楊 剛，李勝杰，連總強，劉 哲，王旭軍，白富瑾，楊立強，，楊瑞蘭，，柳 婷，，吳旭東，

(1.甘肅農業(yè)大學動物科學技術學院，蘭州 730070；2.寧夏回族自治區(qū)水產研究所，銀川 750001；3.中國水產科學研究院珠江水產研究所，廣州 510385；4.寧夏新明潤源農業(yè)科技有限公司，銀川 750001；5.寧夏回族自治區(qū)水產技術推廣站，銀川 750001)

性腺發(fā)育作為魚類繁殖的前提，其受溫度、光照、營養(yǎng)、密度、pH等因素的影響，溫度和光照在魚類性腺發(fā)育中起主導作用，溫度調控對魚類性腺發(fā)育的影響因魚的種類而異[1]。已有研究表明，溫度對性腺分化、發(fā)育和產卵均有影響，在性腺分化時高溫或低溫會改變魚類雌雄比例，在性腺發(fā)育時適宜的升溫或降溫會促進或抑制性腺發(fā)育和成熟，進而影響產卵[2]。如廈門文昌魚(Branchiostomabelcheri)水溫從16 ℃提高至28 ℃性腺發(fā)育速度顯著加快[3]，(Miichthysmiiuy)提高水溫可使卵巢快速發(fā)育并提前產卵[4]；但對產卵后的四川華鳊(Sinibramataeniatus)雌魚進行11 ℃低溫養(yǎng)殖，發(fā)現卵母細胞發(fā)育不良，大量卵泡出現閉鎖現象[5]；庫達海馬(Hippocampuskuda)幼魚在18 ℃和20 ℃條件下飼養(yǎng)時，卵巢發(fā)育停滯于Ⅱ期或Ⅲ期狀態(tài)[6]。因此溫度調控對魚類性腺發(fā)育和成熟以及實現全年繁育具有重要意義。

大口黑鱸(Micropterussalmoides)俗稱加州鱸，原產于美國加利福尼亞州，具有肉質鮮美、無肌間刺、生長迅速、適溫范圍較廣等優(yōu)點[7-9]，自20世紀80年代引入廣東地區(qū)并成功繁殖后，現已成為我國重要的淡水養(yǎng)殖品種之一[10]。近年來寧夏等北方地區(qū)大口黑鱸養(yǎng)殖發(fā)展快速，養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴大，但苗種主要從華南和華中地區(qū)引進，存在一苗難求、質量不一致、病害多發(fā)、成活率不高等問題[11]。有關報道顯示，大口黑鱸在自然條件下一年僅繁殖一次[12]，廣東、江浙等沿海地區(qū)大口黑鱸在3-5月產卵[13，14]，安徽、新疆等地區(qū)4月下旬至5月上旬水溫在18～25 ℃時產卵[15，16]，寧夏地區(qū)4月下旬至5月中旬水溫達到18～23 ℃時產卵。由于北方地區(qū)大口黑鱸魚苗下塘時間晚，養(yǎng)殖有效期短，存在當年不能養(yǎng)成上市、越冬死亡率高的問題[17，18]，若能在寧夏地區(qū)開展大口黑鱸反季節(jié)苗種繁育，使苗種在室內培育至翌年早春3-4月達到(50～150)g/尾下塘，可在7-9月份上市并高價銷售[19]，既實現結構調整所需苗種本地化生產又歷史性地實現“北苗南運”，促使大口黑鱸養(yǎng)殖產業(yè)效益最大化。已有研究報道，華中地區(qū)通過控溫實現了大口黑鱸9-10月份二次產卵[20]，培育大規(guī)格越冬苗種，大大提前了上市時間并填補了7-9月市場缺魚期。本實驗通過開展寧夏地區(qū)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”自然和人工控溫條件下性腺發(fā)育及性激素水平變化規(guī)律及人工控制反季節(jié)苗種繁育技術研究，以期為破解西北地區(qū)大口黑鱸養(yǎng)殖產業(yè)高質量發(fā)展面臨的苗種適時規(guī)模供給瓶頸提供重要的技術支撐，為大口黑鱸性腺發(fā)育及周年繁育研究提供理論依據和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 實驗魚及實驗條件

實驗魚為寧夏地區(qū)引進培育的大口黑鱸“優(yōu)鱸3號”親本，人工馴養(yǎng)1年以上，年齡≥1齡，體質健壯，無病無傷，體質量(550±50)g，體長(25.4±1.7)cm。實驗魚先在室外池塘培育，后轉入室內水泥池培育。室外池塘養(yǎng)殖面積為7 000 m2、水深2 m，放養(yǎng)密度約800尾/667 m2，培育用水為黃河水，pH 7.8～8.2、氨氮0.05～0.20 mg/L、亞硝酸鹽0.01～0.15 mg/L、溶氧5.5～8.0 mg/L；室內水泥池體積為100 m3，放養(yǎng)密度為25尾/m3，培育用水為地下水(水溫12～13 ℃)，pH 8.0～8.2、溶氧5.5～7.0 mg/L、氨氮0.01～0.20 mg/L、亞硝酸鹽0.01～0.20 mg/L。

1.2 實驗設計

2022年4月1日-5月7日在室外池塘養(yǎng)殖1齡大口黑鱸，分為控溫組和對照組，控溫組采用室外池塘上方加蓋遮陽保溫材料控制水溫，對照組為不做任何處理的露天池塘。5月8日將室外池塘控溫組和對照組實驗魚分別轉入設施溫棚車間水泥池內繼續(xù)控溫[(14±1)℃]培育至大口黑鱸性腺發(fā)育至Ⅴ期后升溫至20 ℃進行反季節(jié)繁殖實驗，各組隨機挑選80尾(雌雄比為1∶1)分別置于直徑為8 m的圓形養(yǎng)殖池產卵，將每天收集的受精卵置于面積為12 m2的孵化池中孵化，孵化水溫為23 ℃。實驗期間每天9：00投喂一次大口黑鱸親魚專用配合飼料，投餌率為0.2%～0.5%。外塘水溫每天取6：00、12：00、18：00、24：00水深1 m處水溫的平均值為當天水溫(對照組11.1 ℃～17.7 ℃，控溫組5.4 ℃～11.4 ℃)。

1.3 樣品采集

室外培育期間第8、16、24、30天各采集一次性腺、血清樣品，室內培育期間第1天和第30天各采集一次性腺樣品，樣本數量均為雌雄各5尾。將隨機捕獲的實驗魚用2-苯氧乙醇麻醉，測量體質量，尾靜脈采血1.5 mL，解剖魚體采集性腺組織并測量質量，同時取約1 cm3小塊性腺組織置于Bouin′s液固定48 h后用于制作組織切片。血液在4 ℃自然凝固4～6 h后3 500 r/min離心10 min，取上清保存于-20 ℃用于性激素測定。繁殖期統(tǒng)計一周內產卵量、受精率和孵化率等指標。

1.4 血清中性激素測定

用酶聯免疫吸附測定(Elisa)試劑盒(江蘇雨桐生物科技有限公司)雙抗體夾心法測定血清中雌二醇(E2)和睪酮(T)水平。試劑盒內含帶有對應激素抗體包被的微孔板，血清激素與微孔板中的抗體結合后，經徹底洗滌后加底物TMB并利用HRP酶催化顯色，使用酶標儀測定450 nm的波長下吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中激素水平。具體方法參見試劑盒內說明書。

1.5 性腺組織學觀察

固定好的性腺樣品經酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，YD-202輪轉式切片機連續(xù)切片(5～8 μm)形成蠟帶，蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹膠封片，Motic A131顯微鏡拍照觀察。性腺分期標準參照崔慶奎等[20]的方法。

1.6 數據處理

結果用“Mean±SD”表示，用SPSS 25.0(IBM SPSS Statistics，Version 25)統(tǒng)計軟件對試驗數據進行統(tǒng)計學分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行顯著性檢驗，然后用Duncan’s多重比較來確定組間差異的顯著性，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。用Excel軟件制作圖表。相關計算公式如下：

性腺指數(GSI)=WG/WB×100%

受精率(FR)=受精卵數/總卵數×100%

孵化率(HR)=出膜苗數/受精卵總數×100%

式中，WG和WB分別為實驗魚性腺質量和體質量，單位g。

2 結果與分析

2.1 室外培育大口黑鱸性腺指數(GSI)變化

室外池塘培育期間雄性大口黑鱸GSI呈現上升趨勢(圖1)，其中對照組GSI變化范圍為0.47%～0.77%，控溫組GSI在第24天之前呈緩慢上升趨勢，僅上升了0.10個百分點，后顯著上升至0.57%。雌性大口黑鱸GSI變化趨勢和雄性相同(圖2)，對照組GSI變化范圍為8.17%～11.95%，控溫組GSI變化范圍為4.48%～8.45%。對照組雄性大口黑鱸GSI在室外池塘培育期間前24 d內顯著高于控溫組，對照組雌性大口黑鱸GSI在室外池塘培育期間顯著高于控溫組。

2.2 室外培育大口黑鱸性腺組織學觀察

大口黑鱸精巢發(fā)育組織學觀察如圖3所示。室外池塘培育至第8天，對照組大口黑鱸精巢發(fā)育至Ⅲ期，切片中顯示精小葉有腔隙，小葉邊排列著初級精母細胞，腔內有精母細胞和精子(圖3A)；同期控溫組大口黑鱸精巢處于Ⅱ期，大口黑鱸精巢處于精原細胞增殖后期，精原細胞較多，精小葉內精原細胞成群分布，小葉內僅存有少量精子(圖3E)。培育至第24天，對照組大口黑鱸精巢處于Ⅲ期，精巢內精原細胞繼續(xù)增殖生長，主要以初級精母細胞為主(圖3B，3C)，培育至第30天時，精巢處于Ⅳ期末，小葉腔擴大，腔內充滿大量精子，染色較深(圖3D)；而控溫組大口黑鱸精巢發(fā)育較為緩慢，培育至第30天僅發(fā)育至Ⅲ期(圖3F-3H)。

圖3 大口黑鱸精巢組織切片觀察Fig.3 Observation of testis tissue section of M.salmoides

大口黑鱸卵巢發(fā)育組織學如圖4所示。室外池塘培育至第8天，對照組大口黑鱸卵巢發(fā)育至Ⅲ期，切片顯示卵巢內出現液泡，沉積的卵黃開始出現油球，有2層濾泡膜，主要以Ⅲ時相卵母細胞為主(圖4E)，而控溫組大口黑鱸卵巢內卵黃正處于沉積階段，細胞核明顯(圖4A)，此時卵粒不能剝離。培育至第24天，對照組大口黑鱸卵巢體積進一步增大，此時細胞核開始極化，油球增多，卵巢內主要為Ⅳ時相卵母細胞(圖4G)，培育至第30天時，此時卵巢處于Ⅴ期，卵黃顆粒處于游離狀態(tài)(圖4H)。控溫組大口黑鱸卵巢發(fā)育較為緩慢，培育至第24天時，卵母細胞體積慢慢增大，卵黃繼續(xù)沉積，逐漸出現油球(圖4C)，培育至第30天時為Ⅳ期卵巢，卵母細胞進一步增大，細胞核極化，油球數量增加、變大(圖4D)。

圖4 大口黑鱸卵巢組織切片觀察Fig.4 Observation of ovarian tissue section of M.salmoides

2.3 室外培育大口黑鱸血清性激素表達

室外池塘培育期間大口黑鱸血清T水平呈上升趨勢(圖5)，對照組大口黑鱸血清T水平在1.45～3.13 nmol/L之間；控溫組大口黑鱸血清T水平低于對照組，最低為1.05 nmol/L，在室外池塘培育至第15天，血清T水平上升極其緩慢，后顯著上升至最高2.54 nmol/L。對照組大口黑鱸血清E2水平呈先緩慢上升后快速上升趨勢，其水平為120.28～223.07 ng/L(圖6)；而控溫組大口黑鱸血清E2水平在室外池塘培育期間呈緩慢上升趨勢，水平在76.04～118.95 ng/L之間。在室外池塘培育期間對照組大口黑鱸血清T水平高于控溫組，E2水平也高于控溫組且第30天存在顯著性差異。

圖5 雄性大口黑鱸血清中睪酮(T)含量變化Fig.5 Changes of serum testosterone(T)content in male M.salmoides

圖6 雌性大口黑鱸血清中雌二醇(E2)含量變化Fig.6 Changes of estradiol(E2)content in serum of female M.salmoides

2.4 大口黑鱸室內低溫培育及反季節(jié)繁殖

室內低溫培育期間大口黑鱸性腺指數(GSI)變化如表1所示。對照組雄性大口黑鱸GSI從0.85%增加至0.90%，控溫組雄性大口黑鱸GSI從0.60%增加至0.80%，對照組和控溫組之間不存在顯著性差異；對照組雌性大口黑鱸GSI從12.22%增加至13.42%，控溫組雌性大口黑鱸GSI從9.03%增加至10.23%，對照組雌性大口黑鱸GSI顯著高于控溫組。組織學表明，室內培育初對照組大口黑鱸精巢內存在大量精子(圖7C)，培育至第30天時，精巢仍處于Ⅴ期，精巢內精子染色較深(圖7D)；而室內培育初控溫組大口黑鱸精小葉內存在不同時期精母細胞和精子(圖7A)，培育至第30天時仍處于Ⅳ期(圖7B)。卵巢內細胞變化較小，室內培育初對照組大口黑鱸卵巢處于Ⅳ期末至Ⅴ期初(圖7E)，控溫組大口黑鱸卵巢處于Ⅳ期初，周圍還存在Ⅲ時相卵母細胞正在發(fā)育(圖7G)，培育至第30天時，對照組大口黑鱸卵巢內主要以Ⅴ時相卵母細胞為主(圖7F)，控溫組大口黑鱸卵巢處于Ⅳ期末，其周圍也存有少量Ⅲ時相卵母細胞(圖7H)。

圖7 控溫期大口黑鱸性腺組織切片觀察Fig.7 Observation of gonad tissue section of the first instar M.salmoides during the temperature control period

對照組大口黑鱸室內低溫培育30 d后升溫至20 ℃開始產卵，控溫組大口黑鱸室內低溫培育60 d后升溫至20 ℃開始產卵，結果如表2所示?？販亟M大口黑鱸總產卵量、受精率高于對照組，孵化率則相反，但二者均不存在顯著性差異。

表2 大口黑鱸反季節(jié)繁殖Tab.2 M.salmoides breed off-season

3 討論

3.1 溫度對大口黑鱸性腺發(fā)育及性激素表達的影響

已有研究報道，溫度、激素、營養(yǎng)、pH等是影響魚類性腺發(fā)育的關鍵因素，其中溫度是通過啟動下丘腦-垂體-性腺軸的生理功能來發(fā)揮作用并調控性腺發(fā)育、影響精卵細胞的增殖生長和成熟過程[21，22]。在本研究中，室外池塘培育期間對照組(平均水溫14.2 ℃)和控溫組(平均水溫8.5 ℃)大口黑鱸GSI均呈上升趨勢，組織學顯示對照組大口黑鱸卵巢從Ⅲ期末培育至第30天時已達Ⅴ期，而控溫組大口黑鱸卵巢從Ⅲ期中培育至第30天時卵巢發(fā)育至Ⅳ期，這是由于降低溫度導致控溫組大口黑鱸性腺發(fā)育較慢。其中室外池塘培育期間對照組雌性大口黑鱸GSI從17.7 ℃開始顯著上升，MARTYNIUK等[23]表明水溫達到16.1 ℃時野生大口黑鱸性腺開始發(fā)育，GSI顯著上升；BROWN等[24]研究發(fā)現在美國中西部地區(qū)，水溫達到13.9 ℃時大口黑鱸性腺開始發(fā)育，15 ℃以上GSI顯著上升；崔慶奎等[20]在華中地區(qū)池塘養(yǎng)殖大口黑鱸的研究中發(fā)現，從11.0 ℃開始卵巢中逐漸以Ⅲ時相卵子為主，性腺開始發(fā)育，至15 ℃時GSI顯著上升，以上研究均表明大口黑鱸性腺發(fā)育的臨界溫度為15 ℃。本研究推測寧夏地區(qū)適宜控制大口黑鱸性腺發(fā)育的水溫在15 ℃以下，進一步進行大口黑鱸室內低溫[(14±1)℃]培育研究，發(fā)現對照組和控溫組雌性大口黑鱸GSI均僅增加了1.20%，其組織學變化特征不明顯，證實了控制水溫在該溫度范圍內能夠有效延緩大口黑鱸性腺發(fā)育。

在硬骨魚類研究中表明，性類固醇激素(T和E2)在性腺發(fā)育成熟過程中起重要的調節(jié)作用，其表達變化與GSI密切相關[25]。本研究發(fā)現，在大口黑鱸性腺發(fā)育過程中，T和E2表達水平與GSI變化均呈現上升趨勢，且產卵前對照組大口黑鱸血清性激素與性腺發(fā)育顯著增加，與BROWN等[24]的研究結果相一致。BROWN等[24]發(fā)現大口黑鱸卵巢Ⅲ期卵母細胞向Ⅳ期卵母細胞轉換時水溫與E2同步上升，在本研究中，對照組和控溫組大口黑鱸Ⅳ期卵母細胞出現分別在實驗第16天和第30天，同時間水溫與E2也在上升，但E2上升趨勢不顯著，表明魚類配子的發(fā)生受性類固醇激素產生的時間變化影響[12]。

在硬骨魚類的生殖周期中，溫度也會對魚產卵行為產生影響，其每種魚都有自己的產卵溫度閾值，在適溫范圍內溫度越高，產卵率、受精率越高。而在本研究中，對照組大口黑鱸產卵量、受精率均低于控溫組，這可能是由于前期的低溫刺激或產卵時的升溫造成的影響。

3.2 大口黑鱸反季節(jié)繁殖

不同魚類因為產卵類型及環(huán)境不同，繁殖周期和繁殖時間會有所差異，而通過溫度調控可調整其繁殖時間及周期。如稀有鯽(Gobiocyprisrarus)在自然條件下的繁殖季節(jié)為3-11月，而人工控制條件下可周年繁殖[26]；香魚(Plecoglossusaltivelis)人工繁殖時間在10-11月，通過人工調控溫度實現常年提供苗種、周年養(yǎng)殖[27]。通過溫度調控也可使大口黑鱸繁殖時間與周期發(fā)生變化，HUSSEIN等[28]發(fā)現，華中地區(qū)大口黑鱸自然產卵為5月份，將自然產卵后的大口黑鱸轉入水泥池用水庫深層水(9～12 ℃)培育，使大口黑鱸Ⅱ期卵巢延緩了90天，升溫至20 ℃后在秋季的9、10月二次產卵；MATTHEWS等[29]報道，大口黑鱸在佛羅里達州產卵時間為春季，利用控溫設備調控水溫，先降溫，再維持低溫(10～12 ℃)，最后升溫至產卵溫度，在9、10月份獲得反季節(jié)苗種；崔慶奎等[20]利用地下水將大口黑鱸池塘水溫降至[(20±1)℃]，維持該水溫至產卵，在9、10月二次產卵。綜合上述研究發(fā)現，要獲得反季節(jié)苗種均需降低水溫來控制性腺發(fā)育，而本研究通過夏季在室內使用循環(huán)地下水(12～13 ℃)控溫培育30～60 d升溫至20 ℃產卵，在6、7月獲得了反季節(jié)苗種。

4 結論

本研究結果表明適宜的溫度[(14±1)℃]控制，可有效調控大口黑鱸性腺發(fā)育，實現夏秋高溫季節(jié)規(guī)?；庇绶N，解決北方地區(qū)產業(yè)結構調整所需苗種本地化和南方夏季水花苗種短缺難題。