劉鐵龍,亓文強,江洪洋,王瑞雪,代志剛,殷姜文

學習記憶障礙是麻醉和手術(shù)后常發(fā)生的并發(fā)癥,嚴重影響患者生活質(zhì)量并增加醫(yī)療費用及社會負擔[1-3]。研究[4-5]表明,學習記憶障礙潛在的發(fā)生機制是麻醉和手術(shù)引起的神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激。紫草酸甲酯(paederosidic acid methyl ester,PAME)是從雞矢藤中提取的環(huán)烯醚萜類單體,具有抗炎、抗氧化應(yīng)激和鎮(zhèn)痛等作用[6-7]。因此,PAME可能具有改善學習記憶障礙的潛在藥理作用。研究表明,NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,Nox4)介導的氧化應(yīng)激水平增加引起鐵死亡[8],且海馬區(qū)鐵死亡會導致患有膿毒癥相關(guān)性腦病的大鼠發(fā)生學習記憶障礙[9]。PAME具有抗氧化應(yīng)激作用,其對Nox4介導的氧化應(yīng)激水平增加引起的鐵死亡及其導致的學習記憶障礙是否產(chǎn)生抑制作用尚無報道。因此,該研究建立剖腹探查術(shù)小鼠動物模型,使用PAME進行干預治療,觀察其對術(shù)后小鼠學習記憶的作用及其與Nox4介導的鐵死亡途徑的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器PAME(貨號:HY-N2433,美國Merck公司);異氟烷(貨號:R510-22,深圳市瑞沃德生命科技有限公司);Nox4過表達AAV病毒(上海漢恒生物科技有限公司);Nox4抗體(貨號:ab133303)、山羊抗兔TRITC熒光二抗(貨號:ab8135)(英國Abcam公司);長鏈脂酰輔酶A合成酶4(long chain acyl CoA synthetase 4,ACSL4)抗體(貨號:A04372-2)、谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)抗體(貨號:BM5231)(武漢博士德生物工程有限公司);GAPDH(貨號:TA-08)、山羊抗兔IgG二抗(貨號:ZB-2301)、山羊抗小鼠 IgG二抗(貨號:ZB-2305)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);組織鐵檢測試劑盒(貨號:A039-2-1)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒(貨號:E004-1-1)(南京建成生物工程研究所)。

小動物麻醉機(型號:R500,深圳市瑞沃德生命科技有限公司);低溫高速離心機(型號:1-14k,德國Sigma公司);激光共聚焦掃描顯微鏡(型號:LSM710,德國Carl Zeiss公司);Labmaze動物行為學分析系統(tǒng)(型號:V3.0)、小鼠腦立體定位儀(型號:ZS-FD,北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司);電泳槽(型號:DYCZ-21,北京六一生物科技有限公司);精密微量注射泵(型號:QSI,美國Stoelting公司);化學發(fā)光成像儀(型號:Tanon-2500,上海天能生命科學有限公司)。

1.2 實驗動物選擇12～14月齡C57BL/6J雄性小鼠108只,體質(zhì)量30 ～35 g,購于濟南朋悅實驗動物有限公司。實驗小鼠飼養(yǎng)在恒溫動物房,溫度(25±2)℃,濕度(55±10)%,12 h光照/黑暗周期,小鼠自由進食和飲水。本研究經(jīng)石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理審查委員會批準(批準號:A2021-074-01)。

1.3 實驗分組采用隨機數(shù)字法將C57BL/6J雄性小鼠隨機分為6組(n=18):① Sham組:小鼠麻醉后自然蘇醒,未做特殊處理。② 手術(shù)組:將小鼠用2%異氟烷吸入麻醉,常規(guī)消毒后在腹中線上剪開約1 cm的垂直切口,然后依次探查腸、肝、脾、腎等器官,探查完畢并確認腹腔無出血,用4-0無菌縫線逐層縫合傷口,術(shù)畢置于保溫箱中蘇醒。③ 手術(shù)+PAME組(PAME組):在術(shù)后第1天開始行20 mg/kg PAME灌胃,連續(xù)7 d。④ 手術(shù)+Nox4腺相關(guān)病毒過表達組(Nox4過表達組):Nox4過表達腺相關(guān)病毒于術(shù)前28 d通過腦立體定位儀注射到小鼠海馬腦區(qū),28 d后常規(guī)進行手術(shù)。⑤ 手術(shù)+Nox4腺相關(guān)病毒空載組(AAV空載組):術(shù)前28 d通過腦立體定位儀將AAV空載病毒注射到小鼠海馬腦區(qū),28 d后常規(guī)進行手術(shù)。⑥ 手術(shù)+PAME+Nox4過表達組(PN組):手術(shù)前28 d將Nox4過表達腺相關(guān)病毒通過腦立體定位儀注射到小鼠海馬腦區(qū),手術(shù)后給予20 mg/kg PAME灌胃處理,連續(xù)7 d。PAME劑量及灌胃時間根據(jù)本課題組預實驗和Chen et al[10]研究方案確定。

1.4 小鼠海馬AAVs立體定位注射小鼠面罩吸入異氟烷麻醉,通過耳桿和齒栓將小鼠頭部固定于腦立體定位儀上,用顱骨鉆在小鼠顱骨表面鉆孔,穿破顱骨后,按小鼠海馬坐標(前囟向后2.5 mm,向左/右旁開2.0 mm,深度1.8 mm),將尖端帶有玻璃微電極的微量注射針以0.02 μl/min的速度注入AAVs病毒,注射時間25 min,總體積0.5 μl,注射完畢針尖停留10 min,緩慢移除針尖,縫合頭皮,麻醉蘇醒后放入籠中單獨飼養(yǎng)。

1.5 Morris水迷宮實驗調(diào)節(jié)動物行為學分析系統(tǒng)將圓形水池分為4個象限。池內(nèi)加入適量的水并保持水溫在23～25 ℃,將一個圓柱狀平臺放置于第二象限正中。實驗分為定位航行實驗和空間探索實驗。定位航行實驗:從術(shù)前第6天起至術(shù)前第2天,共測量5次,每天在固定時間按順時針方向從4個不同象限作為入水點,記錄小鼠尋找平臺的時間即逃逸潛伏期,如果在90 s內(nèi)未找到平臺,則將小鼠引上平臺并保持15 s,此時逃逸潛伏期記錄為90 s;空間探索實驗:術(shù)前1 d撤除平臺,將小鼠在第四象限面向池壁放入水中,行為學軌跡分析儀記錄小鼠在90 s內(nèi)穿越平臺位置的次數(shù)以及在第二象限探索的時間。用同樣的方法在術(shù)后第1、3、7天內(nèi)重復空間探索實驗[11]。

1.6 條件性恐懼實驗按照已報道的實驗流程[12],在術(shù)前第2天,將各組小鼠放入條件性恐懼刺激箱內(nèi),適應(yīng)2 min,同時給予聲音刺激(70 dB)及足底電刺激(0.7 A),間隔1 min后重復以上刺激,連續(xù)20次。結(jié)束后小鼠在刺激箱內(nèi)停留2 min后再放回鼠籠。在術(shù)前1 d、術(shù)后第1、3、7天將各組小鼠再次放入條件性恐懼刺激箱內(nèi),適應(yīng)2 min,僅給予10 s聲音刺激(70 dB),觀察并記錄小鼠僵直時間百分比,重復上述步驟5次,評價小鼠認知功能。

1.7 ROS、海馬組織鐵含量檢測在術(shù)后第7天,每組取6只小鼠海馬組織勻漿,按照相應(yīng)試劑盒說明書采用分光光度法檢測海馬組織ROS水平和鐵含量。

1.8 免疫熒光染色術(shù)后第7天,每組各6只小鼠經(jīng)心臟灌注后取腦,脫水后制備冰凍腦切片,經(jīng)5% BSA 封閉1 h后滴加Nox4一抗(1 ∶200),4 ℃孵育過夜,PBS洗滌后滴加TRITC標記的熒光二抗(1 ∶500),室溫避光孵育2 h,DAPI液染細胞核 3 min,封片后激光共聚焦顯微鏡觀察,每張切片在200倍鏡下隨機選3個不同視野進行采圖。用Image J軟件進行熒光強度測定。

1.9 Western blot術(shù)后第7天,每組取6只小鼠快速斷頭取腦,剝離海馬組織,組織勻漿、RIPA裂解提取蛋白,并用BCA法測定蛋白濃度。經(jīng)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,選擇GAPDH(1 ∶1 000)、目標蛋白Nox4(1 ∶1 500)以及鐵死亡標志性蛋白ACSL4(1 ∶1 000)和 GPX4(1 ∶1 000)一抗 4 ℃孵育過夜,二抗山羊抗兔(1 ∶2 000)和山羊抗小鼠(1 ∶2 000)室溫孵育 2 h后滴加化學發(fā)光試劑曝光,Image J軟件測定條帶灰度值,并以 GAPDH為參照,統(tǒng)計Nox4、ACSL4和 GPX4相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 PAME對小鼠術(shù)后學習記憶的影響

2.1.1各組術(shù)前行為學差異無統(tǒng)計學意義 各組術(shù)前定位航行實驗結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(F=0.348,P>0.05),但隨著訓練天數(shù)的增加,各組找到平臺所需平均時間縮短;術(shù)前空間探索實驗各組小鼠在90 s內(nèi)穿越平臺位置的次數(shù)以及在第二象限探索的時間差異均無統(tǒng)計學意義(F=0.228,P>0.05;F=0.397,P>0.05)。術(shù)前條件性恐懼實驗各組小鼠僵直時間百分比差異也無統(tǒng)計學意義(F=0.365,P>0.05)。見圖 1。

2.1.2PAME增加小鼠術(shù)后穿越平臺次數(shù)、延長空間探索時間 空間探索實驗中記錄的各組小鼠的游泳軌跡如圖 2所示。與Sham組相比,手術(shù)組小鼠在術(shù)后第1、3、7天穿越平臺次數(shù)減少(P<0.001),在第二象限探索時間更短(P<0.001)。但在給予PAME治療(即PAME組)的小鼠穿越平臺次數(shù)和第二象限探索時間比手術(shù)組增加(P<0.001,P<0.05)。與手術(shù)組相比,Nox4過表達組的小鼠穿越平臺次數(shù)更少、第二象限探索時間更短(P<0.05),但在給予PAME治療后可被逆轉(zhuǎn)(P<0.001)。AAV空載組與手術(shù)組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1、2。

表1 PAME對小鼠術(shù)后穿越平臺次數(shù)的影響(次,

圖1 術(shù)前各組行為學比較

圖2 水迷宮實驗小鼠活動軌跡A:Sham組;B:手術(shù)組;C:PAME組;D:Nox4過表達組;E:AAV空載組;F:PN組

表2 PAME對小鼠術(shù)后目標象限停留時間的影響

2.1.3PAME增加小鼠術(shù)后條件性恐懼實驗僵直時間百分比 與Sham組相比,手術(shù)組在術(shù)后第1、3、7天小鼠僵直時間百分比減少(P<0.001),在給予PAME治療后,PAME組的小鼠僵直時間百分比增加(P<0.05)。與手術(shù)組相比,Nox4過表達組的小鼠僵直時間百分比減少(P<0.05),但在給予PAME治療后小鼠僵直時間百分比增加(P<0.001)。AAV空載組與手術(shù)組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表3。

表3 PAME對小鼠術(shù)后僵直時間百分比的影響

2.2 PAME抑制小鼠術(shù)后海馬組織Nox4介導的鐵死亡

2.2.1PAME降低小鼠術(shù)后海馬組織ROS、鐵的含量 小鼠海馬組織ROS和鐵含量檢測結(jié)果顯示,手術(shù)組小鼠海馬組織ROS和鐵含量高于Sham組(F=40.94,P<0.001;F=36.15,P<0.001),PAME灌胃治療后小鼠海馬組織ROS和鐵含量出現(xiàn)降低(P<0.001)。給予Nox4過表達病毒注射的小鼠海馬組織ROS和鐵含量比單純手術(shù)組高(P<0.05),在給予PAME治療后,Nox4過表達組的ROS和鐵含量下降(P<0.001)。AAV空載組與手術(shù)組相比,小鼠海馬區(qū)ROS和鐵含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖3。

圖3 各組ROS和鐵含量變化

2.2.2PAME降低小鼠術(shù)后海馬CA1區(qū)Nox4的表達 免疫熒光實驗結(jié)果顯示,Nox4在小鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元胞質(zhì)表達,與Sham組相比,手術(shù)組小鼠海馬CA1區(qū)Nox4的熒光強度增強(F=175.3,P<0.001),在給予PAME治療后熒光強度降低(P<0.001)。Nox4過表達組比手術(shù)組Nox4的熒光強度增加(P<0.01),在給予PAME后出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)(P<0.001)。AAV空載組與手術(shù)組相比小鼠海馬CA1區(qū)Nox4的熒光強度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖4。

圖4 免疫熒光實驗檢測各組Nox4的表達變化

2.2.3PAME對小鼠術(shù)后海馬組織Nox4及鐵死亡標志性蛋白(ACSL4和GPX4)表達的影響 Western blot實驗結(jié)果顯示,與Sham組相比,手術(shù)組小鼠海馬組織Nox4表達增加(F=103,P<0.001),鐵死亡標志性蛋白ACSL4的表達增加(F=94.44,P<0.001),GPX4表達水平降低(F=73.9,P<0.001)。在給予PAME治療后,手術(shù)組小鼠海馬Nox4蛋白、ACSL4的表達均降低(P<0.001),GPX4表達水平增加(P<0.001)。同時,與手術(shù)組相比,Nox4過表達組小鼠海馬Nox4、ACSL4的表達均顯著增加(P<0.001),GPX4表達降低(P<0.001),給予PAME治療后結(jié)果出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)(P<0.001)。AAV空載組與手術(shù)組相比,小鼠海馬組織Nox4、ACSL4和GPX4的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖5。

圖5 Western blot實驗檢測Nox4、ACSL4、GPX4的表達變化

3 討論

學習記憶障礙作為圍術(shù)期常見的并發(fā)癥,常導致術(shù)后恢復延遲,在“加速康復外科(enhanced recovery after surgery,ERAS)”理念指導下,探討學習記憶功能障礙的產(chǎn)生機制和改善圍術(shù)期學習記憶功能受損值得關(guān)注并研究。研究[4-7]證實學習記憶能力障礙與神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān),而我國傳統(tǒng)中藥雞矢藤具有抗炎和抗氧化應(yīng)激作用,因此其可能具有改善學習記憶障礙的作用。本研究選用雞矢藤的主要活性物質(zhì)PAME治療術(shù)后學習記憶能力降低的小鼠,發(fā)現(xiàn)術(shù)后小鼠的認知行為學(Morris水迷宮實驗和條件性恐懼實驗)得到了明顯改善,這一現(xiàn)象證實了PAME能夠改善小鼠術(shù)后學習記憶功能。

本研究繼續(xù)探討PAME改善術(shù)后小鼠學習記憶功能的機制。研究[8-9]表明,鐵死亡可引起學習記憶功能障礙,Nox4介導的氧化應(yīng)激是導致鐵死亡的主要原因。PAME具有抗氧化應(yīng)激作用,其可能會通過抑制Nox4介導的氧化應(yīng)激減輕鐵死亡,改善小鼠術(shù)后學習記憶功能障礙。本研究結(jié)果顯示,手術(shù)組小鼠術(shù)后海馬組織ROS、鐵含量明顯增加,Nox4表達上調(diào),鐵死亡標志性蛋白ACSL4表達上調(diào),GPX4表達下調(diào)[13]。這些結(jié)果與相關(guān)研究[14]中鐵死亡的結(jié)果一致,表明術(shù)后小鼠學習記憶能力降低的發(fā)生與海馬組織Nox4介導的氧化應(yīng)激和鐵死亡相關(guān)。給予PAME治療后,發(fā)現(xiàn)術(shù)后小鼠海馬組織ROS和鐵含量減少,且海馬Nox4表達明顯受到抑制,同時ACSL4生成減少而GPX4表達增多。這一現(xiàn)象初步證實了PAME可能通過Nox4抑制了鐵死亡途徑,改善了小鼠術(shù)后學習記憶功能。

為了進一步證實PAME的作用靶點是Nox4,本研究選用了Nox4過表達腺相關(guān)病毒這一工具,實現(xiàn)了小鼠海馬區(qū)Nox4的過表達。而Nox4過表達會加重氧化應(yīng)激和鐵死亡,與鐵死亡相關(guān)的ROS、鐵含量及ACSL4會明顯增加,GPX4明顯降低[15]。實驗結(jié)果表明海馬Nox4過表達后小鼠術(shù)后學習記憶損害加重,ROS、鐵含量、ACSL4進一步增加,GPX4顯著降低,提示海馬Nox4介導的鐵死亡可能是小鼠術(shù)后發(fā)生學習記憶障礙的重要機制。此外,海馬Nox4過表達后的小鼠給予PAME治療,學習記憶功能改善作用、ROS及鐵含量的抑制作用均受到限制,且Nox4、ACSL4表達再次出現(xiàn)增加,GPX4下調(diào),這一現(xiàn)象證明PAME是通過抑制海馬Nox4從而改變下游鐵死亡相關(guān)蛋白,抑制了海馬氧化應(yīng)激和鐵死亡,進而改善了術(shù)后學習記憶功能。