李若曼，林錫澤，葉海驥，鄭慧珍

·藥物研究·

普濟(jì)消毒飲抑制慢性化膿性中耳炎炎癥反應(yīng)

李若曼1，林錫澤2，葉海驥3，鄭慧珍2

1.溫州市第七人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，浙江溫州 325000；2.溫州市人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，浙江溫州 325006；3.文成縣人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，浙江文成 325300

探討普濟(jì)消毒飲抑制慢性化膿性中耳炎炎癥反應(yīng)的作用。采用經(jīng)鼓膜穿刺途徑向鼓室注射銅綠假單胞菌的方法構(gòu)建慢性化膿性中耳炎小鼠模型。建模成功后，左氧氟沙星組小鼠給予1mg/（kg·d）左氧氟沙星灌胃，普濟(jì)消毒飲低、中、高劑量組小鼠分別給予2.9g/（kg·d）、5.8g/（kg·d）、11.6g/（kg·d）普濟(jì)消毒飲濃縮液灌胃，模型組和對(duì)照組小鼠均予以等量生理鹽水灌胃，每日1次，持續(xù)14d。左氧氟沙星和普濟(jì)消毒飲低、中、高劑量均可減輕中耳黏膜組織病變；與模型組比較，左氧氟沙星組和普濟(jì)消毒飲低、中、高劑量組小鼠的血清腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、γ干擾素水平降低（<0.05），Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、髓樣分化蛋白88（myeloid differentiation protein 88，MYD88）、核因子-κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）基因表達(dá)和蛋白水平及磷酸化NF-κB p65降低（<0.05），上述指標(biāo)均呈劑量依賴(lài)性。普濟(jì)消毒飲可抑制慢性化膿性中耳炎炎癥反應(yīng)，可能與抑制TLR4/MYD88/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。

普濟(jì)消毒飲；慢性化膿性中耳炎；Toll樣受體4；炎癥反應(yīng)

慢性化膿性中耳炎是指微生物感染中耳黏膜、骨膜、骨質(zhì)后引起的慢性化膿性炎癥反應(yīng)，是耳鼻喉科最常見(jiàn)的感染性疾病。慢性化膿性中耳炎多發(fā)于青少年，據(jù)統(tǒng)計(jì)該病在青少年中的發(fā)病率為0.2%[1]。目前，臨床常采用藥物抗感染治療和手術(shù)治療，盡管有一定療效，但多數(shù)患者病情遷延不愈[2]。中醫(yī)認(rèn)為慢性化膿性中耳炎屬“膿耳”范疇[3]。普濟(jì)消毒飲出自《東垣試效方》，主要有清熱解毒、疏風(fēng)散邪的功效，已有報(bào)道表明普濟(jì)消毒飲可改善慢性化膿性中耳炎機(jī)體炎癥反應(yīng)[4]。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）能夠識(shí)別病原體相關(guān)分子模式，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)過(guò)程，TLR4信號(hào)通路激活可參與慢性化膿性中耳炎的炎癥反應(yīng)[5]。本研究探討普濟(jì)消毒飲介導(dǎo)TLR4信號(hào)通路調(diào)控慢性化膿性中耳炎炎癥反應(yīng)的作用與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與菌株 60只C57BL/6J健康小鼠，無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)，6～8周齡，雌雄各半，體質(zhì)量18～22g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)[許可證號(hào)：SCXK（粵）2021-0041，使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2021-0167]。銅綠假單胞菌菌株（編號(hào)BMZ134736）購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。接種前12h制備成濃度1×106CFU/ml菌液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩１狙芯拷?jīng)溫州市第七人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：202004-007）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥材與試劑 中藥材（均購(gòu)自錄建藥業(yè)）；鹽酸左氧氟沙星（購(gòu)自浙江京新藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：14202451919）；蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，HE染色）試劑盒（購(gòu)自上海懋康生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：MM1013）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β和γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自上海極威生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：JW-E12364、JW-E12359、JW-E12353、JW-E12363）；TLR4、髓樣分化蛋白88（myeloid differentiation protein 88，MYD88）、核因子κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物（由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成）；兔抗鼠TLR4、MYD88、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（phosphorylation NF-κB p65，p-NF-κB p65）、GAPDH單克隆抗體（一抗）、羊抗兔TLR4、MYD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65、GAPDH辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記多克隆抗體（二抗）（購(gòu)自賽默飛，生產(chǎn)批號(hào)：2219S、ab135693、69994、3033、2188；31462、A16124、A16116、A16096、A16104）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 JS-750T型光學(xué)顯微鏡（購(gòu)自德國(guó)LIOO）；FC型酶標(biāo)儀（購(gòu)自賽默飛）；H1650R型高速冷凍離心機(jī)（購(gòu)自上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；7500型PCR儀（購(gòu)自美國(guó)ABI）；PowerPacUniversal型電泳儀（購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)）。

1.2 方法

1.2.1 普濟(jì)消毒飲制備 普濟(jì)消毒飲組方藥材：黃芩15g、黃連15g、陳皮6g、生甘草6g、玄參6g、柴胡6g、桔梗6g、連翹3g、板藍(lán)根3g、馬勃3g、牛蒡子3g、薄荷3g、僵蠶2g、升麻2g，加水常規(guī)煎煮2次，去除藥物殘?jiān)?，濃縮為1g/ml生藥[6]。

1.2.2 構(gòu)建模型及驗(yàn)證 將60只C57BL/6J小鼠分為對(duì)照組（10只）和建模組（50只）。根據(jù)既往研究采用經(jīng)鼓膜穿刺途徑[7]構(gòu)建慢性化膿性中耳炎小鼠模型。建模組小鼠麻醉后，雙側(cè)外耳道消毒；使用無(wú)菌注射器接半腰椎穿刺針，經(jīng)鼓膜緊張部后下象限穿刺，向小鼠雙側(cè)耳鼓室注射1×106CFU/ml銅綠假單胞菌菌液100μl，每3d注射1次，共注射3次。HE染色觀察小鼠中耳黏膜組織病理切片，取對(duì)照組和建模組小鼠雙側(cè)中耳黏膜組織，常規(guī)石蠟包埋切片（4μm）；脫蠟脫水及水化，蘇木精染色5min；伊紅染色1min，脫透明，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察建模組中耳黏膜組織較對(duì)照組增厚，且炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)，證明造模成功[8]。

1.2.3 分組及給藥方法 將造模成功小鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分組，左氧氟沙星組（10只）給予1mg/（kg·d）左氧氟沙星灌胃，普濟(jì)消毒飲低、中、高劑量組（各10只）分別給予2.9g/（kg·d）、5.8g/（kg·d）、11.6g/（kg·d）普濟(jì)消毒飲濃縮液灌胃；模型組（9只）和對(duì)照組（9只）均予以等量生理鹽水灌胃，每日1次，持續(xù)14d。

1.2.4 血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平檢測(cè) 給藥結(jié)束后24h，脫頸處死各組小鼠，取腹主動(dòng)脈血1.5ml，靜置30min分離獲取血清，根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)各組小鼠的血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平。

1.2.5 中耳黏膜組織病理觀察 給藥結(jié)束后24h，取左耳中耳黏膜組織，常規(guī)石蠟包埋切片（4μm），HE染色同上；光學(xué)顯微鏡觀察各組中耳黏膜組織病理切片。

1.2.6 TLR4、MYD88、NF-κB p65基因表達(dá)檢測(cè) 給藥結(jié)束后24h，取各組小鼠右耳1/2中耳黏膜組織，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸，PCR引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95℃ 5min；94℃ 15s，55℃ 30s，70℃ 30s，40個(gè)循環(huán)。以2–ΔΔCt[9]表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 TLR4、MYD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)及p-NF-κB p65水平檢測(cè) 給藥結(jié)束后24h，取右耳剩余1/2中耳黏膜組織，加入裂解液，4℃ 12 000轉(zhuǎn)/min（有效離心半徑7.1cm）離心10min，收集上清即為總蛋白；BCA法檢測(cè)蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度為5μg/μl；上樣6μl，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加一抗（稀釋比例1∶500）4℃孵育過(guò)夜，洗滌，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（稀釋比例1∶2000），室溫孵育1h，洗滌，顯色5min，使用Image J分析蛋白條帶灰度值。

表1 PCR所需引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 建模結(jié)果

對(duì)照組小鼠的中耳黏膜組織無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；建模組小鼠的中耳黏膜組織可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1。

2.2 各組小鼠中耳黏膜組織病理切片

對(duì)照組小鼠中耳黏膜組織正常，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠中耳黏膜增厚，可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；左氧氟沙星組和普濟(jì)消毒飲低劑量組小鼠中耳黏膜增厚程度減弱，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少；普濟(jì)消毒飲中劑量組小鼠黏膜增厚程度進(jìn)一步減弱，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)一步減少；普濟(jì)消毒飲高劑量組小鼠中耳黏膜增厚及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)基本消失，見(jiàn)圖2。

2.3 各組小鼠的血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平比較

與對(duì)照組比較，模型組小鼠的血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平上升（<0.05）；與模型組比較，左氧氟沙星組和普濟(jì)消毒飲低、中、高劑量組小鼠的血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平降低（<0.05），且呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)表2。

圖1 小鼠中耳黏膜組織HE染色結(jié)果（×200，刻度尺：30μm）

圖2 各組小鼠中耳黏膜組織HE染色結(jié)果（×20，刻度尺：20μm）

2.4 各組小鼠的TLR4、MYD88、NF-κB p65基因表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，模型組小鼠的TLR4、MYD88、NF-κB p65基因表達(dá)上調(diào)（<0.05）；與模型組比較，左氧氟沙星組和普濟(jì)消毒飲低、中、高劑量組小鼠的TLR4、MYD88、NF-κB p65基因表達(dá)下調(diào)（<0.05），且呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)表3。

2.5 各組小鼠的TLR4、MYD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)及p-NF-κB p65水平比較

與對(duì)照組比較，模型組小鼠的TLR4、MYD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)及p-NF-κB p65水平增加（<0.05）；與模型組比較，左氧氟沙星組和普濟(jì)消毒飲低、中、高劑量組小鼠的TLR4、MYD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)及p-NF-κB p65水平下降（<0.05），且呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)圖3、表4。

3 討論

慢性化膿性中耳炎屬中醫(yī)學(xué)“膿耳”范疇?！吨T病源候論·卷四十八》云：“耳，宗脈之所聚，腎氣之所通。小兒腎臟盛，而有熱者，熱氣上沖于耳，津液壅結(jié)，即生膿汁?！倍鸀槟I竅，腎之精氣虧虛，寒熱之氣循經(jīng)上犯耳竅，津液困結(jié)而成膿耳。又如《丹溪心法·卷四》云：“熱氣乘虛隨脈入耳，聚熱不散，膿汁出，為之膿耳?！蓖飧酗L(fēng)熱，上壅清竅，可致耳中流膿；故治療上以祛除風(fēng)熱邪毒、補(bǔ)益正氣、宣通臟腑為主要原則。

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平（，pg/ml）

注：與對(duì)照組比較，*<0.05；與模型組比較，#<0.05；與左氧氟沙星組比較，△<0.05；與普濟(jì)消毒飲低劑量組比較，▲<0.05；與普濟(jì)消毒飲中劑量組比較，※<0.05

表3 各組小鼠的TLR4、MYD88、NF-κB p65基因表達(dá)比較（）

注：與對(duì)照組比較，*<0.05；與模型組比較，#<0.05；與左氧氟沙星組比較，△<0.05；與普濟(jì)消毒飲低劑量組比較，▲<0.05；與普濟(jì)消毒飲中劑量組比較，※<0.05

圖3 各組小鼠的TLR4、MYD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)及p-NF-κB p65水平

表4 各組小鼠的TLR4、MYD88、NF-κB p65蛋白表達(dá)及p-NF-κB p65水平比較（）

注：與對(duì)照組比較，*<0.05；與模型組比較，#<0.05；與左氧氟沙星組比較，△<0.05；與普濟(jì)消毒飲低劑量組比較，▲<0.05；與普濟(jì)消毒飲中劑量組比較，※<0.05

本研究結(jié)果顯示建模組小鼠中耳黏膜組織存在大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，與既往研究病理情況一致[10]，證明本研究成功構(gòu)建慢性化膿性中耳炎模型。左氧氟沙星可有效治療慢性化膿性中耳炎[11]；因此本研究選取左氧氟沙星作為陽(yáng)性藥物，與普濟(jì)消毒飲形成對(duì)照實(shí)驗(yàn)，確保研究的準(zhǔn)確性和嚴(yán)謹(jǐn)性。本研究結(jié)果表明，普濟(jì)消毒飲可抑制中耳黏膜組織增厚，減輕炎癥因子浸潤(rùn)。普濟(jì)消毒飲中黃芩、黃連共為君藥，清熱瀉火、祛上焦頭面熱毒；牛蒡子、連翹、薄荷、僵蠶共為臣藥，辛涼疏散頭面風(fēng)熱；玄參、馬勃、板藍(lán)根加強(qiáng)清熱解毒，配甘草、桔梗以清利咽喉，陳皮理氣疏壅，以散邪熱郁結(jié)，共為佐藥；升麻、柴胡疏散風(fēng)熱，并引諸藥上達(dá)頭面，功兼佐使之用。諸藥配伍，共奏清熱解毒、疏散風(fēng)熱之功。研究表明普濟(jì)消毒飲通過(guò)抗菌、抗炎作用發(fā)揮抑制慢性化膿性中耳炎炎癥反應(yīng)的功能[12]。

本研究結(jié)果表明，普濟(jì)消毒飲可下調(diào)小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平，抑制中耳黏膜組織TLR4、MYD88、NF-κB p65 mRNA和蛋白表達(dá)，下調(diào)p-NF-κB p65水平。有報(bào)道指出慢性化膿性中耳炎患者的TNF-α、IL-6水平升高，對(duì)維持機(jī)體全身和局部炎癥反應(yīng)發(fā)揮重要作用[13]。TLR4識(shí)別微生物病原體相關(guān)分子后，可激活依賴(lài)性MYD88通路，活化的MYD88進(jìn)一步激活NF-κB，進(jìn)而促進(jìn)促炎細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，故TLR4/MYD88/NF-κB信號(hào)通路激活在炎癥疾病發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14]。羅倫才等[15]指出，通過(guò)抑制TLR4/MYD88/NF-κB信號(hào)通路，可下調(diào)IL-1β、IL-6、TNF-α水平，減弱中耳炎的炎癥反應(yīng)；Li等[16]認(rèn)為抑制TLR4信號(hào)通路的激活能抑制分泌型中耳炎大鼠的炎癥反應(yīng)；Liu等[17]提出過(guò)表達(dá)TLR4后可促進(jìn)中耳上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果與上述結(jié)論一致，提示普濟(jì)消毒飲可通過(guò)抑制TLR4/MYD88/NF-κB信號(hào)通路，下調(diào)p-NF-κB p65、TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平，發(fā)揮抑制慢性化膿性中耳炎炎癥反應(yīng)的作用。

綜上所述，普濟(jì)消毒飲可通過(guò)抑制TLR4/MYD88/ NF-κB信號(hào)通路，下調(diào)TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ水平，發(fā)揮抑制慢性化膿性中耳炎炎癥反應(yīng)的作用。

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Pujixiaodu decoction inhibits inflammatory reaction of chronic suppurative otitis media

LI Ruoman, LIN Xize, YE Haiji, ZHENG Huizhen

1.Department of Otolaryngology, Wenzhou Seventh People’s Hospital, Wenzhou 325000, Zhejiang, China; 2.Department of Otolaryngology, Wenzhou People’s Hospital, Wenzhou 325006, Zhejiang, China; 3.Department of Otolaryngology, Wencheng County People’s Hospital, Wencheng 325300, Zhejiang, China

To investigate the effect of Pujixiaodu decoction on inhibiting inflammatory reaction of chronic suppurative otitis media.Models of chronic suppurative otitis media were established by injecting Pseudomonas aeruginosa into the tympanic cavity via tympanic membrane puncture. After successful modeling, levofloxacin group was given 1mg/ (kg·d) levofloxacin by gavage, the low, medium and high dose Pujixiaodu decoction groups were given 2.9g/ (kg·d), 5.8g/ (kg·d) and 11.6g/ (kg·d) concentrated Pujixiaodu decoction by gavage, respectively, model group and control group were given the same amount of normal saline by gavage, once a day for 14 days.Levofloxacin and low, medium and high dose Pujixiaodu decoction can reduce the pathological changes of middle ear mucosa. Compared with model group, serum tumor necrosis factor-α, interleukin (IL) -6, IL-1β and interferon-γ levels of mice in levofloxacin group and low, medium and high dose Pujixiaodu decoction groups decreased (<0.05), Toll-like receptor 4 (TLR4), myeloid differentiation protein 88 (MYD88), nuclear factor-κB p65 (NF-κB p65) gene expression and protein level and phosphorylation NF-κB p65 decreased (<0.05). The above indexes were dose dependent.Pujixiaodu decoction can inhibit the inflammatory response of chronic suppurative otitis media, which may be related to inhibition TLR4/MYD88/NF-κB signaling pathway.

Pujixiaodu decoction; Chronic suppurative otitis media; Toll-like receptor 4; Inflammatory response

R289；R276.1

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.19.019

溫州市科研項(xiàng)目（Y20201007）

鄭慧珍，電子信箱：devil888999123@163.com

（2022–09–29）

（2023–06–19）