王 磊

（天津市食品安全檢測技術(shù)研究院，天津 300308）

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是基因擴(kuò)增檢測技術(shù)最主要的應(yīng)用方向，其原理為通過從樣本中提取核酸并進(jìn)行擴(kuò)增，分析目標(biāo)基因序列，最終獲得樣本的物種信息。經(jīng)過多年發(fā)展，該技術(shù)以普通PCR為基礎(chǔ)，已衍生出多重PCR、實時熒光定量PCR、數(shù)字PCR等多種應(yīng)用途徑，并以其省時高效的優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于食品安全等檢測領(lǐng)域[1]。本文結(jié)合實際工作經(jīng)驗，對PCR檢測技術(shù)的主要應(yīng)用范圍進(jìn)行論述，針對內(nèi)、外源影響因素，對檢測的質(zhì)量控制要點進(jìn)行了總結(jié)，以期為相關(guān)實驗室的建設(shè)提供參考依據(jù)。

1 基因擴(kuò)增技術(shù)在食品檢測中的主要應(yīng)用

1.1 致病性微生物檢測

食源性致病微生物檢測一般以致病菌為主，其常規(guī)檢測方法為培養(yǎng)法，耗費時間長。PCR技術(shù)作為其輔助手段，既可以用于檢測末端對菌株進(jìn)行鑒定，也可用于前端對增菌液進(jìn)行初篩，具備靈活準(zhǔn)確的特點，但其囿于原理，無法考查微生物的生物活性。目前，PCR技術(shù)用于致瀉大腸埃希氏菌和諾如病毒的檢測方法已經(jīng)被食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)采用，用于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等常見致病菌的鑒定方法及商品化試劑也已被相繼研發(fā)。

1.2 動物源性成分檢測

動物源性成分鑒定主要用于肉制品摻假的檢測[2]，目前豬、牛、羊、馬、驢、雞和鴨等常見畜禽肉類的鑒定都已建立了相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。其中，以實時熒光PCR的應(yīng)用較為突出，其優(yōu)勢在于通過建立已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，比對計算出目標(biāo)拷貝數(shù)的初始含量，實現(xiàn)成分的相對定量分析。另外，可進(jìn)行多種成分同時測定的多重PCR技術(shù)也逐漸得到應(yīng)用。

1.3 過敏原成分檢測

食品過敏原包括甲殼類、魚類、蛋類、牛奶、花生、堅果、大豆、小麥以及芝麻等成分，現(xiàn)階段針對該類成分的檢測標(biāo)準(zhǔn)主要是用于出口食品的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，方法上以熒光定量PCR法為主。與依賴于分析特定蛋白的方法相比，熒光定量PCR方法在檢測中顯示出較高的靈敏度和可靠性，更容易滿足該類成分微量、痕量的檢出需求[3]。

1.4 轉(zhuǎn)基因成分檢測

轉(zhuǎn)基因成分是最早應(yīng)用基因擴(kuò)增檢測技術(shù)的食品類別，普通PCR和熒光PCR技術(shù)在該領(lǐng)域中占主導(dǎo)地位。我國現(xiàn)已經(jīng)頒布了包括通用要求和具體種類品系的一系列檢測標(biāo)準(zhǔn)，形成了比較完備的體系。實際檢測中需要考慮到領(lǐng)域中內(nèi)源基因、外源基因、啟動子、終止子等特定概念[4]，對引物設(shè)計、結(jié)果判定等步驟進(jìn)行系統(tǒng)性考量。

2 基因擴(kuò)增檢測技術(shù)的質(zhì)量控制要點

2.1 人員的控制

實驗室對檢測人員應(yīng)進(jìn)行定期培訓(xùn)，重點在于分子生物學(xué)相關(guān)專業(yè)知識、實驗操作技能、規(guī)范化操作、污染預(yù)防處置辦法和生物安全等內(nèi)容。同時實驗室應(yīng)定期組織或參加實驗室間比對試驗，通過考核訓(xùn)練提升檢測人員的操作技能。

PCR反應(yīng)實驗具有精細(xì)微量的操作特點，檢測人員的業(yè)務(wù)熟練程度和責(zé)任心成為主導(dǎo)檢測結(jié)果有效性的決定性因素。因此，檢測人員必須嚴(yán)格執(zhí)行質(zhì)量體系規(guī)定的檢測流程、檢測方法，杜絕因操作不細(xì)致導(dǎo)致的結(jié)果異常甚至交叉污染的發(fā)生，同時也要求實驗室在質(zhì)量監(jiān)督活動中對檢測人員的實驗作風(fēng)和實驗習(xí)慣加以重點考察。

2.2 儀器設(shè)備的控制

作為實現(xiàn)檢測過程的重要核心條件，PCR擴(kuò)增儀、實時熒光定量PCR儀、生物安全柜、天平、低溫離心機、核酸濃度測定儀和移液器等儀器設(shè)備要按照規(guī)程要求定期進(jìn)行維護(hù)、期間核查、檢定校準(zhǔn)，保證其在規(guī)定參數(shù)內(nèi)正常運行。同時應(yīng)制定相應(yīng)的設(shè)備防護(hù)程序，避免操作中核酸或試劑泄露對設(shè)備造成不良影響。

2.3 樣本和試劑耗材的控制

2.3.1 樣本

樣本的處理應(yīng)按照方法和作業(yè)指導(dǎo)書嚴(yán)格進(jìn)行，做好編號和相應(yīng)登記。檢測人員根據(jù)樣本類型采取相適應(yīng)的方式進(jìn)行保存。制備樣本應(yīng)及時進(jìn)行核酸提取，核酸若需暫時儲存，應(yīng)于-20 ℃以下保存，避免反復(fù)凍融；需要長時間保存的應(yīng)儲存于-80 ℃條件下，保存期不宜超過6個月。

2.3.2 試劑和耗材

試劑質(zhì)量直接影響PCR反應(yīng)的檢測結(jié)果，故不得使用偽劣或過期試劑。實驗室應(yīng)對每批次購進(jìn)的新試劑與保存的陰、陽性標(biāo)本進(jìn)行同條件驗證試驗，質(zhì)量驗收合格后方可使用。試劑保存應(yīng)嚴(yán)格按照說明書放置在恒溫環(huán)境和專用冰箱中，未開封試劑與已部分使用試劑分開放置。需低溫保存又要經(jīng)常使用的試劑需分裝后貯存?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融和打開容器影響試劑質(zhì)量，同時減少實驗室的偶然性污染機會。

實驗室各功能區(qū)所用的手套、移液器吸頭、離心管、反應(yīng)管等物品均應(yīng)一次性使用；加樣環(huán)節(jié)選用帶濾芯移液器吸頭，以防操作過程中引入污染。

2.4 檢測方法的控制

基因擴(kuò)增實驗室應(yīng)依據(jù)檢測方法制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，明確相關(guān)注意事項，規(guī)程應(yīng)涵蓋試劑準(zhǔn)備、測定方法和儀器操作等內(nèi)容。針對PCR實驗的特性，實驗室還需制定相應(yīng)的試劑登記驗收程序、清潔程序、污染控制及消除程序和過程控制程序以保證檢測結(jié)果的有效性。在明確區(qū)分檢測項目個體化差異的基礎(chǔ)上，實驗室應(yīng)根據(jù)具體情況對試驗程序進(jìn)行規(guī)范完善，并定期對其進(jìn)行檢查核對，持續(xù)改進(jìn)，確保其時效性和適用性，做到檢測過程有章可循，檢測記錄有據(jù)可查。

2.5 檢測環(huán)境的控制

2.5.1 實驗室功能區(qū)域的劃分

基因擴(kuò)增實驗室應(yīng)具有充分、合理的空間，良好的照明和通風(fēng)設(shè)備，并遵照檢測工作流程，按單向流動原則進(jìn)行規(guī)范化分區(qū)。一般按照GB/T 27403——2008、GB/T 19495.2——2004將實驗室分隔為試劑配制和貯存區(qū)、樣品制備區(qū)、PCR反應(yīng)配制區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)5個工作區(qū)；也可按照GB/T 32146.3——2015分隔為試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)4個工作區(qū)，實驗室應(yīng)根據(jù)自身硬件條件和檢測方向需求，合理布局規(guī)劃[5]。

要求各功能區(qū)必須互相獨立，采取空間隔離并明確標(biāo)識，應(yīng)各自設(shè)有緩沖間，供更換工作服用；檢測空間應(yīng)相對封閉，避免頻繁的空氣對流產(chǎn)生；各區(qū)的儀器設(shè)備、實驗用品和清潔工具必須專用，不得混用；各區(qū)應(yīng)具備通風(fēng)裝置，以便及時排除空氣中的核酸氣溶膠。最終實現(xiàn)檢測過程單向的操作流、人流、物流以及氣流，盡可能預(yù)防核酸污染對檢測結(jié)果造成干擾。

2.5.2 實驗室內(nèi)部環(huán)境的控制

實驗室內(nèi)部環(huán)境應(yīng)始終圍繞預(yù)防和避免核酸污染這一原則進(jìn)行控制。每次實驗操作前后應(yīng)用紫外線照射整個試驗區(qū)域（≥30 min）；定期采用10%次氯酸鈉或1%過氧乙酸擦拭地面及工作臺以破壞殘留的核酸，并對實驗室進(jìn)行換氣和消毒，預(yù)防空氣中氣溶膠污染源。

各區(qū)試驗結(jié)束后廢棄的樣本、反應(yīng)管、移液器吸頭等物品應(yīng)就地及時置于盛有10%次氯酸鈉的容器中浸泡（≥6 h），同時涉及微生物操作的所有廢棄物必須經(jīng)過高壓滅菌并按醫(yī)療垃圾物處理，從而在實驗用品、設(shè)施和空氣環(huán)境中徹底控制污染源。

2.6 檢測過程的控制

2.6.1 核酸提取

核酸的提取是關(guān)系檢測結(jié)果是否成立的關(guān)鍵步驟，因此操作過程必須注意避免標(biāo)本間的交叉污染及核酸模板的降解、丟失。提取所采用的吸頭、離心管的品質(zhì)，開蓋、吸棄上清液等操作是否正確均會對檢測質(zhì)量造成影響，檢驗人員必須時刻注意。

對于DNA的提取，建議采用操作相對簡便、人為影響因素較少的柱膜法或磁珠法，以取代傳統(tǒng)的CTAB抽提法；某些病毒檢測中則需制備RNA擴(kuò)增樣本，在提取完成后應(yīng)立即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作，合成較為穩(wěn)定的cDNA，以便于保存。

2.6.2 反應(yīng)液的配制

反應(yīng)體系的配制是PCR檢測準(zhǔn)確率的保障，應(yīng)按試驗設(shè)計配制反應(yīng)液。開關(guān)微量離心管時須雙手操作，手部應(yīng)以最小面積接觸管上方，不得觸及管蓋內(nèi)面；Taq酶、引物等試劑在開蓋前應(yīng)低速瞬時離心，使附在管壁和管蓋的液體沉于管底，保證試劑濃度一致；應(yīng)盡量減少試劑的開蓋次數(shù)和時間，防止空氣、吸頭、濺沫等污染試劑，同時為確保實驗體系的均一性，應(yīng)對最終反應(yīng)液反復(fù)抽吸混勻；考慮到吸取、分裝試劑時的誤差，所配制的反應(yīng)液應(yīng)比理論用量多出1～2孔的余量，以免實際用量不足。

空白對照、陰性對照和陽性對照是反應(yīng)過程中最重要的主動質(zhì)控方式，每次檢測實驗必須同時伴隨進(jìn)行。加樣順序遵從核酸濃度由低到高的順序：①空白對照；②陰性對照；③樣品；④由低到高濃度加入標(biāo)準(zhǔn)品（定量實驗）；⑤陽性對照。

2.6.3 擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的分析

PCR反應(yīng)上機操作中，檢測人員應(yīng)確保8聯(lián)排管或96孔板平衡放置；反應(yīng)管加蓋或膜時，不得用記號筆標(biāo)記，也不可觸摸管蓋或膜的下表面。

擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳操作上樣時應(yīng)避免加樣液的溢出和點樣孔內(nèi)有氣泡產(chǎn)生，避免PCR產(chǎn)物漂移到其他孔而影響結(jié)果判定；實驗結(jié)束后應(yīng)立即對廢棄物進(jìn)行無害化處理，嚴(yán)防產(chǎn)物核酸進(jìn)入空氣，形成污染源。

3 結(jié)語

綜上，隨著我國食品安全保障水平的不斷提升，PCR技術(shù)在基層檢測機構(gòu)得到推廣，現(xiàn)已經(jīng)逐漸向普及化和常規(guī)化方向發(fā)展。由于該技術(shù)的高敏感特性，某些細(xì)微不確定因素即可導(dǎo)致假性（陰、陽）結(jié)果產(chǎn)生。為應(yīng)對此情況，實驗室必須制定全方位的質(zhì)量控制措施，提升人員檢測能力，優(yōu)化試劑、設(shè)備、樣本、環(huán)境的管理，加強對檢測方法執(zhí)行的過程控制，從而充分保證所出具檢測結(jié)果的有效性和可信度，使這種新興的檢測手段得到更有效、更長足的發(fā)展利用。