張寶蓉， 解繼紅， 金丹青， 汪軍成， 姚立蓉，司二靜， 尚勛武， 王化俊， 李葆春*

（1.甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院，蘭州 730070； 2.甘肅農業(yè)大學甘肅省干旱生境作物學國家重點實驗室，蘭州 730070； 3.中國農業(yè)科學院草原研究所，呼和浩特 010010； 4.甘肅農業(yè)大學農學院，蘭州 730070）

偏穗鵝觀草（Roegneria komaroviiNevski）為小麥族（Triticeae）鵝觀草屬(Roegneria)植物，為小麥近緣種，是小麥的三級基因源，其優(yōu)異的基因可拓寬小麥遺傳基礎，提高小麥抗病、抗逆等特性[1]。羅粵川等[2]對31份鵝觀草種質資源進行田間抗赤霉病鑒定，發(fā)現鵝觀草抗侵入性中等、抗擴展性優(yōu)異、體抗性表現良好。周永紅等[3]對鵝觀草、大麥以及其屬間雜種進行了赤霉病抗性鑒定，表明鵝觀草的抗赤霉病基因在雜種中得到部分表達，可將鵝觀草抗赤霉病種質用于麥類作物育種中。陳景芋等[4]利用不同水平NaCl溶液對偏穗鵝觀草、大芒鵝觀草、肅草進行脅迫處理7 d,綜合分析各項生物學指標發(fā)現偏穗鵝觀草耐鹽性最好，由此表明偏穗鵝觀草中含有耐鹽基因。萬永芳等[5]用單花和多花注射接種法對小麥近緣野生植物16個屬80個種276份材料進行了抗赤霉病鑒定和分析，結果表明鵝觀草屬既高抗侵入又高抗擴展,進一步為挖掘小麥抗病性基因提供理論支撐。趙富強等[6]對來自國內外的34份鵝觀草種質資源條銹病及白粉病抗病性進行了鑒定和評價，發(fā)現鵝觀草屬種質資源抗病能力存在多樣性，篩選出6份高抗條銹病資源、12份高抗白粉病資源及2份(ZY 1007和Pr 87-88344)兼抗條銹病和白粉病資源，為合理利用抗病材料及抗病育種提供資料。馬玉寶等[7]搜集386份野生鵝觀草屬材料在四川、云南、甘肅及內蒙古等地區(qū)進行適應性評價，發(fā)現鵝觀草屬抗逆性強，適應性范圍廣。

研究功能基因的表達模式最常用的方法為實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR），該方法需要選用表達穩(wěn)定的參考基因進行校準，這些基因被稱為內參基因。理想的內參基因在植物不同生長發(fā)育階段、不同器官中均能穩(wěn)定表達，不受環(huán)境影響[8]。常見內參基因在所有細胞中均能穩(wěn)定表達，通常選用基因組中的管家基因（housekeeping gene），包括肌動蛋白、微管蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶等基因。

內參基因在不同物種間沒有絕對的通用性，不同物種間同源內參基因的穩(wěn)定性不同，同一物種中內參基因的穩(wěn)定性也是相對的，不同的內參基因在不同條件下的表達通常不是恒定不變的，研究者必需結合各自的試驗條件和樣品類型來選擇合適的內參基因[9]，否則會導致試驗數據出現偏差，影響目的基因表達水平的分析。為保障基因表達分析結果的可靠性，篩選偏穗鵝觀草適宜的內參基因，對于其抗逆性基因篩選及在小麥中的應用等研究具有重要意義。本研究選取小麥中8個常用候選內參基因[10]，驗證候選內參基因在偏穗鵝觀草根、莖、葉等不同器官及不同脅迫處理環(huán)境下的表達，并借助geNorm、BestKeeper軟件對這些內參基因表達的穩(wěn)定性進行評價，以期篩選最佳內參基因，為后續(xù)偏穗鵝觀草基因表達、功能及調控等相關研究提供參考，對進一步研究小麥三級資源庫材料具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料中國春、偏穗鵝觀草由甘肅省作物遺傳改良與種質創(chuàng)新實驗室提供，種植于甘肅農業(yè)大學玻璃溫室，采用栗鈣土與蛭石（質量比3∶1）混合土培方式，分別播種在口徑23 cm、高15 cm塑料花盆中。分別采取供試材料各處理組的根、莖、葉樣品，液氮速凍后轉-80 ℃冰箱保存。

1.2 植物基因組DNA提取

參照Rogers等[11]方法提取提取中國春及偏穗鵝觀草DNA。利用Nanophoto meter Pearl微量紫外分光光度計（德國）測定DNA樣品230、260及280 nm的光吸收值，確定純度及含量。

1.3 植物總RNA提取及cDNA第1條鏈合成

采用Trizol試劑盒 (TIANGEN,北京)植物總RNA提取試劑盒提取偏穗鵝觀草不同處理的不同器官（根、莖、葉）RNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳及Nanophoto meter pearl微量紫外分光光度計測定RNA樣品230、260及280 nm的光吸收值，檢測其含量及純度。參照天根公司逆轉錄試劑盒FastQuant RT Kit(with gDNase)說明書合成 cDNA第1條鏈，保存于-20 ℃冰箱中。

1.4 候選內參基因選擇及引物設計

選取肌動蛋白(Actin1、Actin2、Actin3)、微管蛋白(Beta-Tubulin，BTUB)、親環(huán)素(Cyclophilin)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate，GAPDH)、組蛋白(Histone H3)、延伸因子(elongation factor-1-alpha-subunit，EF1α1)的編碼基因，運用NCBI獲得候選內參基因序列并根據編碼序列（coding sequence，CDS）保守區(qū)段設計引物(表1)。

1.5 候選內參基因引物特異性分析

用內參基因引物，以偏穗鵝觀草各樣DNA為模板進行PCR擴增。反應體系:DNA模板1 μg；上下游引物各1 μL（10 μmol·L-1）；2×TaqPCR Master Mix 25 μL，加水至50 μL。反應條件：94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。通過2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測引物的特異性及產物大小。

1.6 序列分析

PCR擴增產物均使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收，并由北京擎科生物有限公司完成測序。將測序所得結果提交NCBI數據庫并用MEGA6和DNAMAN軟件進行氨基酸比對。

1.7 內參基因的qRT-PCR分析

qRT-PCR擴增采用天根SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒，反應體系20 μL：cDNA模板1 μL；上下游引物各0.6 μL；2×SuperReal PreMix Puls (SYBR Green) 10 μL; 50×ROX Reference Dye 0.4 μL; RNase-Free ddH2O 7.4 μL。反應程序： 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 10 s，60 ℃32 s, 40個循環(huán)； 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min; 95 ℃15 s。每個樣品設置3個重復。

1.8 數據處理與分析

分別以根、莖、葉不同器官及鹽處理RNA為模板進行qRT-PCR得到的Ct值，利用geNorm及BestKeeper軟件進行候選基因的表達豐度分析及差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 引物特異性分析

以偏穗鵝觀草葉片為材料提取的總RNA經Nano photo檢測OD260/280均在1.8～2.13之間，說明總RNA純度較好。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，所有樣品28S及18S條帶完整清晰(圖1A)，說明總RNA完整性較好，達到后續(xù)試驗要求。以偏穗鵝觀草及中國春葉片樣品DNA為模板，利用8個特異性引物進行擴增。擴增產物經電泳檢測，8個候選內參基因在偏穗鵝觀草（圖1B）及中國春（圖1C）中均擴增出目的條帶，并且擴增產物條帶大小符合預期，引物特異性良好，可對擴增產物進行測序。

圖1 RNA監(jiān)測及候選基因擴增Fig.1 RNA detection and candidate gene amplification

2.2 候選基因測序結果分析

在NCBI數據庫比對結果如圖2所示，偏穗鵝觀草候選內參基因和小麥、大麥、蒙古冰草、粗山羊草、二粒小麥、大麥草等相似性在82%～96%，同屬小麥族物種，內參基因具有一定的保守性。

圖2 偏穗鵝觀草部分候選內參基因序列對比Fig.2 Comparison of the sequence of some candidate internal reference genes

應用DNAMAN軟件中對偏穗鵝觀草與中國春內參基因序列進行相似性比對，各候選內參基因出現多個位點單堿基突變（single nucleotide polymorphism，SNP）。

2.3 候選內參基因表達豐度分析

分別以不同組織及處理的偏穗鵝觀草cDNA為模板進行qRT-PCR分析。8個候選內參基因在偏穗鵝觀草不同器官中Ct值介于20.87～32.70之間(表2)。由于Ct值越大，其表達豐度越小，Actin1、BTUB、Actin2、Actin3、Histone H3的Ct值均大于25，表明其在偏穗鵝觀草中根、莖、葉器官中表達豐度小，Cyclophilin、EF1a1及GAPDH在根、莖、葉中的Ct均小于25，表明其在偏穗鵝觀草中根、莖、葉器官中表達豐度較大，優(yōu)先考慮這3個基因作為內參基因。

表2 8個候選內參基因在偏穗鵝觀草不同器官中的Ct值范圍Table 2 Range of Ct values of 8 candidate internal reference genes in different organs of Roegneria komarovii

2.4 偏穗鵝觀草候選內參基因穩(wěn)定性分析

2.4.1 geNorm 分析 geNorm 軟件是Vandesompele等[12]編寫的專門用于qRT-PCR中篩選內參基因及確定最適內參基因數目的程序，其利用各內參基因Ct值換算成Q值進行分析，依據計算的每個基因表達穩(wěn)定性（M值）來篩選出穩(wěn)定性較好的內參基因。M值與內參基因穩(wěn)定性呈負相關，且geNorm默認值為1.5，M＜1.5時認為是理想內參；M值＞1.5時則認為極其不穩(wěn)定且不應作為內參基因。因此判定標準為M值越小穩(wěn)定性越好，反之，則穩(wěn)定性越差。geNorm軟件分析結果顯示，在CK組中8個內參基因的M值均小于1.5，說明這些候選內參基因穩(wěn)定性好，表達穩(wěn)定性由高到低排序依次為EF1a1=GAPDH＞Cyclophilin＞Actin3＞Actin2＞Actin1＞BTUB＞HistoneH3;同上，在鹽處理組中：GAPDH=Histone H3＞Cycliophilin＞Actin3＞EF1a1＞Actin1＞Actin2＞BTUB; 在干旱組中：GAPDH=Actin2＞EF1a1＞Actin3＞Actin1＞BTUB＞Histone H3;在高溫組中：EF1a1=Cycliophilin＞Actin3＞GAPDH＞Actin2＞HistoneH3＞Actin1＞BTUB(圖3)。

圖3 geNorm分析候選內參基因表達穩(wěn)定性Fig.3 Analysis of the expression stability of candidate reference genes by geNorm

geNorm軟件可以通過配對差異系數(Vn/n+1)確定最適內參基因數目，軟件默認Vn/n+1閾值為0.15，閾值小于0.15時，最適內參基因個數為n個，大于0.15時，最適內參基因個數為n+1個。在此試驗中對候選內參基因的配對差異值分析發(fā)現(圖4)，CK組、鹽處理組及高溫組中，V2/3分別為0.101、0.084、0.147，均小于0.15,說明最適內參基因個數為2個；干旱處理組中，V3/4為0.114,說明最適內參個數為3個。

圖4 geNorm分析確定候選內參基因數目Fig.4 Determined the optimal number of candidate reference genes by geNorm

2.4.2 BestKeeper分析 BestKeeper是由Pfaffl等[13]編寫的針對內參基因和目標基因表達量分析的程序，計算比較基因的CV值和s值來評價內參基因穩(wěn)定穩(wěn)定性，CV和s越小，說明該內參基因穩(wěn)定性越好；若s＞1則說明該內參基因表達不穩(wěn)定。BestKeeper軟件分析結果（表3）顯示，8個內參基因s值均小于1，說明8個候選基因的表達穩(wěn)定性較好；CK組中穩(wěn)定性由高到低排序為GAPDH＞EF1a1＞Actin3＞Cyclophilin＞Actin1＞Actin2＞Histone H3＞BTUB;鹽處理組中，EF1a1＞Actin3＞Cyclophilin＞GAPDH＞HistoneH3＞Actin1＞Actin2＞BTUB;干旱處理組中Cyclophilin＞GAPDH＞Actin3＞Actin1＞Actin2＞EF1a1＞HistoneH3＞BTUB;高溫處理組中Actin3＞Histone H3＞EF1a1＞cyclophilin＞GAPDH＞Actin1＞Actin2＞BTUB。

表3 BestKeeper分析候選內參基因表達穩(wěn)定性排名Table 3 Expression stability values of candidate reference genes determined through BestKeeper

2.4.3 內參基因表達穩(wěn)定性驗證

鹽、干旱等非生物脅迫可迅速激活植物SnRK2家族蛋白激酶[14]，為驗證篩選的內參基因表達穩(wěn)定性，用綜合穩(wěn)定性排名高的Cyclophilin為參照分別對不同處理偏穗鵝觀草的SnRK2的表達水平進行分析。結果顯示，以Cyclophilin為參照，SnRK2在偏穗鵝觀草不同非生物脅迫處理中上調表達(圖5)。

圖5 Cyclophilin分析偏穗鵝觀草不同非生物脅迫處理中SnRK2表達水平Fig.5 Expression level of SnRK2 in Roegneria komarovii under different abiotic stress treatments using Cyclophilin

3 討論

qRT-PCR是目前研究基因表達應用最為普遍的技術，但其準確性受到樣品起始RNA的質量和含量、cDNA 合成效率以及PCR擴增效率等多因素的影響[15]，常規(guī)qRT-PCR采用相對定量進行分析,選擇合適的內參基因進行校正和標準化至關重要。理想的內參基因表達水平在不同組織、不同生理與環(huán)境條件下保持穩(wěn)定不變[16]，但已有研究表明，生物體內并沒有真正的、完全穩(wěn)定的內參基因，大多數傳統(tǒng)內參基因已不能滿足qRT-PCR準確定量的要求[17]。齊香玉等[18]研究發(fā)現，內參基因的表達差異不僅僅存在于不同物種間，即使同一物種，由于組織、生長階段和環(huán)境等不同，內參基因表達的穩(wěn)定性也存在差異。某種植物中較為理想的內參基因并不一定適合在其他植物中使用。本文基于8個表達較穩(wěn)定的小麥內參基因篩選偏穗鵝觀草的同源內參基因也出現了相似的結果。因此，為獲得準確的基因表達數據，在進行研究試驗之前，篩選出試驗條件下特異性的內參基因，控制和減少實驗誤差對獲得準確的基因表達結果至關重要[19-20]。

目前，篩選內參基因常采用的軟件有geNorm、NormFinder及BestKeeper，已用于馬鈴薯[21]、小麥[8]、大豆[22]等候選基因的穩(wěn)定性評估，并確定了不同條件下的內參基因。本文通過geNorm及BesteKeeper軟件對偏穗鵝觀草不同器官及鹽脅迫條件下進行內參基因的表達穩(wěn)定性進行評估。geNorm軟件分析原理是將RT-qPCR所得到的Ct值轉為基因的相對表達量Q值，篩選出試驗樣品中任意數量的內參基因，通過該程序分析可以篩選出合適內參基因以及確定最適內參基因數目，而BestKeeper軟件直接以Ct值作為分析數值，計算出標準偏差(SD)和變異系數(CV)來評價內參基因穩(wěn)定性，CV和SD越小，說明該內參基因穩(wěn)定性越好，其優(yōu)勢在于可比較多個樣品中內參基因和目標基因的表達水平，2個軟件最終都可以獲得較為穩(wěn)定的內參基因[23]。本研究結果顯示，Actin1、Actin2、Actin3、HistoneH3在偏穗鵝觀草中表達豐度較低，不適宜作為偏穗鵝觀草的內參基因，EF1a1、GAPDH、Cyclophilin在偏穗鵝觀草中表達豐度相對較高。在CK組中EF1a1、GAPDH、Cyclophilin在2個軟件分析中穩(wěn)定性較好，表達豐富高，優(yōu)先考慮其作為偏穗鵝觀草的候選內參基因；在鹽處理組中Cyclophilin、GAPDH及EF1a1穩(wěn)定性出現差異，該現象在鳳丹、Citrus reticulata[24]的內參基因篩選中也有報道，可能與計算機內置統(tǒng)計學算法不同有關，但Cyclophilin比其他的穩(wěn)定性較為理想；在干旱處理組中Cyclophilin、GAPDH穩(wěn)定性較好；在高溫處理組中，EF1a1、Cyclophilin穩(wěn)定性較好。試驗結果表明，根據不同的試驗條件可以選擇合適的內參基因，Cyclophilin基因為偏穗鵝觀草最佳內參基因，試驗結果為其他后續(xù)基因表達、功能及調控等相關研究供參考。