邱峙嵩,陳 曉,馬洪軒,胡 平*

(1. 廣西大學林學院,南寧 540003;2. 廣西國有高峰林場,南寧 540003)

廣西桉樹Eucalyptus人工林貢獻了全國1/4以上的木材,在我國木材安全和儲備林建設上起著非常重要的作用(楊章旗, 2019);桉樹同時也是亞熱帶和熱帶荒山瘠地造林的先鋒樹種,其健康、可持續(xù)發(fā)展,對我國具有十分重大的經(jīng)濟、生態(tài)價值和戰(zhàn)略意義(陳勇平等, 2019)。桉蝙蛾Endoclitasignifer是近年來新發(fā)現(xiàn)的桉樹蛀干害蟲,在廣西分布范圍極廣,在區(qū)內(nèi)所有市、84.68%縣區(qū)和全部13個自治區(qū)直屬國有林場均有危害(楊秀好等, 2021)。桉蝙蛾是本地害蟲適應外來寄主的典型案例,僅在廣西危害的木本植物就達30科42屬54種(楊秀好等, 2021),其幼蟲主要危害1～3年桉樹幼林。成蟲卵散產(chǎn)于地面孵化后,幼蟲在朽木或落葉層地棲至3齡,后轉移并選擇寄主上樹危害(楊秀好, 2013),即使在桉樹混交林中其3齡幼蟲也能準確選擇并危害桉樹(楊秀好, 2017),推測桉蝙蛾幼蟲在轉移過程中能通過其嗅覺系統(tǒng)主動識別桉樹。

嗅覺是昆蟲感知外界環(huán)境、進行信息交流的關鍵,嗅覺系統(tǒng)可以引導昆蟲進行寄主定位、食物選擇、求偶、選擇棲息地等行為(莫建初等, 2019)。昆蟲的嗅覺識別過程需要多種嗅覺相關蛋白參與,如氣味結合蛋白(Odorant Binding Proteins, OBPs)、化學感受蛋白(Chemosensory Proteins, CSPs)、氣味受體(Odorant Receptors, ORs)、離子型受體(Ionotropic Receptors, IRs)及感覺神經(jīng)元膜蛋白(Sensory Neuron Membrane Proteins, SNMPs)(Zhou, 2010);其中,除ORs、SNMPs、IRs、GRs是昆蟲嗅覺蛋白中的膜蛋白外,OBPs和CSPs是昆蟲嗅覺蛋白中的結合蛋白,其主要功能是在感器淋巴液中結合通過極孔進入的氣味分子(Breeretal., 1990),并將其轉運到昆蟲的氣味受體,觸發(fā)嗅覺相關信號轉導(Zhou, 2010; Zhangetal., 2021a)。OBPs主要在昆蟲觸角中特異性表達(張方梅等, 2019),且已證實許多OBPs在化學感器(Brunoetal., 2018; Pregitzeretal., 2019; Caietal., 2020)中表達,但也有研究發(fā)現(xiàn)OBPs也可在昆蟲其他組織中被檢測到(王曉雙等, 2017)。OBPs可以通過識別普通氣味分子和昆蟲信息素與外界環(huán)境交流,目前的研究表明大多數(shù)昆蟲氣味結合蛋白均能結合寄主植物揮發(fā)物(王冰等, 2021),如白蠟窄吉丁Agrilusplanipennis體內(nèi)的AplaOBP1與5種寄主植物揮發(fā)物表現(xiàn)出高親和力(Wangetal., 2020);蜜蜂通過OBPs識別揮發(fā)性信息素與同類進行交流(Wuetal., 2020)。OBPs還參與昆蟲的其他行為及生命活動,如梨小食心蟲Grapholitamolesta體內(nèi)的GmolOBP14在雄蟲翅中存在高表達量,推測與調(diào)控雄蟲振翅釋放信息素的行為有關(陳秀琳等, 2018)。CSPs基因最早在沙漠蝗Schistocercagregaria的觸角中發(fā)現(xiàn),它與OBPs在序列、結構等方面都存在明顯的差異(Angelietal., 1999)。研究發(fā)現(xiàn),CSPs在昆蟲體內(nèi)分布廣泛,在觸角、腿、翅膀、頭部、胸部和腹部等部位中均有表達(Picimbonetal., 2000; Picimbonetal., 2001; Zhangetal., 2021b)。CSPs是昆蟲化學接收系統(tǒng)中氣味的載體(Pelosietal., 2018),其功能多樣,如識別寄主植物的揮發(fā)物(Warisetal., 2020a; Zhangetal., 2021a),識別外界環(huán)境中大量的非揮發(fā)性物質(zhì)(王培丹等, 2014),部分CSPs參與性信息素的識別(Jacquin-Jolyetal., 2001),此外CSPs還具有調(diào)控昆蟲生長發(fā)育和生理節(jié)律等功能(李廣偉, 2016)。昆蟲的各種嗅覺蛋白協(xié)同合作,促使昆蟲在復雜的環(huán)境中能準確地進行化學識別,從而精準進行選擇寄主、產(chǎn)卵和交尾等行為。

基于桉蝙蛾幼蟲棲息地轉移及在混交林準確選擇桉樹危害的現(xiàn)象,推測桉蝙蛾3齡幼蟲地棲轉樹棲的過程中結合蛋白高量表達,并在寄主的嗅覺識別中發(fā)揮作用。本研究基于桉蝙蛾幼蟲轉錄組鑒定的結合蛋白(Zhangetal., 2021b),通過實時熒光定量PCR技術(qRT-PCR),測定結合蛋白在桉蝙蛾幼蟲4個齡期(3齡、5齡、9齡和12齡)和3個體段(頭部、胸部和腹部)中的表達情況,揭示結合蛋白的變化規(guī)律,同時基于其表達模式,闡明桉蝙蛾結合蛋白在不同齡期幼蟲中的表達與其寄主選擇行為的關系。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及樣品收集

2020年9月至2021年1月于廣西壯族自治區(qū)國有高峰林場長客分場(N22.907°, E108.266°)和軍山分場(N22.991°,E108.655°)的桉樹人工林中采集桉蝙蛾幼蟲,后帶回廣西大學林學院森林保護實驗室,參照楊秀好(2013)判斷齡期的方法和標準,選取活體3齡、5齡、9齡和12齡的桉蝙蛾幼蟲各3頭。將頭部直接剪下,用解剖剪沿腹部中線剪開幼蟲胸腹部表皮,用鑷子去除腸道及脂肪,再用剪刀將胸部和腹部分開,后用RNAfree ddH2O清洗,得到桉蝙蛾幼蟲頭部、胸部和腹部的樣品。4個齡期和3個體段的樣品均有3個生物學重復。所有的樣品置于2.0 mL離心管,后加入TRIzol(Invitrogen, USA)直接提取RNA。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

參照提取沙棘木蠹蛾RNA的方法(胡平, 2017),采用TRIzol并結合RNeasy Plus Mini Kit(No. 74134; Qiagen, Hilden, GER)的方法提取桉蝙蛾幼蟲不同齡期和體段的總RNA。利用SCANDROP 100(Analytik Jena AG, GER)檢測總RNA的質(zhì)量和濃度,所有樣品的OD260/OD280與OD260/OD230在1.8～2.1之間。按照反轉試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(TransGen Biotech)的步驟合成cDNA,將cDNA稀釋100倍作為模板備用。

1.3 實時熒光定量PCR

選取了桉蝙蛾幼蟲頭體轉錄組鑒定的嗅覺蛋白中的17個結合蛋白,基于其基因序列,設計實時熒光定量PCR引物(表1),內(nèi)參基因為甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)。qRT-PCR在熒光定量PCR儀LIGHT CYCLE 480II(Roche, SUI)上進行。反應所用的是20 μL體系:2×SYBR Green Fast qPCR Mix(ABclonal,CHN)10 μL,cDNA模板1 μL,正反引物(10 μmol/L)各0.4 μL,ddH2O 8.2 μL。反應程序:94℃預變性30 s,共45個循環(huán)的94℃ 5 s,60℃ 30 s;65℃到94℃每增加0.5℃保持5 s以記錄溶解曲線。每個樣品采用3個生物學重復和3個技術重復。Ct值通過LightCycler 480 Software release(version 1.5.1.62 SP3)軟件獲得。表達量采用2-ΔΔCt的方法計算(Livaketal., 2001),以EsigGOBP2在12齡幼蟲頭部的表達量作為數(shù)據(jù)分析中的對照樣品。

表1 實時熒光定量PCR的引物Table 1 Primers for real-time fluorescent quantitative PCR

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個基因在各個體段、齡期的表達量的顯著性分析采用單因素方差分析one-way nested analysis of variance(ANOVA)中的多重比較中的Tukey’s honestly significance difference(HSD)檢驗,分析軟件為SPSS 18.0(International Business Machines Corporation)。

2 結果與分析

2.1 EsigOBPs在桉蝙蛾幼蟲不同齡期、體段的表達

測定了12個EsigOBPs在桉蝙蛾幼蟲3體段和4齡期中的表達(圖1)。從最高表達量上看,前三的基因依次是EsigOBP5、EsigGOBP6和EsigOBP1(圖1),且EsigOBP5是在3齡幼蟲頭部中表達量最高的基因。具體來看,EsigOBP1在3齡幼蟲腹部顯著高表達,其次為3齡幼蟲胸部,且均顯著高于其他齡期和體段(P<0.05)。EsigOBP2在3齡幼蟲腹部的表達量顯著高于3齡頭部,且均顯著高于其他齡期和體段(P<0.05)。EsigOBP5的表達量在3齡幼蟲的腹部依次顯著高于3齡幼蟲的胸部和頭部,且3齡幼蟲在各體段的表達量均顯著高于其他齡期(P<0.05)。EsigOBP6在3齡和5齡幼蟲胸部的表達量顯著高于其他齡期和體段(P<0.05)。EsigOBP7在 12齡幼蟲腹部的表達量最高,顯著高于其他齡期和體段(P<0.05)。EsigOBP8和EsigGOBP2在3齡幼蟲頭部的表達量顯著高于其他齡期和體段(P<0.05)。EsigGOBP1依次在5齡幼蟲胸部和頭部以及9齡幼蟲頭部表達量最高,且相互差異顯著(P<0.05)。EsigGOBP3在3齡幼蟲胸部的表達量高于腹部,腹部高于頭部,且均顯著高于其他齡期和體段(P<0.05)。EsigGOBP4僅在5齡的頭腹部表達且腹部的表達量顯著高于頭部(P<0.05)。EsigGOBP6在3齡幼蟲胸部表達量高于3齡頭部,且均高于其他齡期的各體段(P<0.05)。EsigGOBP7在3齡幼蟲腹部的表達量顯著高于其他齡期和體段(P<0.05)(圖1)。綜合分析發(fā)現(xiàn),8個EsigOBPs的最高表達量均在3齡幼蟲的某個體段,3個EsigOBPs的最高表達量在 5齡幼蟲的某個體段;同時分別有4個和6個EsigOBPs在桉蝙蛾幼蟲胸部和腹部的表達量最高。

圖1 EsigOBPs在3體段和4齡期的表達譜Fig.1 Expression profile of EsigOBPs in four instar and three somite of Endoclita signifier larvae注:H,頭部;T,胸部;A,腹部。3rd,3齡幼蟲;5th,5齡幼蟲;9th,9齡幼蟲;12th,12齡幼蟲。誤差線為標準誤。誤差線上的不同小寫字母表示在0.05水平上顯著差異。下同。Note: H, Head; T, Thorax; A, Abdomen. 3rd, Third instar larvae; 5th, Fifth instar larvae; 9th, Ninth instar larvae; 12th, Twelfth instar larvae. Error bar represented the standard error. Different small letters on the error bar indicated significant differences at the 0.05 level. Same below

2.2 EsigCSPs在桉蝙蛾幼蟲不同齡期、不同體段的表達水平

測定了5個EsigCSPs在桉蝙蛾幼蟲3體段和4齡期中的表達(圖2)。EsigCSP1在3齡幼蟲腹部的表達量顯著高于3齡幼蟲頭部,且3齡幼蟲各體段的表達量均顯著高于其他齡期(P<0.05)。EsigCSP2在3齡幼蟲頭部中的表達量顯著高于其他齡期和體段(P<0.05)。

圖2 EsigCSPs在3體段和4齡期的表達譜Fig.2 Expression profile of EsigCSPs in four instar and three somite of Endoclita signifier larvae

EsigCSP4在3齡幼蟲腹部的表達量依次顯著高于胸部和其他齡期和體段(P<0.05)。EsigCSP5在3齡幼蟲腹部和12齡幼蟲胸部中的表達量顯著高于其他齡期和體段(P<0.05)。EsigCSP6在9齡幼蟲胸部中的表達量顯著高于其他齡期的各體段(P<0.05)(圖2)。綜合分析發(fā)現(xiàn),3個EsigCSPs的最高表達量均在3齡幼蟲的某個體段;同時各有2個EsigCSPs在桉蝙蛾幼蟲腹部和胸部的表達量最高。

3 結論與討論

桉蝙蛾是桉樹的重要蛀干害蟲,深入了解其嗅覺感受分子基礎,可為新型引誘劑或趨避劑的開發(fā)奠定理論基礎。幼蟲頭部是主要的嗅覺識別部位(Vogt, 2003),在桉蝙蛾幼蟲頭部中,氣味結合蛋白EsigOBP2、EsigOBP5、EsigOBP8、EsigGOBP2、EsigGOBP3和EsigGOBP6的表達量均在3齡幼蟲中顯著偏高(P<0.05),呈現(xiàn)出明顯的幼齡頭部的偏好性,且EsigOBP5是在3齡幼蟲頭部中表達量最高的基因。氣味結合蛋白在桉蝙蛾幼蟲頭部高量表達的結果與甜菜夜蛾Spodopteraexigua幼蟲(Liuetal., 2015)的結果一致,甜菜夜蛾OBP2主要表現(xiàn)出在幼蟲頭部偏向性表達。研究發(fā)現(xiàn),麗蚜小蜂Encarsiaformosa通過其OBPs識別番茄Lycopersiconesculentum植株(何艷艷, 2020),甜菜夜蛾S.exigua幼蟲的SexiOBP13在3齡幼蟲頭部表達量顯著高于4齡和5齡幼蟲,結合3齡幼蟲的高食量需求,推測SexiOBP13參與了幼蟲覓食的寄主識別過程(Jinetal., 2015)。值得注意的是,桉蝙蛾3齡幼蟲頭部偏好性的表達模式與桉蝙蛾3齡幼蟲地棲轉樹棲,需要識別環(huán)境中寄主揮發(fā)物的選擇行為相吻合(楊秀好, 2013),表明這些基因在棲息地轉移的寄主揮發(fā)物識別的過程中發(fā)揮重要的作用,推測EsigOBP2、EsigOBP5、EsigOBP8、EsigGOBP2、EsigGOBP3和EsigGOBP6是幼齡幼蟲參與寄主氣味識別最主要的蛋白,特別是表達量最高的EsigOBP5。此外,觸角是嗅覺識別的主要器官,研究發(fā)現(xiàn)S.littoralis的多個OBPs呈現(xiàn)幼蟲觸角的偏向性表達(Poivetetal., 2013),棉鈴蟲Helicoverpaarmigera多個OBPs也在幼蟲觸角表達(Changetal., 2017),免疫定位進一步發(fā)現(xiàn)小菜蛾Plutellaxylostella的2個GOBPs在幼蟲觸角的錐形感器中高表達(Zhuetal., 2016),基于前期研究的桉蝙蛾幼蟲觸角感器(胡平等, 2021),需進一步探究以上氣味識別的主要的蛋白,在桉蝙蛾幼蟲觸角上的表達情況,以進一步精確闡述其在桉蝙蛾幼蟲寄主選擇過程中具體的嗅覺功能。

EsigCSP1和EsigCSP2在3齡幼蟲頭部的表達量顯著高于其他齡期的頭部,幼蟲頭部是觸角著生部位,也是感覺中心,推測這些基因可能也主要行使桉蝙蛾幼蟲嗅覺識別功能。在粘蟲Mythimnaseparata(Younasetal., 2018)、禾谷縊管蚜Rhopalosiphumpadi(Pengetal., 2021)、稻褐飛虱Nilaparvatalugens(Warisetal., 2020b)和Bradysiaodoriphaga(Zhangetal., 2021)的研究均支持CSPs參與植物揮發(fā)物的識別;進一步研究發(fā)現(xiàn),與幼蟲口器相比,棉鈴蟲H.armigera幼蟲觸角表達更多的CSPs(Changetal., 2017)。所以在桉蝙蛾幼齡幼蟲頭部中高表達的2個EsigCSPs可能是重要的化學感受蛋白,在復雜的環(huán)境中,通過幫助幼蟲識別寄主揮發(fā)物而選擇寄主。

Klann等(2021)研究赤擬谷盜Triboliumcastaneum幼蟲胸部發(fā)現(xiàn)有錐形感器(化學感受器)和刺形感器(分為機械及味覺感受亞型)的分布,腹部有毛形感器(化學感受器)和刺形感器(機械及味覺感受亞型)的分布,胸腹部感受器的分布表明昆蟲的胸腹部可能有嗅覺感受的功能。在桉蝙蛾幼蟲中,在胸部和腹部分布著大量的刺形感器和Bohm’s鬃毛(胡平等, 2021),同時47.1%和35.3%的結合蛋白在桉蝙蛾幼蟲腹部和胸部的表達量最高,推測桉蝙蛾幼蟲的胸部和腹部,除了機械感受以外,也可能具有氣味感受的功能。此外結合蛋白在桉蝙蛾幼蟲腹部和胸部高表達,也可能表示該結合蛋白在幼蟲體內(nèi)行使非嗅覺功能,已有研究表明結合蛋白具有非嗅覺功能,如在意大利蜜蜂Apismelliferaligustica的研究中發(fā)現(xiàn),Amel-CSP6在蜜蜂工蜂的胸、腹部中的表達量高,其可能參與角質(zhì)層疏水碳氫化合物的運輸,從而使工蜂能識別蜂群中的同伴(Guetal., 2013);棉鈴蟲H.armigera和H.assulta的精液中含有豐富的OBP10,Rihani等(2021)推測該蛋白是產(chǎn)卵抑制劑的載體;此外,在棉鈴蟲H.armigera的眼中發(fā)現(xiàn)多種與視覺相關的OBPs,這可能與視覺色素的產(chǎn)生和運輸有關(Zhuetal., 2016)。所以這些在桉蝙蛾幼蟲胸腹部高量表達的結合蛋白的其他非嗅覺功能有待進一步研究。

絕大部分大豆蚜AglyOBPs在4齡若蟲的表達量最高,表明大豆蚜4齡若蟲是其對寄主植物的取食和搜索行為的調(diào)控表達的關鍵時期(Wangetal., 2021)。在桉蝙蛾中,8個EsigOBPs和3個EsigCSPs的最高表達部位均在3齡幼蟲的某個體段,3個EsigOBPs的最高表達部位在5齡幼蟲的某個體段,表明82.4%的結合蛋白在幼齡幼蟲(3齡和5齡)的某個體段表達量最高,結合蛋白在3齡幼蟲頭部的顯著高量表達與3齡幼蟲轉移棲息地和選擇寄主相一致,同時結合蛋白在幼齡幼蟲中的高量表達可能與選擇寄主后幼齡幼蟲對寄主揮發(fā)物的適應一致。且EsigOBP5、EsigOBP8、EsigGOBP3、EsigGOBP6和EsigCSP1在3齡幼蟲各體段中的表達量均高于其他齡期的各體段,推測其在3齡幼蟲寄主選擇中具有重要意義。

本研究探究了桉蝙蛾結合蛋白在幼蟲4個齡期和3個體段的表達模式,結果表明,在桉蝙蛾幼蟲頭部中EsigOBP2、EsigOBP5、EsigOBP8、EsigGOBP2、EsigGOBP3、EsigGOBP6、EsigCSP1和EsigCSP2具有3齡幼蟲頭部表達的偏好性,這與桉蝙蛾3齡幼蟲地棲轉樹棲的寄主選擇行為相適應,推測這些蛋白是參與桉蝙蛾幼蟲寄主識別最主要的蛋白;同時82.4%結合蛋白均在幼齡幼蟲(3齡和5齡)的某個體段表達量最高,這與3齡幼蟲寄主選擇以及選擇后幼齡幼蟲對寄主揮發(fā)物的適應相一致,該結果均支持桉蝙蛾幼齡幼蟲寄主選擇的推測,為探究桉蝙蛾幼蟲寄主識別的分子機制奠定了基礎。此外,根據(jù)本研究篩選出的主要結合蛋白,其具體的嗅覺功能需要結合分子生物學、化學生態(tài)學、免疫組織化學等多種手段,進行進一步驗證;而在桉蝙蛾幼蟲腹部和胸部高量表達的結合蛋白的功能也有待進一步研究。