué)功能以及在疾病狀態(tài)下所參與的分子機(jī)制,利用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建敲除TDO2-201轉(zhuǎn)錄本外顯子3的打靶載體,為進(jìn)一步構(gòu)建TDO2基因條件性敲除小鼠奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇C57BL/6小鼠,與南京集萃藥康生物科技公司實(shí)驗(yàn)室合作,采用 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)構(gòu)建TDO2基因條件性敲除打靶載體。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和繁育均符合安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定,倫理批準(zhǔn)號(hào):PZ-2022-007。

1.2 主要試劑蛋白酶 K(批號(hào): WXBD6886V)(美國(guó) Sigma 公司);Marker I DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量Ladder(批號(hào):20220311)(北京索萊寶科技有限公司),50×TAE(批號(hào):765782AA)(博邁德生物);Agarose(批號(hào):EZ6789D112)(賽國(guó)生物科技);1× TE pH 8.0(批號(hào):70105832)、核酸染料(批號(hào):22116561)(biosharp生物科技公司);2×Rapid Taq Master Mix(批號(hào):7E572H1)(諾唯贊生物科技股份有限公司)。

1.3 主要儀器臺(tái)式梯度PCR儀Thermal Cycler(型號(hào):T100TM)(美國(guó) Bio-Rad公司);HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)宇儀器制造有限公司);天能Tanon瓊脂糖凝膠電泳儀(型號(hào):EPS-300)、全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(型號(hào):Tanon-1600)(上海天能公司)。

1.4 CRISPR-Cas9 靶向位點(diǎn)和Donor載體的設(shè)計(jì)以及sgRNA的合成根據(jù)TDO2 Gene ID(56720)小鼠基因組序列信息,發(fā)現(xiàn)TDO2 基因有4個(gè)轉(zhuǎn)錄本,根據(jù)TDO2基因的結(jié)構(gòu),推薦選擇敲除區(qū)為TDO2-201(ENSMUST00000029645.13)轉(zhuǎn)錄本的第3號(hào)外顯子。該區(qū)域包含91 bp的編碼序列,敲除后將破壞TDO2蛋白質(zhì)功能。利用CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)TDO2基因進(jìn)行改造,在TDO2基因的打靶區(qū)域兩側(cè)各放置同向Loxp元件。設(shè)計(jì)針對(duì)TDO2基因的第3號(hào)外顯子的寡聚核苷酸鏈序列sgRNA,sgRNA序列信息見表1。根據(jù)sgRNA序列設(shè)計(jì)并合成Donor載體。

表1 sgRNA 序列信息

1.5 Cas9 mRNA、sgRNA和donor片段混合體的受精卵顯微注射和移植將Cas9 mRNA、sgRNA和純化后的donor片段混合體顯微注射到C57BL/6小鼠的受精卵中,移植受精卵到假孕的C57BL/6母鼠的子宮中,獲得陽(yáng)性F0小鼠,經(jīng)PCR證實(shí)Loxp突變基因已經(jīng)整合到小鼠染色體上。小鼠TDO2基因條件性敲除打靶載體構(gòu)建策略見圖1。Cas9蛋白被sgRNA誘導(dǎo)與靶位點(diǎn)結(jié)合,從而導(dǎo)致外顯子3堿基序列缺失,并在斷裂處插入Loxp位點(diǎn)修飾的靶基因序列。最后獲得小鼠TDO2基因條件敲除打靶載體。

圖1 小鼠TDO2基因條件敲除打靶載體的構(gòu)建策略

1.6 TDO2基因條件性敲除打靶載體的PCR鑒定

1.6.1小鼠尾組織基因組DNA的提取 取鼠尾組織50～100 mg(1周齡鼠尾2～5 mm),加入鼠尾裂解液0.5 ml,在55 ℃下,輕微震蕩混勻消化8～12 h至無(wú)肉眼可見塊狀或絮狀物,采用乙醇沉淀提取法進(jìn)一步提取基因組DNA。12 000 r/min離心1 min,將上清液0.450 ml移入新EP管中,留少許以免槍頭接觸殘留組織或毛發(fā)。再加入0.9 ml無(wú)水乙醇,上下緩慢顛倒混勻5～10次,12 000 r/min 離心 15 min。棄上清液,加入1 ml 75%乙醇溶液,上下緩慢顛倒洗滌5～10次,12 000 r/min 離心5 min。棄上清液,保持離心管開蓋狀態(tài),室溫晾置5～10 min。加入0.3 ml DEPC水置于37 ℃下溶解 DNA,30 min后用無(wú)酶槍頭吹打混勻。4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2PCR鑒定

1.6.2.1 PCR體系 反應(yīng)總體系25 μl,分別加入Taq Master Mix,Dye Plus 12.5 μl, ddH2O 9.5 μl,引物1 μl,模板基因組DNA 1 μl。PCR儀擴(kuò)增,95 ℃預(yù)變性 5 min,95 ℃變性 30 s,58 ℃退火 30 s,72 ℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán),72 ℃ 5 min 終止反應(yīng)。基因鑒定策略見圖2,引物信息見表2。圖2顯示,基于sgRNA序列,設(shè)計(jì)攜帶靶位點(diǎn)同源區(qū)和Loxp位點(diǎn)的重組質(zhì)粒,并在該靶區(qū)設(shè)計(jì)引物,用于小鼠后續(xù)基因鑒定。

圖2 小鼠TDO2基因條件敲除打靶載體基因型鑒定策略

表2 TDO2flox/flox小鼠引物信息

1.6.2.2 凝膠電泳 配置2%的瓊脂糖凝膠,每孔點(diǎn)樣10 μl,marker 5 μl,以140 V、400 mA的條件電泳30 min。電泳結(jié)束后,拍照觀察。根據(jù)DNA marker,對(duì)比 PCR條帶位置,判斷是純合子還是雜合子。

1.7 純合突變小鼠(TDO2flox/flox)的生長(zhǎng)和繁育

將PCR和測(cè)序鑒定的陽(yáng)性F0代小鼠與C57BL/6小鼠交配獲得F1代小鼠。利用PCR鑒定篩選出F1代雜合子,將其作為親本。交配繁育后得到F2代,PCR鑒定后,選擇最佳繁育路線,最終得到兩條染色體均帶有Loxp點(diǎn)的純合突變小鼠(以下簡(jiǎn)稱TDO2flox/flox)。

TDO2flox/flox小鼠飼養(yǎng)于 SPF 級(jí)環(huán)境中,飼養(yǎng)室內(nèi)的溫度保持在 22～28 ℃,相對(duì)濕度維持在 40%～60%。飼料為無(wú)菌全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒料,飲用水為高壓滅菌后的純凈水。定期觀察登記小鼠體質(zhì)量變化、精神狀態(tài)等情況。孕鼠的妊娠期一般20 d左右;小鼠出生后5～7 d可進(jìn)行剪尾操作;3周左右可將雌雄小鼠分開飼養(yǎng)。一般雄鼠性成熟為8周齡,雌鼠6周齡左右。同時(shí)觀察TDO2flox/flox小鼠的飲食、活動(dòng)、體質(zhì)量變化等情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)均用Mean±SEM表示,采用SPSS 25.0 軟件分析數(shù)據(jù),采用單因素方差(One-way ANVOA)分析進(jìn)行比較,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TDO2flox/flox小鼠的鑒定結(jié)果以JS04371-Tdo2-5wt-tF1和JS04371-Tdo2-5wt-tR1為引物的情況下,PCR反應(yīng)獲得305 bp和407 bp雙條帶的為TDO2-flox雜合子小鼠;獲得305 bp條帶的為同窩WT小鼠;獲得407 bp條帶的為TDO2flox/flox小鼠,見圖3A。以JS04371-Tdo2-3wt-tF1和JS04371-Tdo2-3wt-tR1為引物,PCR反應(yīng)獲得305 bp和408 bp雙條帶的為TDO2-flox雜合子小鼠;獲得305 bp條帶的為WT小鼠;獲得408 bp條帶的為TDO2flox/flox小鼠,見圖3B。TDO2flox/flox小鼠之間進(jìn)行雜交,最終得到大量TDO2flox/flox小鼠,為后續(xù)構(gòu)建TDO2基因條件敲除小鼠模型奠定了基礎(chǔ)。圖3A采用JS04371-Tdo2-5wt-tF1PCR和JS04371-Tdo2-5wt-tR1為引物, Line1為陰性對(duì)照,Line2、3、4為陽(yáng)性對(duì)照,分別為TDO2-flox雜合子小鼠、同窩WT小鼠、TDO2flox/flox小鼠。80、82號(hào)鼠為TDO2-flox雜合子小鼠,81、83、84、85、86、87均為TDO2flox/flox小鼠。圖3B采用JS04371-Tdo2-3wt-tF1和JS04371-Tdo2-3wt-tR1為引物,結(jié)果同圖3A。同時(shí)對(duì)基因鑒定結(jié)果陽(yáng)性的引物擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,檢測(cè)Loxp位點(diǎn)信息(ATAACT TCGTAT AGCATA CATTAT ACGAAG TTAT),根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)小鼠TDO2基因條件性敲除打靶載體構(gòu)建成功,測(cè)序結(jié)果見圖4。

圖4 TDO2flox/flox小鼠基因測(cè)序結(jié)果

2.2 TDO2flox/flox小鼠的生長(zhǎng)和繁育情況與同窩WT小鼠相比,TDO2flox/flox小鼠的飲食、活動(dòng)、體質(zhì)量變化正常。對(duì)不同性別和基因型的 8～14周齡小鼠進(jìn)行體質(zhì)量分析(n=10)。結(jié)果顯示,同一基因型小鼠,雌性小鼠的體質(zhì)量低于雄性小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.33,P<0.01);同一性別中,TDO2flox/flox小鼠與同窩WT小鼠相比,體質(zhì)量無(wú)明顯差異,雄性WT:(22.53±0.313 1) mg;雄性TDO2flox/flox:(22.28±0.423 7) mg;雌性WT:(19.88±0.258 1) mg;雌性TDO2flox/flox:(20.58±0.254 2) mg。TDO2flox/flox小鼠性成熟時(shí)間表現(xiàn)為:雄鼠 8 周,雌鼠6周左右;母鼠妊娠期為 19～21 d,每胎產(chǎn)5～6只幼鼠,成活率>95%,與同窩WT 小鼠繁殖情況無(wú)差異。

3 討論

TDO2表達(dá)異常導(dǎo)致犬尿氨酸代謝通路紊亂,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤和自身免疫病等多種疾病中發(fā)揮重要作用。研究[3,8]表明,在疾病狀態(tài)下,TDO2介導(dǎo)免疫細(xì)胞功能異常,參與腫瘤細(xì)胞和各組織細(xì)胞的病理機(jī)制。課題組首次發(fā)現(xiàn)TDO2在免疫細(xì)胞中均有表達(dá),如巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞等,提示TDO2在免疫調(diào)節(jié)和維持局部免疫穩(wěn)態(tài)中具有潛在作用[9]。課題組為了進(jìn)一步研究TDO2在靶細(xì)胞和靶組織中的病理機(jī)制,采用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建了小鼠TDO2基因條件性敲除打靶載體。

本實(shí)驗(yàn)首先利用CRISPR Design工具(http://crispr.mit.edu/)[10],結(jié)合TDO2 Gene ID(56720)小鼠基因組序列信息,設(shè)計(jì)針對(duì)TDO2-201(ENSMUST00000029645.13)轉(zhuǎn)錄本的第3號(hào)外顯子打靶位點(diǎn)的sgRNA,再根據(jù)sgRNA序列設(shè)計(jì)Donor載體。其次,制備Cas9 mRNA、sgRNA和Donor片段產(chǎn)物。將合成后的2條單鏈寡聚核苷酸sgRNA序列退火(95 ℃ 5 min后自然降至室溫)形成雙鏈DNA,經(jīng)T7 RNA聚合酶合成sgRNA。Cas9表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)AgeⅠ酶切線性化,體外利用T7 RNA聚合酶合成Cas9 mRNA。然后將轉(zhuǎn)錄好的sgRNA和Cas9 mRNA以及純化后的Donor載體片段顯微注射到受精卵中,sgRNA的堿基與靶基因的序列特異性結(jié)合,進(jìn)而誘導(dǎo)Cas9酶對(duì)第3號(hào)外顯子進(jìn)行切割,導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂,在斷裂處插入經(jīng)Loxp位點(diǎn)修飾的第3號(hào)外顯子基因序列,隨后將胚胎轉(zhuǎn)移到假孕動(dòng)物中以產(chǎn)生F0代[11]。最后將陽(yáng)性F0代小鼠與野生型C57BL/6小鼠交配獲得穩(wěn)定的F1代小鼠,通過F1代小鼠之間的雜交得到TDO2flox/flox小鼠。

通過PCR鑒定發(fā)現(xiàn),小鼠TDO2基因條件性敲除打靶載體遺傳穩(wěn)定。與同窩WT小鼠相比,TDO2flox/flox小鼠在繁育過程中,生長(zhǎng)發(fā)育正常。對(duì)不同性別和基因型的 8～14周齡小鼠進(jìn)行體質(zhì)量情況分析,結(jié)果表明,與同窩WT小鼠相比,TDO2flox/flox小鼠體質(zhì)量無(wú)差異。利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建小鼠TDO2基因條件性敲除打靶載體,不僅為構(gòu)建TDO2基因條件性敲除小鼠模型奠定基礎(chǔ),也為進(jìn)一步研究TDO2基因在靶組織和細(xì)胞上的功能和在疾病狀態(tài)下的病理機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。