徐王婷,宋育林

對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)因具有解熱、鎮(zhèn)痛的作用而被廣泛應(yīng)用于臨床,但是攝入過量APAP會(huì)引起嚴(yán)重的肝損傷。APAP所致肝損傷的確切機(jī)制尚不明確,可能與乙酰苯醌亞胺(N-acetyl-p-benzoquinone imine, NAPQI)形成、線粒體損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等有關(guān)[1]。線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)偶聯(lián)(mitochondrial-associated endoplasmic reticulum membranes,MAMs)是線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間存在的特殊的物理和生化連接區(qū)域,富集著多種蛋白質(zhì),如1,4,5-三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-trisphate receptor, IP3R)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75(glucose regulated protein 75,GRP75)、線粒體融合蛋白2(mitofusin 2, MFN2)等,參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、維持鈣穩(wěn)態(tài)和線粒體形態(tài)、脂質(zhì)合成和運(yùn)輸?shù)冗^程[2],并與非酒精性脂肪肝等慢性肝病有關(guān)[3]。2-氨基乙氧基二苯基硼酸鹽(2-aminoethoxydiphenyl borate,2-APB)是IP3R抑制劑[4],1,2-雙(2-氨基苯氧基)-乙烷-N, N, N′N′-四乙酸[1,2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′N′-tetraacetic acid,BAPTA-AM]是公認(rèn)的鈣離子螯合劑[5]。為此,該研究通過觀察2-APB、BAPTA-AM對(duì)APAP所致小鼠肝損傷及其肝臟超微結(jié)構(gòu)、肝組織Ca2+水平、MAMs相關(guān)蛋白線粒體融合蛋白1(mitofusin 1,MFN1)、MFN2、IP3R1、GRP75表達(dá)的影響,探討抑制IP3R-Ca2+途徑對(duì)APAP所致肝損傷及其MAMs的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40只健康的SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠,鼠齡7周,體質(zhì)量18～22 g,購自杭州子源實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司;動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(浙)2019-0004。

1.2 試劑與儀器APAP(純度大于99%)和BAPTA-AM(純度大于99%)購自美國MedChemExpress公司;2-APB購自美國Sigma公司(純度97%);丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)檢測(cè)試劑盒為羅氏診斷產(chǎn)品(上海) 有限公司生產(chǎn);GRP75、GAPDH抗體為合肥朵能生物科技有限公司產(chǎn)品(貨號(hào):AB011901、AB010301);MFN1、MFN2及IP3R1抗體購自美國Signalway Antibody公司(貨號(hào):55628、33015、29549);山羊抗小鼠二抗及山羊抗兔二抗均購自美國Proteintech公司(貨號(hào):SA00001-1、SA00001-2);鈣離子含量檢測(cè)試劑盒及總蛋白定量測(cè)試盒購自南京建成生物工程研究所;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;Roche Cobas 8000全自動(dòng)生化分析儀購自瑞士Roche公司;酶標(biāo)儀產(chǎn)自美國Themo公司;透射電鏡JEM-1400flash產(chǎn)自日本電子株式會(huì)社;化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)ZF-670產(chǎn)自上海嘉鵬科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理40只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、IP3R抑制劑(2-APB)組、鈣離子螯合劑(BAPTA-AM)組,每組10只。模型組、2-APB組、BAPTA-AM單次腹腔注射APAP(300 mg/kg)。注射APAP前30 min,2-APB組腹腔注射2-APB (20 mg/kg),BAPTA-AM組腹腔注射 BAPTA-AM(2.5 mg/kg)。腹腔注射APAP后,各組小鼠均禁食不禁水。APAP造模24 h后,稱量小鼠體質(zhì)量,麻醉后摘除小鼠眼球取血,斷頭處死,取出肝臟。血標(biāo)本室溫靜置2 h,3 500 r/min離心15 min,制備血清,保存于-80 ℃冰箱中。取出肝臟后,稱量肝濕重,觀察肝臟外觀情況,剪取部分肝左葉用4%甲醛緩沖液固定行肝臟病理學(xué)檢查;取相同部位約1 mm3左右的肝組織若干塊,固定于2.5%戊二醛固定液,4 ℃冷藏,用于透射電鏡觀察;余肝臟組織于液氮中保存,后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱貯存。

1.4 肝指數(shù)根據(jù)前述所稱量的小鼠處死前體質(zhì)量和肝濕重計(jì)算肝指數(shù)。肝指數(shù)(%)=(肝濕重/處死前小鼠體質(zhì)量) ×100%。

1.5 肝功能指標(biāo)檢測(cè)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清ALT、AST水平。

1.6 肝組織病理觀察取4%甲醛緩沖液固定的肝組織,予以脫水、石蠟包埋、切片和HE染色,光鏡下觀察肝組織結(jié)構(gòu)。

1.7 透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察2.5%戊二醛緩沖液固定的肝臟標(biāo)本,按常規(guī)透射電鏡技術(shù)脫水、包埋、超薄切片、醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染色,透射電鏡下觀察切片并采集圖像進(jìn)行分析。

1.8 鈣離子含量測(cè)定取適量組織塊,經(jīng)去離子水中漂洗后,按1 ∶9 [質(zhì)量(g) ∶體積(ml)]比例加入去離子水,制成10%的勻漿液,以2 500 r/min離心15 min后取上清液,采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度,按照鈣測(cè)試盒說明書步驟用微板法檢測(cè)鈣離子含量。

1.9 Western blot檢測(cè)肝組織中MFN1、MFN2、GRP75、IP3R1蛋白表達(dá)取適量的肝組織,提取組織總蛋白,用BCA法進(jìn)行蛋白定量后,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,再轉(zhuǎn)膜、封閉,將膜依次與相對(duì)應(yīng)的一抗與二抗孵育。工作濃度:GAPDH 1 ∶2 000、抗MFN1抗體 1 ∶1 000、抗MFN2抗體1 ∶1 000、抗GRP75抗體1 ∶1 000、抗IP3R1抗體1 ∶1 000、二抗1 ∶5 000。最后,ECL顯影,Image J軟件分析所得圖像,計(jì)算目標(biāo)蛋白與GAPDH的灰度值比值。

2 結(jié)果

2.1 肝指數(shù)變化模型組小鼠較正常對(duì)照組的肝濕重及肝指數(shù)均增加(P<0.01);2-APB組及BAPTA-AM組小鼠較模型組的肝濕重及肝指數(shù)均降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組小鼠肝指數(shù)變化

2.2 肝功能變化與正常對(duì)照組相比,模型組小鼠ALT、AST水平增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比,2-APB組及BAPTA-AM組小鼠ALT、AST水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表2。

表2 各組小鼠血清ALT、AST變化

2.3 肝組織病理學(xué)改變正常對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞形態(tài)正常。模型組小鼠的肝臟可見肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,小葉中央靜脈周圍可見大片肝細(xì)胞壞死,并見肝竇充血及炎細(xì)胞浸潤。相比于模型組,2-APB組及BAPTA-AM組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)尚完整,可見肝細(xì)胞變性,肝細(xì)胞壞死面積均明顯減少。見圖1。

圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)變化 HE×200

2.4 肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化透射電鏡下,正常對(duì)照組小鼠線粒體未腫脹,線粒體嵴完整;模型組可見線粒體腫脹,線粒體嵴結(jié)構(gòu)模糊、斷裂、消失,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹斷裂,MAMs數(shù)量增加;2-APB組及BAPTA-AM組線粒體腫脹程度明顯減輕,部分線粒體出現(xiàn)嵴斷裂或溶解消失,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)基本完整,MAMs數(shù)量減少。見圖2。

圖2 各組小鼠肝臟樣品電鏡檢查結(jié)果 ×20 000

2.5 肝組織鈣離子含量的變化正常對(duì)照組、模型組、2-APB組和BAPTA-AM組的小鼠肝組織鈣含量分別為(0.031±0.011)、(0.066±0.029)、(0.036±0.011)和(0.040±0.016)mmol/g prot,4組間方差分析結(jié)果:F=7.476,P=0.001。與正常對(duì)照組比較,模型組小鼠肝組織勻漿中鈣離子含量增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,2-APB組及BAPTA-AM組小鼠肝組織勻漿中鈣離子含量均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.6 肝組織MFN1、MFN2、GRP75、IP3R1蛋白表達(dá)情況與正常對(duì)照組比較,模型組小鼠肝臟的MFN1、MFN2蛋白表達(dá)均減少,而IP3R1、GRP75蛋白的表達(dá)增加(P<0.01)。與模型組比較,2-APB組及BAPTA-AM組MFN1、MFN2蛋白表達(dá)均增加,而IP3R1、GRP75蛋白的表達(dá)減少(P<0.01)。見圖3。

圖3 各組小鼠肝組織MFN1、MFN2、IP3R1、GRP75蛋白表達(dá)情況

3 討論

APAP過量是急性肝衰竭的主要原因之一。肝細(xì)胞壞死是APAP所致肝損傷的早期表現(xiàn)[1]。既往研究[6]表明,單次腹腔注射APAP(300 mg/kg)24 h后小鼠血清ALT、AST可維持在較高水平,肝臟主要表現(xiàn)為小葉中心性壞死。本研究中,模型組小鼠較正常對(duì)照組的肝指數(shù)及肝濕重增加,ALT、AST水平升高,肝臟可見小葉中心性壞死,提示APAP致小鼠肝損傷模型復(fù)制成功。

有研究[7]顯示,APAP肝損傷時(shí)線粒體和細(xì)胞核內(nèi)鈣水平升高,肝細(xì)胞內(nèi)鈣超載可能與瞬時(shí)受體電位M2(transient receptor potential melastatin 2,TRPM2)激活有關(guān)。MAMs作為線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的特殊結(jié)構(gòu),通過自身數(shù)量和(或)所富集的蛋白質(zhì)的變化,發(fā)揮不同的生物學(xué)功能,如調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+向線粒體轉(zhuǎn)運(yùn),調(diào)控線粒體形態(tài)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等[2-3]。IP3R是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ca2+釋放通道,電壓依賴性陰離子通道1(voltage-dependent anion channel 1,VDAC1)是位于線粒體外膜的Ca2+通道,而GRP75作為分子伴侶連接IP3R和VDAC1[8]。IP3R與GRP75 結(jié)合介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+,Ca2+通過位于MAMs的復(fù)合物 IP3R-GRP75-VDAC1進(jìn)入線粒體[2-3,8]。干擾GRP75可影響GRP75-IP3R的相互作用從而影響MAMs[9]。IP3R有3個(gè)亞型,分別是IP3R1、IP3R2、IP3R3,非酒精性脂肪性肝炎患者肝臟IP3R1表達(dá)上調(diào)[3]。在線粒體融合過程,MFN1或MFN2形成同型或異型復(fù)合物,促進(jìn)線粒體融合、MAMs穩(wěn)定和Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)[2]。本研究顯示,與正常對(duì)照組相比,模型組小鼠肝細(xì)胞線粒體嵴斷裂、消失,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹斷裂;MAMs數(shù)量增加;肝臟組織中Ca2+含量較正常對(duì)照組增加;MFN1、MFN2蛋白的表達(dá)水平降低(P<0.01),IP3R1蛋白及GRP75蛋白的表達(dá)水平增加,提示IP3R-Ca2+途徑的增強(qiáng)、MAMs及其相關(guān)蛋白表達(dá)異常參與了APAP所致的肝損傷過程。

2-APB具有多種生物活性,通過抑制IP3R和鈣庫操縱的鈣離子內(nèi)流(store-operated calcium entry,SOCE)通道降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平和細(xì)胞器之間Ca2+的移動(dòng)[10]。2-APB可以減輕APAP所致肝損傷[4]。BAPTA-AM可通過減輕細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載起到保護(hù)細(xì)胞作用[5]。本研究顯示,與模型組比較,2-APB組及BAPTA-AM組小鼠血清ALT、AST水平下降,光鏡下肝臟病理變化明顯改善。2-APB的作用與文獻(xiàn)[4]報(bào)道相似。表明2-APB及BAPTA-AM均具有保護(hù)APAP所致肝損傷的作用,提示抑制IP3R-Ca2+途徑可以減輕APAP所致的肝損傷。其機(jī)制可能有以下2種:① 降低肝臟Ca2+含量過載改善線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷:鈣離子超載可以影響線粒體的結(jié)構(gòu)和功能[11],并與APAP所致的肝損傷有關(guān)[7]。本研究顯示,與模型組比較,2-APB組及BAPTA-AM組小鼠肝組織勻漿中Ca2+含量減少、肝臟線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)病理變化減輕。提示2-APB及BAPTA-AM可通過降低肝臟Ca2+超載、改善線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷保護(hù)APAP所致的肝損傷。② 影響MAMs結(jié)構(gòu)及其相關(guān)蛋白的表達(dá):MAMs通過其自身結(jié)構(gòu)和所募集蛋白的變化參與鈣平衡、線粒體功能、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞死亡等的調(diào)控[ 2-3]。抑制GRP75的表達(dá)可減低以VDAC1/ITPR1(IP3R1)標(biāo)志的HuH7細(xì)胞MAMs數(shù)量;增強(qiáng)GRP75表達(dá)則作用相反[12]。文獻(xiàn)報(bào)道,APAP中毒可導(dǎo)致小鼠肝臟線粒體MFN2蛋白水平下降[13];酒精性肝損傷大鼠肝臟存在線粒體功能異常和MFN2蛋白表達(dá)下調(diào)[14]。本研究顯示,與模型組比較,2-APB組及BAPTA-AM組小鼠MAMs數(shù)量減少,MFN1、MFN2蛋白表達(dá)水平上調(diào),IP3R1及GRP75蛋白表達(dá)水平降低。提示2-APB和BAPTA-AM可以通過改變MAMs數(shù)量、抑制IP3R1及GRP75和上調(diào)MFN1、MFN2蛋白表達(dá)減輕APAP所致的肝損傷,確切機(jī)制有待進(jìn)一步探討。