朱紅俊 徐 辰 龔少愚 毛愛琴 周春剛 陸 曙

(1 無錫市中醫(yī)醫(yī)院,無錫,214000; 2 江南大學醫(yī)學院,無錫,214000)

原發(fā)性高血壓是臨床常見心血管疾病之一。我國成年居民的高血壓患病率達到27.9%[1]。在原發(fā)性高血壓的治療領(lǐng)域,中醫(yī)藥的臨床療效的提高尚需要創(chuàng)新思路與方藥。因此,我們基于五運六氣理論將高血壓分為陽明型、太陽型、厥陰型3型,進行分型治療,臨床療效顯著[2-4]。其中對脈象平弦的厥陰型高血壓采用柴歸湯治療,在降低舒張壓(Diastolic Blood Pressure,DBP)方面優(yōu)于厄貝沙坦或氨氯地平單藥治療[4]。但是,對柴歸湯干預高血壓的具體機制尚不清楚。我們通過高鹽誘導的小鼠高血壓模型對柴歸湯的作用機制進行了初步研究,發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)血漿及腎組織的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(Angiotensin-Converting Enzyme 2,ACE2)水平,以及腸道菌群可能是柴歸湯對小鼠血壓水平的干預機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取40只5周齡雄性C57BL6小鼠,購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司(合格證編號:20170005022803),飼養(yǎng)于江南大學實驗動物房[許可證號:SYXK(蘇)2017-0052]。動物房環(huán)境清潔，通風設(shè)備良好。溫度保持在20～25 ℃，相對濕度50%。所有小鼠在同等條件下分籠飼養(yǎng)，12 h燈光晝夜交替，飲食(普通標準飼料由江南大學動物實驗中心提供)、飲水自由。高血壓小鼠飼養(yǎng)及模型建立、分組干預在江南大學完成，本研究經(jīng)動物論述委員會批準通過(倫理審查號:JN.No20191230c1300630〔373〕)。

1.1.2 藥物 1)柴歸湯灌胃藥劑由無錫市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供。柴歸湯由張仲景經(jīng)方小柴胡湯和當歸芍藥散合方。小柴胡湯組成:“柴胡半斤,黃芩、人參、甘草、生姜各3兩,大棗12枚,半夏半升?！盵5]當歸芍藥散組成:當歸3兩,芍藥1斤,茯苓、白術(shù)各4兩,澤瀉半斤、川芎半斤[6]。根據(jù)我們臨床經(jīng)驗及《中國老年高血壓管理指南2019》《中國高血壓防治指南(2018年修訂版)》,減去了甘草和大棗,人參用北沙參代替。參照《傷寒雜病論》合方時柴胡用量減半例,柴胡劑量由8兩減少到4兩。臨床常用經(jīng)方劑量換算以1兩=3 g、1兩=5 g、1兩=15 g最為多見[7]。因此,我們?nèi)「邉┝?兩=15 g進行計算。最終柴歸湯處方組成與劑量:柴胡60 g(批號:19123001)、北沙參45 g(批號:20021401)、姜半夏40 g(批號:20032101)、澤瀉120 g(批號:2022201),從江蘇亞邦中藥飲片有限公司購入;黃芩45 g(批號:200301)、生姜45 g(市場鮮貨)、當歸45 g(批號:200323)、生白芍240 g(批號:200418)、茯苓60 g(批號:200404)、生白術(shù)60 g(批號:200404)、川芎120 g(批號:200316),從蘇州天靈中藥飲片有限公司購入。全方由無錫市中醫(yī)醫(yī)院制劑室制作成水煎劑。每劑煎成2袋,90 mL/袋。2)貝那普利(北京諾華制藥有限公司,批號:X2872)由無錫市中醫(yī)醫(yī)院藥房提供。采用生理鹽水配置成0.2 mg/mL溶液。3)8%NaCl高鹽飼料(南通特洛菲公司,貨號:TP6032)。

1.1.3 試劑與儀器 Mouse ACE2 ELISA試劑(ABCAM公司,美國,批號:GR3326353-1);腎臟組織ACE2 ELISA試劑(RB公司,美國,貨號:DRE-M3394c);腎素ELISA試劑(RB公司,美國,貨號:DRE-M0560c)。無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)(IITC Life Science公司,美國,型號:Mrbp-mmc);冷凍高速離心機(Thermo Fisher,美國,型號:Fresco 17);酶標儀(Bio Tek Instruments,美國,型號:ELx800)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將40只C57BL6小鼠預適應(yīng)1周后,按照無特定病原體(Specefic Pathogen Free,SPF)級飼養(yǎng)標準適應(yīng)性飼養(yǎng),進行標號并分為對照組10只和高鹽組30只。其中對照組飼喂正常的飼料和水,高鹽組先喂高鹽飼料1個月,1個月之后3 d測1次血壓,檢測血壓達到高血壓標準后,開始通過尾壓法連續(xù)測血壓,觀察小鼠的血壓變化情況。當小鼠收縮壓(Systolic Blood Pressure,SBP)持續(xù)穩(wěn)定維持在130 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)以上時,表明高血壓模型誘導成功。建模成功后,隨機抽取10只小鼠作為模型組。其他20只高血壓模型小鼠隨機分為貝那普利干預組(貝那普利組)、柴歸湯干預組(柴歸湯組)。

1.2.2 干預方法 柴歸湯組每只小鼠給予灌胃1次/d。按照人體標準體質(zhì)量60 kg,換算后,每20 g體質(zhì)量小鼠給予灌胃柴歸湯0.5 mL。貝那普利組小鼠給予灌胃貝那普利0.2 mg/mL水溶液,1次/d,按照小鼠體質(zhì)量6 mg/kg給藥。干預期間,每周檢測1次血壓并記錄,連續(xù)干預4周。

1.2.3 檢測指標與方法 1)血壓異常指標:本研究通過尾壓法測量小鼠的SBP和DBP。使用了嚙齒動物無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)。2)將小鼠腎臟組織存儲在-80 ℃冰箱中。檢測前,預先在低溫環(huán)境下各組小鼠均取1個完整腎臟組織,-80 ℃保存?zhèn)錂z。檢測時,首先將全自動快速研磨儀的模塊和研磨珠放置于-20 ℃冰箱中冷卻。將預先稱重好的小鼠腎臟和3粒研磨珠置于無RNA酶的2 mL離心管中,并加入預冷的1 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS),將該離心管置于預冷的模塊中并在研磨儀上固定。設(shè)置參數(shù)為1 500 r/min,運行20 s,間隔10 s,重復3次,得到小鼠腎臟勻漿。然后于冷凍高速離心機,12 000 r/min,離心半徑5 cm,離心20 min,取上清備用。3)血漿ACE2水平、腎臟組織腎素和ACE2水平:血漿ACE2水平、腎臟組織腎素和ACE2水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測量。血清及組織勻漿酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測均在無錫市中醫(yī)院心血管疾病實驗室采用酶標儀測定。4)蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,HE)染色觀察:腎臟組織HE染色委托本院病理科完成。5)腸道菌群檢測方法:腸道菌群豐度委托武漢華大醫(yī)學檢驗所有限公司進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血壓情況比較 每周重復血壓測量顯示,隨著時間的變化,柴歸湯和貝那普利可持續(xù)穩(wěn)定降低小鼠SBP和DBP水平,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見圖1～2。

圖1 柴歸湯對高血壓小鼠收縮壓(SBP)的干預作用注:組間重復測量方差分析,F=25.266,P<0.001

圖2 柴歸湯對高血壓小鼠舒張壓(DBP)的干預作用注:組間重復測量方差分析,F=19.369,P<0.001

2.2 干預4周后各組小鼠血壓和血漿ACE2的水平比較 干預4周后,柴歸湯組、貝那普利組、對照組的SBP、DBP水平均顯著低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。柴歸湯組、貝那普利組、對照組血壓水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組比較,模型組血漿ACE2水平顯著下降;貝那普利、柴歸湯則升高了高血壓小鼠降低的血漿ACE2水平,且貝那普利組血漿ACE2水平高于柴歸湯組;差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.001)。見表1。

表1 干預4周后各組小鼠血壓及血漿ACE2水平比較

2.3 各組小鼠的腎臟組織病理觀察和腎臟組織腎素、ACE2水平比較 各組小鼠的腎組織病理HE染色差異無統(tǒng)計學意義。模型組、貝那普利組、柴歸湯組的腎臟組織腎素、ACE2水平及其比值均低于對照組;干預后柴歸湯組、貝那普利組的組織腎素、ACE2水平均低于模型組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。柴歸湯組和貝那普利組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3,表2。

表2 各組小鼠腎組織腎素、ACE2水平及其比值的比較

圖3 各組小鼠的腎臟組織病理觀察比較(HE染色,×25)

2.4 腸道菌群16S分析 相對于對照組,高血壓組小鼠腸道Bacteroidia菌群豐度降低,而Clostridia菌群豐度升高。柴歸湯組和貝那普利干預后,高血壓小鼠降低的腸道Bacteroidia菌群豐度升高了,而升高的腸道Clostridia菌群豐度降低了。組間Beta多樣性分析(非加權(quán)UniFirac法),模型組和貝那普利組的菌群多樣性差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 腸道菌群豐度多樣性比較注:模型組和貝那普利組的菌群多樣性比較,P=0.026;Blank.對照組;NN.模型組;N.BNPL.貝那普利組;N.CGT.柴歸湯組

3 討論

厥陰型高血壓患者的脈象特點是弦而不沉,適合柴歸湯治療。通過超高效液相色譜與四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用對柴歸湯的化學組學和代謝組學進行分析,我們確定了柴歸湯的174個功效成分[5]。但是,柴歸湯對高血壓的干預機制尚不清楚。

高血壓的動物模型目前常用的有自發(fā)性高血壓大鼠模型,以及通過高鹽誘導、L-name誘導或血管緊張素2(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ)誘導等建立的小鼠高血壓模型。本實驗通過高鹽飲食誘導的高血壓小鼠模型,SBP保持在125～150 mm Hg、DBP保持在95～130 mm Hg,較好地模擬了高血壓的病理狀態(tài)。同時,高鹽誘導的高血壓小鼠,血漿ACE2水平及腎組織的腎素/ACE2的比值顯著下降;且腸道Bacteroidia菌群豐度降低,而Clostridia菌群豐度升高。因此,高鹽誘導的高血壓小鼠,其血壓升高的機制和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin-angiotensin-aldosterone Aystem,RAAS)、腸道菌群紊亂等機制有關(guān),這與文獻[6-9]研究一致。

本文通過小柴胡湯和當歸芍藥散的合方——柴歸湯對此模型進行了干預。干預研究結(jié)果顯示,對于高鹽誘導的高血壓小鼠,柴歸湯可以穩(wěn)定降低SBP和DBP水平,干預4周的降壓效果與高劑量貝那普利(相當于人40 mg/d)相當。其作用機制和柴歸湯升高高血壓小鼠異常降低的血漿ACE2水平和腎組織的腎素/ACE2的比值、改善高血壓小鼠紊亂的腸道菌群豐度有關(guān)。而ACE2是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin System,RAS)重要組成部分,促進血管緊張素(Angiotensin,Ang)(1-7)生成并結(jié)合mas受體舒張血管[10-11]、抗衰老[12]。通過ACE2-Ang(1-7)-Mas軸探討原發(fā)性高血壓中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)也是研究方向之一[13]。研究證實,小柴胡湯可以降低高血壓患者的血壓[14-15],其主要活性成分與ACE2均有較強的結(jié)合力[16],當歸芍藥散加味可以顯著提高左旋氨氯地平治療高血壓的療效[17],也顯著提高對妊高征的治療效果[18]。

本研究中,柴歸湯顯著升高了高血壓小鼠的血漿ACE2水平,提示干預RAS是柴歸湯治療高血壓的作用機制之一。而通過調(diào)節(jié)腸道菌群來發(fā)揮治療作用是中醫(yī)藥等天然藥物的治療方式之一。本研究提示,柴歸湯可以升高高血壓小鼠異常降低的腸道Bacteroidia菌群豐度,并降低異常升高的腸道Clostridia菌群豐度。因此,通過調(diào)節(jié)腸道菌群是柴歸湯降低小鼠血壓的另一個機制。但是,腸道菌群和ACE2之間的關(guān)聯(lián)尚需要進一步研究。

綜上所述,柴歸湯對高鹽誘導的高血壓小鼠具有良好的降血壓作用。其作用機制與升高血漿ACE2水平并調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)。這在我們文獻查閱中未見有相關(guān)報道,將為研究五運六氣理論和張機經(jīng)方治療高血壓的機制提供新思路。

利益沖突聲明:無。