徐飛麒,張 哲,胡 昂,黃東勝

徐飛麒,張哲,浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 浙江省杭州市 310053

徐飛麒,張哲,黃東勝,浙江省人民醫(yī)院,杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院肝膽胰微創(chuàng)外科 浙江省杭州市 310014

胡昂,杭州醫(yī)學(xué)院 浙江省杭州市 310059

0 引言

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的原發(fā)性肝惡性腫瘤,其嚴(yán)重威脅人類的生命和健康,有文獻(xiàn)報道[1-3],預(yù)計到2030年將會有超過100萬人死于HCC.HCC的發(fā)病非常隱匿,早期診斷困難,超過80%的HCC患者在確診時就已經(jīng)處于進(jìn)展期,甚至失去手術(shù)根治的機會.早期診斷困難導(dǎo)致患者不能及時得到有效的治療,是HCC患者預(yù)后較差的主要原因之一[4,5].另外,HCC患者術(shù)后5年內(nèi)的復(fù)發(fā)率高達(dá)70%,患者在接受根治性治療后未能對腫瘤進(jìn)展進(jìn)行準(zhǔn)確監(jiān)測,而錯過最佳治療時機,也是導(dǎo)致HCC患者不良預(yù)后的重要原因[6].

目前多個指南建議對于乙型肝炎病毒感染、肝硬化等HCC發(fā)病的高?；颊?采取超聲聯(lián)合甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)的檢測進(jìn)行HCC的早期篩查與診斷,但其敏感性和特異性并不理想,且有超過1/3的小肝癌患者存在AFP陰性的情況[7].另外,近年來非酒精性脂肪性肝硬化相關(guān)的HCC患者數(shù)量逐年增加,這一類患者的肝臟脂肪性病變嚴(yán)重,嚴(yán)重的脂肪性病變大大降低了超聲檢查對小肝癌診斷的敏感性[8,9].而在HCC患者的治療后隨訪過程中,我們主要采用影像學(xué)檢查包括超聲、增強CT、磁共振等方法聯(lián)合血清標(biāo)志物的檢測來進(jìn)行腫瘤治療后的療效評價及復(fù)發(fā)監(jiān)測,而這一方法對早期腫瘤復(fù)發(fā)的監(jiān)測敏感性和特異性仍不能令人滿意,且檢查繁瑣、花費巨大.因此,我們亟需找到能提高HCC早期診斷的敏感性及特異性,以及能在HCC的治療后隨訪過程中及時準(zhǔn)確地對腫瘤進(jìn)展進(jìn)行監(jiān)測的有效方法,以便對存在早期復(fù)發(fā)跡象的患者采取及時有效的治療干預(yù)措施,從而改善HCC患者的預(yù)后.

生物標(biāo)志物在HCC的診斷、進(jìn)展監(jiān)測以及預(yù)后評估方面都有非常重要的作用.近年來,越來越多的新型生物標(biāo)志物的出現(xiàn),以及一些基于AFP等多個HCC預(yù)后相關(guān)變量的統(tǒng)計模型的出現(xiàn),都極大地改善了HCC的診療現(xiàn)狀[10].另外,隨著對肝癌細(xì)胞研究的深入以及生物學(xué)技術(shù)的提高,液體活檢技術(shù)成為HCC診斷與治療相關(guān)領(lǐng)域的另一個熱點.在此,本文就近年來生物標(biāo)志物在HCC的診斷與治療中的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,旨在為HCC的早期診斷、治療后療效評價、復(fù)發(fā)監(jiān)測提供文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)支持,為改善HCC患者的預(yù)后提供新思路.

1 血清標(biāo)志物

1.1 AFP AFP是一種結(jié)構(gòu)與人血清白蛋白類似的生物活性蛋白,其分子量大約為70 kDa.1964年Tatarinov首先證實了原發(fā)性肝癌患者血清中存在大量AFP,近幾十年來,AFP是最廣泛的運用于HCC診斷與預(yù)后評估等方面的生物標(biāo)志物.但其不管在診斷HCC的敏感性還是特異性方面都不理想.并且血清AFP值不僅僅只在HCC患者中會升高,在一些慢性肝病、生殖系統(tǒng)腫瘤患者中同樣可能存在AFP的升高,從而導(dǎo)致AFP診斷HCC的假陽性率上升[11].如果將AFP作為一個獨立的篩查指標(biāo)應(yīng)用于HCC的診斷顯然是不可取的,但是將AFP與超聲檢查相結(jié)合,能大大提高對早期HCC的檢出率.近年來一項薈萃分析顯示,超聲檢查單獨用于HCC診斷的敏感性僅為45%,而將AFP與超聲相結(jié)合后的敏感性可達(dá)到63%[12].此外,AFP在藥物療效預(yù)測方面也發(fā)揮著重要作用[13].最近一項對565例接受索拉非尼治療失敗的HCC患者的隨機對照試驗顯示,在AFP水平高的亞組里應(yīng)用雷莫蘆單抗治療能給患者帶來更好的長期預(yù)后[14].另外一項來自中國的多中心、大樣本的回顧性分析顯示,對于術(shù)前AFP＞400 ng/mL的HCC患者,結(jié)合其術(shù)后AFP水平聯(lián)合評估可以有效預(yù)測腫瘤的復(fù)發(fā)以及長期預(yù)后[15].總之,AFP作為目前在HCC領(lǐng)域運用最廣泛的生物標(biāo)志物,在HCC的診斷、療效評估、復(fù)發(fā)監(jiān)測等方面都發(fā)揮著重要作用.將AFP與其他檢查手段結(jié)合,或者將它與其他指標(biāo)聯(lián)合運用于統(tǒng)計模型,能大大提高AFP在HCC的診斷與治療方面的價值.

1.2 AFP異質(zhì)體 AFP異質(zhì)體是甲胎蛋白異常糖基化的產(chǎn)物.1970年P(guān)urves對HCC患者血清作凝膠電泳時發(fā)現(xiàn)AFP有不同的遷移率,首先提出了甲胎蛋白異質(zhì)體這一概念,隨后Taketa等[16,17]發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌患者血清中AFP與小扁豆素結(jié)合后,電泳分成三帶,并將其依次命名為AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3,AFP-L3被認(rèn)為是診斷早期HCC可靠的生物標(biāo)志物.不同研究報道AFP-L3在診斷早期HCC的敏感性范圍在49%-60%之間[18-20],最近一項來自美國共納入534例患者的Ⅲ期獨立隊列研究表明,當(dāng)AFP-L3的截斷值為40%時,其診斷早期HCC的敏感性為40%,假陽性率為10%[21].總之,單獨應(yīng)用AFP-L3對HCC的診斷敏感性仍然較低,但近幾年它被納入多個模型中與其他生物標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用,其聯(lián)合檢測的效能得到較大提升.另外,有研究表明術(shù)前AFP-L3水平有助于監(jiān)測肝癌術(shù)后早期復(fù)發(fā),且術(shù)后AFP-L3水平≥5%是影響肝癌患者術(shù)后較差預(yù)后的獨立危險因素[風(fēng)險比(hazard ratio,HR): 1.63,95%置信區(qū)間(95% confidence interval,95%CI): 1.18-2.26,P=0.003][22].

1.3 異常凝血酶原 異常凝血酶原,即維生素K缺乏或拮抗誘導(dǎo)的蛋白-Ⅱ(protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ,PIVKA-Ⅱ),又稱脫-γ-羧基凝血酶原(des-γcarboxy-prothrombin,DCP),是一種在肝癌細(xì)胞中凝血酶原前體羧化不足產(chǎn)生的蛋白質(zhì),由Liebman等[23]于1984年首次報道.有研究表明[24,25],PIVKA-Ⅱ?qū)CC的診斷的靈敏度和特異度分別達(dá)到了80%和89%.在一項對131例早期HCC患者的Ⅱ期研究中,單獨使用PIVKA-Ⅱ診斷HCC的曲線下面積(area under the receiver operating characteristic,AUROC)為0.72[20].一項國內(nèi)的多中心、大樣本回顧性研究表明,使用PIVKA-Ⅱ單獨診斷丙型病毒性肝炎相關(guān)肝癌(HCV-HCC)以及非酒精性脂肪性肝病相關(guān)肝癌(NAFLD-HCC)的AUROC均高于單獨使用AFP以及AFP-L3(PIVKA-Ⅱ 0.90vsAFP 0.80vsAFP-L3 0.69;PIVKA-Ⅱ 0.869vsAFP 0.76vsAFP-L3 0.689),另外,將PIVKA-Ⅱ、AFP以及AFP-L3三者聯(lián)合用于診斷可大大提升其診斷效能[26,27].同時有研究指出PIVKA-Ⅱ在肝癌細(xì)胞的增值、血管浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著作用,這意味著它是HCC患者預(yù)后判斷的潛在標(biāo)志物[28,29].另有研究表明[30],術(shù)前PIVKA-Ⅱ陽性是預(yù)測HCC切除術(shù)后早期復(fù)發(fā)的獨立危險因素(HR: 2.384,95%CI: 1.735-3.276,P＜0.001).

1.4 血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3,GPC3)是一類錨定在細(xì)胞膜上的癌胚蛋白,Zhou等[31]和Anatelli等[32]在2008年首次報道了其在HCC患者中存在特異性高表達(dá).近年來,GPC3被認(rèn)為是一種新的HCC血清標(biāo)志物,該蛋白通過激活Wnt信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長[33,34].雖然有不少研究報道了GPC3用于診斷HCC的敏感度和特異度,但其結(jié)果存在較大差異,一項薈萃分析顯示其診斷HCC的合并敏感度和合并特異度分別為56%和89%[35].另外,最新的一項薈萃分析表明,單獨使用GPC3診斷HCC的AUROC為0.7793[36].此外,近期的一項研究發(fā)現(xiàn)GPC3是肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立危險因素,并將其聯(lián)合其他影像學(xué)指標(biāo)納入術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測的預(yù)測模型,該模型展現(xiàn)出了不錯的預(yù)測效能(AUROC: 0.931)[37].

1.5 Dickkopf-1 Dickkopf-1(DKK-1)蛋白屬于富含半胱氨酸蛋白家族,于1998年在非洲蟾蜍胚胎細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[38].盡管該蛋白被認(rèn)為是Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑,但其確切的功能尚未完全闡明[39,40].一項薈萃分析顯示[41],DKK-1診斷HCC的合并敏感度和特異度達(dá)到了64%和94%.另外一項共納入831名肝癌患者的多中心研究發(fā)現(xiàn)[42],DKK-1在診斷AFP陰性肝癌患者方面的AUROC達(dá)到了0.841(95%CI: 0.815-0.923),并且在診斷早期肝癌患者方面也展現(xiàn)出了不錯的效能(AUROC:0.870,95%CI: 0.829-0.911).另有學(xué)者研究指出將DKK-1、AFP、PIVKA-Ⅱ三者聯(lián)合用于診斷肝癌的AUROC可以達(dá)到0.952,診斷效能優(yōu)于任何單獨與組合的模式[43].對于DKK-1在肝癌的復(fù)發(fā)監(jiān)測及預(yù)后評估方面的研究較少,有學(xué)者報道DKK-1在評價肝癌患者接受經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞治療(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)后的療效中具有一定的預(yù)測價值[44].

2 血清標(biāo)志物相關(guān)模型

AFP作為HCC診斷及腫瘤進(jìn)展、療效監(jiān)測的基礎(chǔ)標(biāo)志物已經(jīng)是無可爭議的,近年來研究者們以AFP為基礎(chǔ),將它與多種新型標(biāo)志物結(jié)合納入統(tǒng)計模型,可大大提高其敏感度和特異度.

2.1 GALAD模型 GALAD模型是基于性別、年齡、AFP-L3、AFP、DCP這五個變量所構(gòu)建的統(tǒng)計模型,用于HCC的早期診斷,由Johnson等[45]于2014年首次提出.該模型在診斷早期HCC的敏感性和特異性分別達(dá)到了85.6%和93.3%,AUROC為0.9662,特別有助于AFP陰性HCC的早期診斷[45,46].GALAD模型的計算形式為: Z=-10.08+0.09×年齡(歲)+1.67×性別+2.34×log[AFP(ng/mL)]+0.04×AFP-L3 (ng/mL)+1.33×log[DCP(ng/mL)],其中男性賦值為1,女性賦值為0.該模型的效能在一項由梅奧診所牽頭的北美國際隊列(一共291名參與者)中得到了獨立驗證[46-49].然而,該模型暫缺乏更多大型的前瞻性隊列研究來進(jìn)行檢驗證明,目前,亞洲和中東地區(qū)正在進(jìn)行相關(guān)大型前瞻性的隊列研究[50].

2.2 ASAP模型 爭對中國乙型病毒性肝炎感染相關(guān)HCC為主的特點,2019年在一項國內(nèi)多中心的前瞻性研究中基于性別、年齡、AFP、DCP四個變量構(gòu)建了ASAP模型,用于HCC的早期診斷[51].ASAP模型的計算形式為: [p/(1-p)]=-7.57711770+0.04666357×年齡(歲)-0.57611693×性別+0.42243533×ln[AFP(ng/mL)]+1.10518910×ln[DCP(ng/mL)],其中男性賦值為0,女性賦值為1.該模型較GALAD模型少了一個變量AFP-L3,這大大降低了檢測成本,并且針對中國人群,其用于診斷HCC的效能優(yōu)于GALAD模型(AUROC: 0.935vs0.921,P＜0.006)[51].另外,最近的研究顯示,ASAP用于診斷早期HCV-HCC的效能同樣優(yōu)于GALAD模型(AUROC: 0.917vs0.894),并且在AFP陰性患者亞組中的分析也得到了同樣的結(jié)論[52].

2.3 BALAD模型 BALAD模型最初由Toyoda等[53]于2006年構(gòu)建,由膽紅素、白蛋白、AFP-L3、AFP、DCP五個變量組成,現(xiàn)在也稱BALAD-2模型,用于協(xié)助評估HCC患者的預(yù)后.該模型的變量由腫瘤負(fù)荷(AFP、DCP、AFP-L3)以及肝功能(膽紅素、白蛋白)兩方面構(gòu)成,用于HCC患者預(yù)后的評估顯然是合理的.一項來自歐美的多中心研究證明BALAD-2模型可評估不同分級患者的生存率,另外一項來自日本的納入24029例HCC患者的全國性調(diào)查也發(fā)現(xiàn),BALAD-2模型有助于對肝細(xì)胞癌的分期和預(yù)后進(jìn)行評估[54-56].

2.4 Doylestown算法/Doylestown plus算法 Doylestown算法最初由Wang等[57]于2016年構(gòu)建,該算法模型由log(AFP)、年齡、性別、堿性磷酸酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶五個指標(biāo)組成.隨后他們在一項涉及69例早期HCC(T1或T2期)患者和93例肝硬化對照的Ⅱ期研究中,將巖藻糖基化激肽原添加到算法中,構(gòu)建Doylestown plus算法,其診斷早期HCC的AUROC達(dá)到了0.97,分別高于單獨使用Doylestown算法和AFP(0.93和0.80)[58].另外在一項包含29例HCC患者)和58例對照組的巢式病例對照研究表明,Doylestown plus算法的敏感性為63.2%[59].目前針對Doylestown plus算法的效能檢驗有更大的Ⅱ期隊列研究正在進(jìn)行(NCT03878550)[60].

3 液體活檢

液體活檢是指從人體的體液(尤其是血液)中提取具有腫瘤或基因特征信息的微小成分,主要包括循環(huán)游離DNA、循環(huán)游離RNA、細(xì)胞外囊泡等;近年來隨著對肝癌細(xì)胞研究的深入以及生物學(xué)技術(shù)的提高,液體活檢技術(shù)成為HCC診斷與治療相關(guān)領(lǐng)域的另一個熱點[61,62].

3.1 循環(huán)游離DNA 循環(huán)游離DNA(cell-free DNA,cfDNA)是細(xì)胞通過凋亡、壞死和活性分泌釋放到包括血液、尿液和腦脊液在內(nèi)的體液中的DNA分子[63],包括循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)、游離線粒體DNA、游離病毒DNA等.其中,ctDNA主要來源于壞死的腫瘤細(xì)胞,因此這部分的DNA突變與其來源的腫瘤細(xì)胞是相同的,所以可以通過對其突變基因、甲基化等的檢測,來預(yù)測早期腫瘤的發(fā)生[64].近年來,ctDNA在HCC的早期診斷以及療效監(jiān)測方面的突出表現(xiàn)得到了學(xué)者的肯定.在一項Ⅱ期病例對照研究中,Chalasani等[65]構(gòu)建的一種名為多靶點HCC血液檢測(mt-HBT)的算法模型,將三種甲基化ctDNA標(biāo)記物、AFP、性別組合納入模型,對早期HCC的診斷敏感性為82%,特異性為87%,AUROC為0.91.Qu等[66]通過聯(lián)合檢測ctDNA突變(TP53、CTNNB1等)、AFP、PIVKA-Ⅱ,對社區(qū)中乙肝表面抗原陽性患者進(jìn)行早期HCC的篩查,交叉驗證顯示這個聯(lián)合檢測方法診斷HCC的靈敏度和特異度分別達(dá)到了83%和93%.另外,ctDNA在檢測HCC治療期間或緩解期患者體內(nèi)殘留的癌細(xì)胞方面具有一定效能,從而監(jiān)測腫瘤早期復(fù)發(fā).一項研究表明[67],通過對ctDNA進(jìn)行相關(guān)檢測可以在MRI發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)灶之前預(yù)測復(fù)發(fā),其性能似乎優(yōu)于血清生物標(biāo)志物AFP、AFPL3和DCP.另外一項納入258例接受肝切除手術(shù)的肝癌患者的前瞻性隊列研究發(fā)現(xiàn)[68],術(shù)前患者ctDNA中基因突變的總數(shù)與肝癌術(shù)后的早期復(fù)發(fā)獨立相關(guān)(HR=2.2,P＜0.001),這表明通過術(shù)前對肝癌患者的ctDNA進(jìn)行相關(guān)檢測可以預(yù)測其術(shù)后的早期復(fù)發(fā).

除了ctDNA外,另外一項巢式病例對照研究發(fā)現(xiàn)[69],游離線粒體DNA含量較低的慢性乙肝患者較含量高的患者發(fā)生肝癌的風(fēng)險更高(OR: 2.21,95%CI: 1.28-3.72,P=0.004),這也預(yù)示了循環(huán)游離線粒體DNA在診斷早期肝癌方面的潛在作用.此外,循環(huán)游離線粒體DNA還可以用于評價TACE聯(lián)合中藥治療后的肝癌患者的療效[70].除此之外,也有相關(guān)研究證實了游離病毒DNA在診斷早期肝癌方面的價值[71].一項觀察性研究報道了游離病毒DNA在監(jiān)測乙肝相關(guān)肝癌術(shù)后腫瘤殘留以及早期復(fù)發(fā)方面的價值[72].

3.2 循環(huán)游離RNA 循環(huán)游離RNA(cell-free RNA,cfRNA)是液體活檢另一個獲取腫瘤信息的來源,這是一個非常龐大的家族,種類繁多,包括長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,LncRNA)、微小RNAs(microRNAs,miRNAs)、circRNA等.已有許多研究證實了LncRNA和miRNAs在HCC診斷以及預(yù)后判斷方面的價值[73-75].有研究表明[76]LncRNA如LINC00462、HOTAIR和MALAT1,在肝癌組織中顯著上調(diào),預(yù)示其在診斷肝癌方面的潛在作用.有研究報道[77],LncRNA在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用,在發(fā)生轉(zhuǎn)移的HCC患者中LncRNAAT B上調(diào)預(yù)示不良的預(yù)后;抑制轉(zhuǎn)移的Lnc RNA miR503HG上調(diào)預(yù)示良好的預(yù)后.一項納入50項研究,總計3423例肝癌患者和2403例慢性肝病患者的薈萃分析

研究表明[78],miRNA用于診斷肝癌的AUROC為0.82,敏感性為75.8%,特異性為75%.circRNA作為一種共價閉合環(huán)結(jié)構(gòu)的非編碼RNA,可被分泌到人體循環(huán)血液中,作為疾病診斷的生物標(biāo)志物[79].Zhang等[80]的研究發(fā)現(xiàn)HCC患者血漿中的多種circRNA水平低于肝硬化患者、乙肝患者和健康對照組患者(均P＜0.001),通過ROC分析可以發(fā)現(xiàn)其對診斷HCC良好的敏感度和特異度,并且其在血漿中的水平與TNM分期以及腫瘤大小呈正相關(guān).

3.3 細(xì)胞外囊泡 細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)是細(xì)胞排出的包含各種生物信息的封閉結(jié)構(gòu),可以在人血漿中被檢測到,對細(xì)胞外囊泡的分析是液體活檢的另一種形式.Sun等[81]將36例早期HCC患者的血漿與26例肝硬化患者的血漿進(jìn)行比較,運用EV芯片對EV進(jìn)行檢測,以此來診斷HCC的敏感性達(dá)到了94.4%,特異性為88.5%.之后有待更加準(zhǔn)確的EV檢測芯片的開發(fā)以及在更大的隊列中對其檢測效能進(jìn)行驗證.

4 結(jié)論

當(dāng)前,由于HCC早期診斷困難以及治療后較高的復(fù)發(fā)率,HCC患者的預(yù)后仍然較差,尋求有效的早期診斷以及治療后早期復(fù)發(fā)監(jiān)測的方法顯得尤為重要.近年來各種新型生物標(biāo)志物的出現(xiàn),基于各種生物標(biāo)志物構(gòu)建的數(shù)理統(tǒng)計模型的運用,以及液體活檢技術(shù)的出現(xiàn)與推廣都大大提高了HCC早期診斷以及復(fù)發(fā)監(jiān)測的敏感度與特異度.未來通過對更多新型生物標(biāo)志物的探索以及更高敏感度與特異度的統(tǒng)計模型的構(gòu)建,同時隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展,尋找提高液體活檢敏感度的方法并盡可能減少其費用,以此探索HCC的早期診斷、腫瘤進(jìn)展、療效評估、早期復(fù)發(fā)監(jiān)測、生存期預(yù)測更有效的方法工具,從而改善HCC患者預(yù)后.