黃平倩， 汪帆， 魯航， 榮鵬， 肖祥寅， 張方， 黃松， 吳孝兵， 李冰欣 ， 陳進民

（安徽師范大學生命科學學院，重要生物資源保護與利用研究安徽省重點實驗室，安徽 蕪湖 241000）

肥螈屬PachytritonBoulenger， 1878 隸屬兩棲綱Amphibian有尾目Caudata蠑螈科Salamandridae，是中國的特有類群，主要分布于我國長江以南的亞熱帶地區(qū)，包括浙江、江西、福建、安徽、湖南、廣東、廣西和貴州等，棲息于山區(qū)森林溪流中（中國兩棲類，2022）。目前，肥螈屬已知10 種，除秉志肥螈P. granulosus和黑斑肥螈P. brevipes外，其他8 種均為近10 余年發(fā)表的新物種（Liet al.，2018；Frost，2022；中國兩棲類，2022）。

安徽省的肥螈屬目前已知費氏肥螈P. feii1種（Frost，2022；中國兩棲類，2022），其是2011 年根據(jù)安徽黃山標本命名的新物種，目前分布于安徽南部及其相鄰的江西東北部地區(qū)（Nishikawaet al.，2011；Wu & Murphy，2015）。本研究在安徽省黃山市休寧縣馬金嶺自然保護區(qū)發(fā)現(xiàn)秉志肥螈，為安徽省兩棲類新記錄，此次發(fā)現(xiàn)為進一步探討肥螈屬同域物種分化提供了素材。此外，本研究將秉志肥螈的分布區(qū)域拓展至白際山脈，為肥螈屬的生物地理學研究提供了基礎資料，對皖南及其周邊地區(qū)生物區(qū)系與地質(zhì)史研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

6 號肥螈標本（3♂3♀）于2022 年7—8 月采自安徽省黃山市休寧縣馬金嶺自然保護區(qū)（118°18′28.42″E，29°31′56.33″N，海拔445 m）。經(jīng)安樂死后，取肝臟組織保存于95%乙醇溶液中；整體標本以10%甲醛溶液固定后，清水沖洗，75%乙醇溶液保存。標本及組織樣品現(xiàn)均保存于安徽師范大學（ANU）。

1.2 形態(tài)鑒定與測量

形態(tài)測量指標和外部形態(tài)描述主要參考費梁等（2012）、Wu 等（2012）、Yuan 等（2016）、Li 等（2018）的方法。用電子游標卡尺測量標本的24個形態(tài)指標（精度0.1 mm）：頭體長、尾長、頭長、頭寬、頭高、吻長、眼徑、眼間距、鼻眼距、鼻間距、肩寬、前肢長、后肢長、尾寬、尾高、第一指長、第二指長、第三指長、第四指長、第一趾長、第二趾長、第三趾長、第四趾長和第五趾長。

1.3 DNA提取、擴增及測序

使用常規(guī)酚/氯仿抽提法（Sambrooket al.，1989）提取樣品基因組DNA 后，?20 ℃保存?zhèn)溆?。參照Wu 等（2010）的方法進行cyt b基因片段的PCR 擴增和測序。PCR 反應體系為25 μL，反應程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送安徽通用有限公司雙向測序。

1.4 分子系統(tǒng)發(fā)育研究

使用DNASTAR LASERGENE 7.0（Burland，2000）的SeqMan 對測序獲得的雙向序列峰圖進行正反鏈互補和人工校對。將獲得的新序列在Gen?Bank上進行BLAST 分析，然后搜索序列同源性，確保新獲得的序列是目標DNA 片段。確認后在Gen?Bank 中下載肥螈屬所有物種cyt b基因的代表序列，并以東方蠑螈Cynops orientalis和棕黑疣螈Tylototriton verrucosus為外群（表1），使用MEGA 7（Kumaret al.，2016）比對序列。使用貝葉斯法（BI 法）和最大似然法（ML 法）同時構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用JModelTest 0.1.1（Posada，2008）基于AIC標準選擇最適核苷酸替代模型。運用MRBAYES 3.2（Ronquist & Huelsenbeck，2003）構(gòu)建BI 系統(tǒng)發(fā)育樹，共運行2 000 萬代，每1 000 代進行1 次抽樣。通過Tracer 1.7（Rambautet al.，2018）中的有效樣本量判斷結(jié)果是否收斂?；谑諗康那闆r，舍棄前25% 代數(shù)。運用RaxML（Stamatakis & Hoover，2008）構(gòu)建ML 系統(tǒng)發(fā)育樹，進行1 000 bootstrap 重抽樣分析。肥螈屬物種間的遺傳距離采用MEGA 7基于P-distances距離模型進行計算。

表1 樣品信息表Table 1 Information of samples used in this study

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)描述

標本經(jīng)形態(tài)測量（表2）和檢視，均符合秉志肥螈的鑒定特征。體型肥壯；頭呈橢圓形、扁平，側(cè)面無棱脊，頭寬小于頭長；吻部較長，端圓；鼻孔小且距離吻端極近，吻長大于鼻間距、鼻眼距；咽喉部有縱褶膚，頸部有明顯的褶皺；唇褶發(fā)達，上下頷有細齒，犁骨齒列呈“Λ”形，枕部有“V”形隆起，但不明顯。皮膚光滑，軀干至尾基部呈圓柱狀；背腹略扁平，脊背部位沒有隆起而略成縱溝；肋溝11 條左右，部分個體身體兩側(cè)有細的橫皺紋，腹部有橫皺溝。

表2 安徽馬金嶺自然保護區(qū)的秉志肥螈標本的形態(tài)量度Table 2 Measurements of Pachytriton granulosus collected from the Majinling Nature Reserve， Anhui

頭體、四肢背面褐色，無黑色斑點；頭體腹面橘紅色，有少數(shù)不規(guī)則的褐色短紋或呈蠕蟲狀斑；四肢腹面、肛孔，以及尾巴下緣、尾巴腹面橘紅色（圖1）。尾基部寬厚，后半段逐漸側(cè)扁，末端呈鈍圓狀，尾部有細的橫皺紋，尾背鰭褶達體背前方；雄性肛部有明顯隆起，肛孔縱長，內(nèi)壁有乳突；雌性肛部隆起不顯著，肛孔較短，內(nèi)壁無乳突。四肢粗短，前肢比后肢短且細。指長順序為3>2>4>1，第一指較其他指短??；趾長順序為3>4>2>5>1，第一趾和第五趾較其他趾短小；指趾末端均具緣膜，無角質(zhì)鞘（圖2）。

圖1 安徽馬金嶺自然保護區(qū)的秉志肥螈活體照Fig. 1 Pachytriton granulosus from Majinling Nature Reserve， Anhui

圖2 安徽馬金嶺自然保護區(qū)的秉志肥螈手（a、 c）與足（b、 d）形態(tài)（標本號：ANU000501）Fig. 2 Hand （a， c） and foot （b， d） of Pachytriton granulosus （voucher No. ANU000501）from the Majinling Nature Reserve， Anhui

2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

cyt b基因序列長1 107 bp?；贐I法和ML法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹拓撲結(jié)構(gòu)基本一致（圖3）。本次采自安徽省黃山市休寧縣馬金嶺自然保護區(qū)的6號標本屬于同一個譜系，與秉志肥螈的樣本聚為一支，且得到支持（BPP>95%；BS>70%），該譜系還包括浙江安吉龍王山、浙江臺州市天臺山、浙江寧海西天目山和浙江淳安金紫尖種群。此外，基于P?distance距離模型計算的肥螈屬的遺傳距離顯示，采自安徽黃山馬金嶺自然保護區(qū)的肥螈標本與秉志肥螈的遺傳距離最近，與來自浙江寧海西天目山的遺傳距離只有0.1%（表3），分子系統(tǒng)學結(jié)果支持采自安徽省黃山市休寧縣馬金嶺自然保護區(qū)的6號標本均為秉志肥螈。

圖3 基于線粒體cyt b基因序列構(gòu)建的肥螈屬貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Bayesian inference phylogenetic tree of the genus Pachytriton based on mitochondrial cyt b gene

表3 基于線粒體cyt b基因的肥螈屬物種間遺傳距離Table 3 Genetic distance among Pachytriton species based on mitochondrial cyt b gene

2.3 生境描述

本次采集到的秉志肥螈標本分布在安徽省黃山市休寧縣馬金嶺自然保護區(qū)海拔445 m 瀑布下的深水潭里。深潭水流較緩，水質(zhì)清澈見底，水底多為落葉、石塊、泥沙等。水潭分布有小魚、水生無脊椎動物等小型動物。與其同域分布的兩棲類有棘胸蛙Quasipaa spinosa、黃山角蟾Boulenophrys huangshanensis、天目臭蛙Odorrana tianmuii等。植被和水體均保存較好，人為破壞程度較小。

3 討論

本文結(jié)合形態(tài)和分子證據(jù)揭示了安徽省兩棲類新記錄種：秉志肥螈，加上之前記錄的費氏肥螈，目前安徽省記錄有2 種肥螈屬物種。形態(tài)上，費氏肥螈和秉志肥螈的主要區(qū)別在體長、腹面顏色和斑紋等（Nishikawaet al.，2011；費梁等，2012）。在分子系統(tǒng)發(fā)育上，秉志肥螈與費氏肥螈存在明顯的遺傳分化，證實了其形態(tài)學的鑒定。

本研究提示肥螈屬的物種分布格局值得進一步研究，安徽省肥螈屬物種的分布情況有待厘清。秉志肥螈和費氏肥螈可能存在同域共存現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，秉志肥螈分布區(qū)之前記錄的是費氏肥螈（Wu & Murphy，2015；中國兩棲類，2022），這2個物種對棲息環(huán)境需求相似，是否存在同域物種分化及其進化機制是未來的研究方向。

本次發(fā)現(xiàn)將秉志肥螈的分布區(qū)域拓展至白際山脈，為肥螈屬的生物地理學研究提供了重要基礎資料。秉志肥螈歷史記錄分布于浙江和福建山區(qū)（費梁等，2012；Wu & Murphy，2015）。肥螈屬的物種分布格局與山脈水系變遷有著緊密的聯(lián)系，本發(fā)現(xiàn)對于皖南及其周邊地區(qū)生物區(qū)系與地質(zhì)史研究具有重要意義。