趙藍(lán)青青,李哲,劉孜,李娜,李忠思,劉振華,熊輝

(1.承德醫(yī)學(xué)院河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,承德 067000;2.承德醫(yī)學(xué)院省神經(jīng)損傷與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,承德 067000;3.承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,承德 067000;4.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部,承德 067000)

當(dāng)歸芍藥散最早見(jiàn)于《金匱要略》,由川芎、當(dāng)歸、澤瀉、白術(shù)、芍藥、茯苓六味中藥組成[1],是中醫(yī)臨床治療痛經(jīng)的經(jīng)典名方。其藥理作用主要有改善內(nèi)分泌、抑制炎癥、調(diào)節(jié)平滑肌等,臨床中多用于治療原發(fā)性痛經(jīng)、慢性盆腔炎、老年癡呆癥、腎病綜合征等疾病[2]。諸多臨床應(yīng)用表明,當(dāng)歸芍藥散治療痛經(jīng)的療效明顯優(yōu)于布洛芬[3]、去氧孕烯炔雌醇[4]、阿司匹林[5]等西藥,且安全性高,未發(fā)現(xiàn)有明顯的毒副反應(yīng)。當(dāng)歸芍藥散作為多成分、多靶點(diǎn)共同發(fā)揮作用的中藥復(fù)方,治療原發(fā)性痛經(jīng)的藥效物質(zhì)及作用機(jī)制尚不完全明確。文獻(xiàn)[6-8]對(duì)當(dāng)歸芍藥散進(jìn)行了入血成分研究,發(fā)現(xiàn)茯苓酸、Z/E-丁烯基酞內(nèi)酯、澤瀉醇B、藁本內(nèi)酯、澤瀉醇A、洋川芎內(nèi)酯A、洋川芎內(nèi)酯I、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、阿魏酸及其代謝產(chǎn)物12個(gè)主要血中移行成分,為當(dāng)歸芍藥散的作用機(jī)制研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

中藥血清藥物化學(xué)研究表明,口服藥物發(fā)揮藥理作用必須依賴于進(jìn)入血液循環(huán)的藥效物質(zhì)[9],因此,以入血成分詮釋作用機(jī)制,得出的結(jié)果更加客觀、嚴(yán)謹(jǐn)。本研究針對(duì)篩選出的當(dāng)歸芍藥散12個(gè)入血成分,借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù),探究當(dāng)歸芍藥散治療原發(fā)性痛經(jīng)的可能機(jī)制,并驗(yàn)證當(dāng)歸芍藥散的有效性。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1當(dāng)歸芍藥散入血成分及潛在作用靶點(diǎn)篩選 在中國(guó)知網(wǎng)及PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行2012—2022年當(dāng)歸芍藥散組方入血成分的檢索。在PharmGkb、TTD及SwissTargetPrediction平臺(tái)查找其潛在作用靶標(biāo)。

1.1.2原發(fā)性痛經(jīng)相關(guān)基因靶點(diǎn)篩選 采用OMIM(http://www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選并確定原發(fā)性痛經(jīng)的相關(guān)基因靶點(diǎn),關(guān)鍵詞為“Primary Dysmenorrhea”。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性SD大鼠40只,體質(zhì)量(200±20) g,購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào):SCXK(京)2019-0008。大鼠適應(yīng)環(huán)境1周。所有實(shí)驗(yàn)按照承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心福利和倫理原則操作。

1.1.4材料與設(shè)備 當(dāng)歸飲片(批號(hào):C25292012008)、川芎飲片(批號(hào):C2472012004)、澤瀉飲片(批號(hào):C386-20212002)、白術(shù)飲片(批號(hào):C2242012003)、白芍飲片(批號(hào):C2232012004)、茯苓飲片(批號(hào):C045210-4001),均購(gòu)于河北蓮花池藥業(yè)有限公司,由承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所趙春穎教授鑒定為正品。苯甲酸雌二醇注射液(4 mg·L-1,批號(hào):210214);縮宮素注射液(10 U·mL-1,批號(hào):210201),均購(gòu)于上海全宇生物科技動(dòng)物藥業(yè)有限公司。布洛芬片(赤峰蒙欣藥業(yè)有限公司,批號(hào):2102019)。HZT-A1000型電子天平(美國(guó)康州電子秤科技有限公司,感量:0.01 g)、星海旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(無(wú)錫市星海生化設(shè)備有限公司)、SOIENTZ-18N型冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2方法

1.2.1入血成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用R語(yǔ)言得到12種入血成分及篩選所得的原發(fā)性痛經(jīng)疾病靶點(diǎn)的交集基因,通過(guò)Cytoscape3.6.1版軟件完成入血成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析。

1.2.2靶點(diǎn)生物過(guò)程與代謝通路分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)研究基因本體(Gene Ontology,GO)生物學(xué)過(guò)程和京都基因與基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and gnomes,KEGG)信號(hào)通路分析,預(yù)測(cè)其治療原發(fā)性痛經(jīng)的主要機(jī)制,并將P值排序前二十的結(jié)果做氣泡圖進(jìn)行可視化。

1.2.3分子對(duì)接 利用篩選出的復(fù)方關(guān)鍵成分和核心靶蛋白,采用AutoDock Vina 1.2.3版軟件進(jìn)行分子對(duì)接,最后將結(jié)合活性較強(qiáng)的結(jié)果利用PyMOL 2.4版軟件繪制三維圖進(jìn)行可視化展示。

1.2.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)當(dāng)歸芍藥散治療原發(fā)性痛經(jīng)的有效性

①藥物制備 當(dāng)歸芍藥散灌胃液:稱取飲片當(dāng)歸3 g、川芎8 g、澤瀉8 g、茯苓4 g、白術(shù)4 g、芍藥16 g,粉碎至50目篩,置于1000 mL圓底燒瓶加入10倍量50%乙醇浸泡60 min,加熱回流2 h,藥液經(jīng)濾紙濾過(guò);加入8倍量50%乙醇加熱回流1.5 h。合并2次濾液,再次過(guò)濾,減壓濃縮至無(wú)醇味,-40 ℃預(yù)凍后用冷凍干燥法制成疏松粉末,即當(dāng)歸芍藥散凍干粉,以蒸餾水配置成濃度為0.33 g·mL-1的混懸液備用。布洛芬灌胃液:布洛芬片研至粉末狀,以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配置成濃度為0.005 4 g·mL-1的混懸液備用。

②原發(fā)性痛經(jīng)模型的復(fù)制 40只SD雌性大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、原發(fā)性痛經(jīng)模型組、陽(yáng)性藥組和當(dāng)歸芍藥散組4組,每組10只。

造模方法參考文獻(xiàn)[10],模型組、陽(yáng)性藥組與當(dāng)歸芍藥散組皮下注射苯甲酸雌二醇10 d(第1、第10天,1 mg·kg-1;第2—9 天,0.5 mg·kg-1),第10天給藥30 min后,給予縮宮素25 U·mL-1腹腔注射,對(duì)照組注射同等劑量的0.9%氯化鈉溶液。造模后大鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)且次數(shù)顯著增多,即為模型復(fù)制成功。當(dāng)歸芍藥散組以劑量10 mL·kg-1灌胃當(dāng)歸芍藥散混懸液10 d,每天1次;陽(yáng)性藥組以劑量10 mL·kg-1灌胃布洛芬混懸液10 d,每天1次;對(duì)照組及模型組灌胃給予純化水。末次給藥60 min后,各組大鼠充分麻醉暴露腹腔,收集子宮組織,以10%甲醛溶液固定。

③當(dāng)歸芍藥散有效性評(píng)價(jià) 觀察并記錄各組大鼠注射縮宮素后30 min內(nèi)的扭體次數(shù)。造模及給藥期間對(duì)各組大鼠進(jìn)行體質(zhì)量監(jiān)測(cè),并觀察一般體征。

子宮組織置于10%甲醛溶液固定24 h以上,石蠟包埋,切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,進(jìn)行鏡檢觀察。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0版軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,多組比較采用單因素方差分析,以GraphPad Prism 8.0作圖,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1入血成分與原發(fā)性痛經(jīng)靶點(diǎn)收集 當(dāng)歸芍藥散中入血成分12個(gè)[6-8],其中當(dāng)歸中5個(gè),川芎中7個(gè),白芍中2個(gè),澤瀉中2個(gè),茯苓中1個(gè),白術(shù)中未發(fā)現(xiàn)入血成分,入血成分靶點(diǎn)296個(gè),入血成分信息見(jiàn)表1。以“Primary Dysmenorrhea”為關(guān)鍵詞,從OMIM及GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出疾病靶點(diǎn)共517個(gè),取交集得到入血成分與原發(fā)性痛經(jīng)的靶點(diǎn)26個(gè),見(jiàn)圖1。

圖1 藥物與疾病的交集基因

表1 入血成分的基本信息

2.2入血成分-原發(fā)性痛經(jīng)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 運(yùn)用Cytoscape3.6.1版軟件,以入血成分與疾病靶點(diǎn)構(gòu)建“當(dāng)歸芍藥散入血成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”,可視化分析得531個(gè)節(jié)點(diǎn),577條邊,連線表示入血成分與疾病靶點(diǎn)之間的相互作用,見(jiàn)圖2。

藍(lán)色橢圓形代表入血成分;黃色方形代表入血成分與疾病交集靶點(diǎn);紫色菱形代表疾病基因。

2.3PPI網(wǎng)絡(luò) 通過(guò)STRING網(wǎng)站對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)分析,見(jiàn)圖3,利用Cytoscape3.6.1版軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析,度值越大,節(jié)點(diǎn)的顏色越深、圖形越大;兩點(diǎn)間連線越粗,節(jié)點(diǎn)間相互作用越強(qiáng)。其中核心靶點(diǎn)有VEGFA、腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6、ESR1、PTGS2等。

圖3 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.4GO和KEGG通路富集分析 GO富集分析得1603個(gè)富集條目(P<0.05),其中生物過(guò)程主要富集在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)內(nèi)皮屏障、參與類固醇激素代謝、增強(qiáng)配體-受體活性、調(diào)節(jié)應(yīng)答神經(jīng)應(yīng)激反應(yīng)等方面,排名前十的富集結(jié)果見(jiàn)圖4。篩選出68條信號(hào)通路(P<0.05),主要涉及IL-17、腫瘤壞死因子、MAPK、花生四烯酸代謝、雌激素等信號(hào)通路。KEGG分析排名前二十的條目見(jiàn)圖5,所得氣泡圖中圖形越大、顏色越綠,說(shuō)明P值越小,富集越顯著。

圖4 GO富集分析

圖5 KEGG 信號(hào)通路(前20條)富集分析

2.5分子對(duì)接 將入血成分-疾病網(wǎng)絡(luò)篩出的關(guān)鍵成分與度值排名靠前的靶蛋白分子對(duì)接,結(jié)果顯示結(jié)合能均為負(fù)值,數(shù)值越小表明二者之間親和力越高,見(jiàn)表2。可視化分析發(fā)現(xiàn),Z-丁烯基酞內(nèi)酯、芍藥內(nèi)酯苷、洋川芎內(nèi)酯I三個(gè)關(guān)鍵成分與各蛋白結(jié)合能力較強(qiáng),各成分均與PTGS2結(jié)合能力最強(qiáng),見(jiàn)圖6。

圖6 關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)蛋白PTGS2對(duì)接

表2 關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接評(píng)分表

2.6當(dāng)歸芍藥散有效性評(píng)價(jià) 注射縮宮素后30 min內(nèi)模型組、陽(yáng)性藥組及當(dāng)歸芍藥散組的扭體次數(shù)均顯著高于對(duì)照組(0次)(P<0.01),模型復(fù)制成功;當(dāng)歸芍藥散組及陽(yáng)性藥組扭體次數(shù)分別為(10.67±6.54)和(11.50±7.81)次,均顯著少于模型組(27.8±11.19)次(P<0.01)。造模給藥的10 d內(nèi)模型組體質(zhì)量較對(duì)照組增長(zhǎng)緩慢,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),給藥結(jié)束后當(dāng)歸芍藥散組與模型組間體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖7-A及圖7-B。組織病理學(xué)分析,模型組較對(duì)照組出現(xiàn)嚴(yán)重子宮內(nèi)膜剝脫及水腫;當(dāng)歸芍藥散組及陽(yáng)性藥組較模型組子宮內(nèi)膜剝脫及水腫程度明顯減輕,見(jiàn)圖8。綜上,當(dāng)歸芍藥散可改善由苯甲酸雌二醇聯(lián)合縮宮素誘導(dǎo)的原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠痛經(jīng)反應(yīng)。

①與對(duì)照組比較,P<0.01;②與模型組比較,P<0.05。

圖8 4組大鼠子宮組織病理變化(×200)

3 討論

原發(fā)性痛經(jīng)(primary dysmenorrhea,PD)是生殖器官無(wú)器質(zhì)性病變引起的痛經(jīng),主要癥狀包括下腹部痙攣性疼痛,伴有惡心、嘔吐、腹瀉、頭暈等表現(xiàn)[11]。西醫(yī)認(rèn)為PD的病因可能與前列腺素、縮宮素、血管加壓素、神經(jīng)遞質(zhì)、遺傳及心理等多種因素關(guān)系密切[12],常用治療藥物有解熱鎮(zhèn)痛類、激素類及非甾體抗炎藥物,雖然療效確切,但是易引起眩暈、頭痛、胃腸道不良反應(yīng)及產(chǎn)生耐藥性[13]。當(dāng)歸芍藥散作為中醫(yī)治療痛經(jīng)的經(jīng)典名方,已被制成顆粒劑廣泛用于脾虛、肝郁、血虛等痛經(jīng)的治療。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,當(dāng)歸芍藥散可顯著減少PD模型大鼠的扭體次數(shù)和改善大鼠子宮內(nèi)膜剝脫及水腫情況,為臨床應(yīng)用有效性提供佐證,當(dāng)歸芍藥散的潛在作用機(jī)制值得深入研究。

本研究明確了當(dāng)歸芍藥散12個(gè)入血成分治療原發(fā)性痛經(jīng)的26個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn),通過(guò)分子對(duì)接篩選出洋川芎內(nèi)酯I、Z-丁烯基酞內(nèi)酯、芍芍藥內(nèi)酯苷3個(gè)與PD關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合較強(qiáng)的入血成分,可初步認(rèn)為是當(dāng)歸芍藥散治療PD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。3種活性成分可通過(guò)下調(diào)炎癥因子表達(dá)水平、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞的周期性進(jìn)程等方式發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激及保護(hù)血管等多重藥理作用[14-16]。關(guān)鍵靶點(diǎn)TNF可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,對(duì)B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞的發(fā)育有突出作用[17];IL-6對(duì)子宮有收縮作用,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致子宮上皮局部組織缺血缺氧引發(fā)痛經(jīng)[18];VEGFA促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng),擴(kuò)張血管,增加血管通透性[19];ESR1刺激血清中肥大細(xì)胞釋放疼痛物質(zhì)而產(chǎn)生痛經(jīng)[20];PTGS2促進(jìn)前列腺素的合成,造成平滑肌痙攣性收縮導(dǎo)致痛經(jīng)[21]。

KEGG通路主要富集在IL-17、TNF、MAPK、花生四烯酸代謝、雌激素、卵巢類固醇生成等信號(hào)通路,關(guān)鍵靶點(diǎn)中的TNF、IL-6、IL-1β、PTGS2等均在IL-17信號(hào)通路及TNF信號(hào)通路上有所富集。IL-17通路可抑制炎癥因子、趨化因子的產(chǎn)生,緩解炎癥,文獻(xiàn)中缺乏IL-17基因的小鼠對(duì)各種病原菌的易感性顯著增高,死亡風(fēng)險(xiǎn)增加[22-23]。TNF-α作為腫瘤壞死因子的一種亞型,促進(jìn)IL-1、IL-6和IL-8等炎癥介質(zhì)的釋放,參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控[24]。MAPK信號(hào)通路[25-26]與炎癥、腫瘤等疾病關(guān)系密切,MAP激酶對(duì)多種炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用。綜上,當(dāng)歸芍藥散對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)的治療作用,主要通過(guò)作用于關(guān)鍵靶點(diǎn),調(diào)控激素效應(yīng)、調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá),抑制子宮的炎癥反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

本研究基于當(dāng)歸芍藥散的入血成分,通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接技術(shù)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)三種策略,分析其治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用靶點(diǎn)、生物過(guò)程、信號(hào)通路及有效性,為今后全面認(rèn)識(shí)當(dāng)歸芍藥散的藥理作用及臨床價(jià)值提供思路與線索。