楊立凡 田青霖 龔禹瑞 李臻園 李慶懋 李沁妍 黃立鈺 胡鳳益 秦世雯

（云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部多年生稻生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650091；#共同第一作者；*通訊作者：shiwenqin@ynu.edu.cn）

小粒野生稻（Oryza minuta）是四倍體（BBCC 基因組）、多年生的野生稻種質(zhì)資源，適應(yīng)性強(qiáng)且具有良好的稻瘟病、白葉枯病、紋枯病和稻飛虱抗性[1]。目前，研究人員已從小粒野生稻中挖掘出多個(gè)可用于栽培稻遺傳改良的抗性、產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)優(yōu)異基因[2]。研究還發(fā)現(xiàn)，小粒野生稻比栽培稻具有更為豐富的內(nèi)生細(xì)菌多樣性[3]。說(shuō)明小粒野生稻的遺傳基礎(chǔ)和微生態(tài)對(duì)其環(huán)境和脅迫適應(yīng)性起到重要作用。

植物內(nèi)生菌是一類(lèi)定殖于植物體內(nèi)的微生物資源，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要影響[4]。植物內(nèi)生細(xì)菌通過(guò)固氮、溶磷、解鉀、分泌植物生長(zhǎng)激素、鐵載體、ACC 脫氨酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid deaminase）、抗生素或激發(fā)子等來(lái)提高植物營(yíng)養(yǎng)吸收、促進(jìn)生長(zhǎng)、抑制病原菌和誘導(dǎo)植物系統(tǒng)性抗性[5-9]。此外，研究表明，將干旱、寒冷、高溫、鹽堿和污染等環(huán)境下生長(zhǎng)的植物進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌分離，回接到寄主或非寄主植物中，可以顯著提高植物在逆境條件下的生長(zhǎng)[10-14]。因此，植物內(nèi)生細(xì)菌在植物保護(hù)、綠色可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展、生態(tài)環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域具有重要的研究意義和應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。內(nèi)生細(xì)菌作為小粒野生稻微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)其挖掘和功能研究尚少。

多年生稻是種植一次可以連續(xù)收獲多年（季）的新型稻作品種[15]。相對(duì)于一年生水稻，多年生稻從第2 季起，在稻作生產(chǎn)過(guò)程中不再需要買(mǎi)種、育秧、犁田、耙田、移栽等生產(chǎn)環(huán)節(jié)，而只需要田間管理和收獲2 個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)，節(jié)約了人工投入、降低了勞動(dòng)強(qiáng)度。多年生稻進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)需采取合適的施肥手段才能保證良好的土壤結(jié)構(gòu)以保障其生長(zhǎng)發(fā)育。綠色、友好、無(wú)殘留的微生物菌肥可滿(mǎn)足多年生稻綠色輕簡(jiǎn)化的生產(chǎn)模式，提高多年生稻抗病蟲(chóng)能力、避免土壤結(jié)構(gòu)惡化和環(huán)境污染。因此，本研究分離小粒野生稻的內(nèi)生細(xì)菌，挖掘具有對(duì)多年生稻促生能力的細(xì)菌資源，為小粒野生稻微生態(tài)功能研究和多年生稻微生物菌肥開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小粒野生稻（Oryza minuta）、多年生稻秈稻品種云大107 和粳稻品種PR23 均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部多年生稻生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 內(nèi)生細(xì)菌的分離純化

分別剪取小粒野生稻健康的根、莖和葉組織，無(wú)菌水沖洗表面污漬。組織表面消毒采用75%酒精浸泡2～5 min，無(wú)菌水漂洗1 次，2.5%次氯酸鈉浸泡2～4 min，無(wú)菌水漂洗3 次。組織研磨后，將研磨液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?0-2～10-5），取100 μL 稀釋液涂布于NA 培養(yǎng)基[16]。吸取第3 次漂洗液涂布至NA 培養(yǎng)基，用來(lái)檢測(cè)組織表面消毒是否徹底。28 ℃黑暗倒置培養(yǎng)1～3 d，待細(xì)菌菌落長(zhǎng)出，挑取形態(tài)不同的細(xì)菌菌落進(jìn)行純化和保存。

1.3 內(nèi)生菌促生功能測(cè)定

1.3.1 溶磷能力測(cè)定

在無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基[17]和有機(jī)磷培養(yǎng)基[18]上放置滅菌濾紙片，每個(gè)濾紙片上接種5 μL 菌液（OD600nm=1.0），以接種5 μL 的NB 培養(yǎng)液作為對(duì)照，28 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d后觀察是否形成透明圈。根據(jù)透明圈直徑和菌落圈直徑的比值（mP值）評(píng)估菌株的溶磷能力。

1.3.2 固氮作用檢測(cè)

采取劃線法，在Ashby 培養(yǎng)基[19]上接種內(nèi)生細(xì)菌，以NB 培養(yǎng)液作為對(duì)照，28 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，將能夠穩(wěn)定生長(zhǎng)的菌株視為固氮菌。利用引物ZehrF（5’-TGYGAYCCNAARGCNGA-3’）和ZehrR（5’-NDGCCATCATYTCNCC-3’）對(duì)菌株的固氮酶基因nifH 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后測(cè)序。

1.3.3 產(chǎn)鐵載體能力測(cè)定

在鉻天青（CAS）培養(yǎng)基[20]上放置滅菌濾紙片，每個(gè)濾紙片上接種5 μL 菌液（OD600nm=1.0），以接種5 μL 的NB 培養(yǎng)液作為對(duì)照，28 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d 后觀察是否有橙黃色變色圈，根據(jù)變色圈直徑和菌落圈直徑的比值（mP值）評(píng)估菌株的產(chǎn)鐵載體能力。

1.3.4 產(chǎn)吲哚乙酸能力測(cè)定

定性分析采用比色法[21]，將菌株接種至King B 培養(yǎng)基[22]中，28 ℃、120 r/min 振蕩培養(yǎng)2 d。吸取等體積菌懸液和Salkowski’s 試劑[23]于白色點(diǎn)滴板上，陽(yáng)性對(duì)照為50 mg/L 吲哚乙酸（indole-3-acetic acid, IAA），陰性對(duì)照為King B 培養(yǎng)基。避光30 min 后觀察其顏色變化，呈現(xiàn)粉紅色說(shuō)明菌株能產(chǎn)生IAA。

IAA 定量測(cè)定：配制濃度為10～60 mg/L 的IAA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別與Salkowski’s 試劑等體積混合，25 ℃避光反應(yīng)30 min，測(cè)定OD530nm值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將上述定性測(cè)定中具有產(chǎn)IAA 功能的菌株接種于King B培養(yǎng)基中，設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)48 h后，10 000 r/min 離心。取上清液與Salkowski’s 顯色劑等體積混合，25 ℃避光反應(yīng)30 min，測(cè)定OD530nm值。King B 培養(yǎng)基與Salkowski’s 試劑等體積混合為空白對(duì)照。根據(jù)IAA 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0195x-0.0129，R2=0.9953 計(jì)算菌株的IAA 產(chǎn)量。

1.4 菌株的形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定

將菌株在NA 平板上37 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察單菌落形態(tài)特征。菌株在NB 培養(yǎng)基中，37 ℃、200 rpm 振蕩培養(yǎng)16～24 h 后進(jìn)行革蘭氏染色和菌體形態(tài)特征觀察。利用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株DNA后，進(jìn)行16S rRNA 序列（引物序列為：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）和gyrB 基因（引物序列為5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3’和5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3’）的PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物測(cè)序后在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blastn 比對(duì)。利用MEGA 11 軟件的最大似然法（Maximum Likelihood），與NCBI 中相似性高的菌株構(gòu)建16S rRNA 與gyrB 串聯(lián)拼接序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap 值為1000。

1.5 促生效果測(cè)定

選取健康一致的多年生稻品種PR23 和云大107種子，用75%酒精洗2 次，每次5 min，15%次氯酸鈉洗3 次，每次8 min 進(jìn)行消毒。浸種處理：108cfu/mL 的菌株懸液浸泡種子12 h，對(duì)照以無(wú)菌水進(jìn)行浸泡，然后催芽至露白，隨后播種于苗盤(pán)中，每穴9 粒種子，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。拌土處理：將30 mL 108cfu/mL 的菌株懸液與500 g 滅菌土中混合均勻，放置于苗盆中，將催芽至露白的種子播種于苗盤(pán)中，每穴9 粒種子，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。待多年生稻長(zhǎng)至4 葉期時(shí)測(cè)量其株高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量、葉綠素和氮素含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 17 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以單因素方差分析和Duncan’s 法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)差異顯著性，利用Graphpad Prism 8.0 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小粒野生稻內(nèi)生細(xì)菌的分離和純化

通過(guò)組織分離法和菌種純化，從小粒野生稻的根、莖和葉部中分別獲得40、20 和25 株內(nèi)生細(xì)菌菌株，共計(jì)85 株。根部分離獲得的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量多于葉部和根部，這可能是由于土壤根際效應(yīng)使得根部相較于其他組織內(nèi)生細(xì)菌的種類(lèi)和數(shù)量較多。

2.2 內(nèi)生細(xì)菌的溶磷能力

具有溶磷效果的內(nèi)生細(xì)菌可以將無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷培養(yǎng)基中難溶性磷轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄粤?，使得菌落周?chē)霈F(xiàn)明顯的透明圈（圖1A 和1D）。本研究獲得21 株具有溶解無(wú)機(jī)磷能力的細(xì)菌菌株，mp值在1.10～1.73 范圍（圖1B），22 株具有溶解有機(jī)磷能力的細(xì)菌菌株（圖1E），mp值在1.10～2.05 范圍。統(tǒng)計(jì)分析顯示，莖部分離到的內(nèi)生細(xì)菌溶解無(wú)機(jī)磷能力高于其他組織的內(nèi)生細(xì)菌（圖1C）。

圖1 具有溶磷能力的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量及其mp 值

2.3 內(nèi)生細(xì)菌的固氮作用

利用Ashby 固氮培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，共有19 個(gè)內(nèi)生細(xì)菌菌株可穩(wěn)定生長(zhǎng)（圖2A 和2B），說(shuō)明其具有固氮功能。通過(guò)固氮酶基因nifH 的PCR 擴(kuò)增和測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，其中15 個(gè)菌株具有固氮酶基因nifH（圖2C），說(shuō)明這15 個(gè)菌株可以通過(guò)nifH 基因進(jìn)行固氮作用，而未擴(kuò)增出nifH 基因的4 個(gè)菌株可能通過(guò)其他機(jī)制進(jìn)行固氮。

圖2 具有固氮作用的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量及其固氮酶基因nifH 的擴(kuò)增

2.4 內(nèi)生細(xì)菌的產(chǎn)鐵載體能力

利用藍(lán)色的鉻天青培養(yǎng)基（CAS）對(duì)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，29 株的內(nèi)生細(xì)菌周?chē)尸F(xiàn)明顯的橙黃色變色圈（圖3A 和3B），mp值在1.09～4.57 范圍（圖3C），說(shuō)明其具有產(chǎn)鐵載體的能力。統(tǒng)計(jì)比較顯示根、莖和葉部分離的內(nèi)生細(xì)菌的產(chǎn)鐵載體mp值無(wú)顯著差異（圖3C）。

圖3 產(chǎn)鐵載體內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量及其mP 值

2.5 內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)吲哚乙酸能力

利用IAA 顯色反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，共有13 株內(nèi)生細(xì)菌在30 min 后使反應(yīng)液呈現(xiàn)粉紅色（圖4 A 和4 B），說(shuō)明其具有產(chǎn)IAA 功能。通過(guò)定量測(cè)定，13 株內(nèi)生細(xì)菌的IAA 分泌量在0.12～17.22 mg/L 范圍（圖4 C）。其中分離自根部的OMR2-3 菌株和分離自葉部的OML3-4 菌株IAA 分泌量顯著高于其他菌株，分別為17.22 mg/L 和16.59 mg/L，說(shuō)明其具有較高的IAA 分泌能力。

圖4 小粒野生稻中產(chǎn)吲哚乙酸菌株的數(shù)量及產(chǎn)量

2.6 OMR2-3 和OML3-4 菌株的鑒定

選取高產(chǎn)IAA、鐵載體和固氮的OMR2-3 菌株和高產(chǎn)IAA、溶磷和固氮的OML3-4 菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OMR2-3 菌株屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，桿狀，菌體大小為（0.8～1.0）μm×（2.0～3.0）μm（圖5 A）；在NA 培養(yǎng)基上單菌落為淡黃色，圓形，無(wú)凸起，表面光滑，邊緣整齊，菌落大小為4～5 mm（圖5 B）；OMR2-3 菌株與陰溝腸桿菌ATCC 13047 菌株的16S rRNA 和gyrB 基因序列相似性最高，分別為98.11%和97.26%，并與陰溝腸桿菌134B5 菌株同處一個(gè)進(jìn)化分支（圖5 C），鑒定為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）。OML3-4 菌株屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，桿狀，菌體大小為（0.8～1.0）μm×（4.0～5.0）μm（圖6A）；在NA 培養(yǎng)基上單菌落為乳白色，圓形，無(wú)凸起，表面光滑，邊緣整齊，菌落大小為2.0～3.0 mm（圖6 B）。OMR3-4 菌株與路德維希腸桿菌WAB1946 菌株的16S rRNA 和gyrB 基因序列相似性最高，分別為99.58%和98.7%，并同處于一個(gè)進(jìn)化分支（圖6 C），鑒定為路德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigii）。

圖5 陰溝腸桿菌OMR2-3 菌株鑒定及進(jìn)化系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖6 路德維希腸桿菌OML3-4 菌株鑒定及進(jìn)化系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.7 OMR2-3 和OML3-4 菌株對(duì)多年生稻的促生效果

進(jìn)行菌株浸種及拌土處理后，多年生稻栽種至4葉期時(shí)發(fā)現(xiàn)，OML3-4 和OMR2-3 菌株對(duì)多年生稻粳型品種PR23 和秈型品種云大107 均具有促生效果（圖7）。OMR2-3 菌株浸種處理可顯著提高PR23 的株高、根長(zhǎng)、鮮物質(zhì)量、葉綠素和氮素含量；而拌土處理對(duì)PR23 無(wú)明顯促生效果。OML3-4 菌株浸種處理可顯著提高PR23 的根長(zhǎng)和葉綠素含量，拌土處理可顯著提高PR23 株高、根長(zhǎng)、鮮物質(zhì)量、葉綠素和氮素含量（表1）。OMR2-3 菌株浸種處理可顯著提高云大107 的鮮物質(zhì)量、葉綠素和氮素含量，拌土處理可顯著提高云大107的根長(zhǎng)、鮮物質(zhì)量、葉綠素和氮素含量。OML3-4 菌株浸種和拌土處理均可顯著提高云大107 的根長(zhǎng)、鮮物質(zhì)量、葉綠素和氮素含量（表1）。以上結(jié)果說(shuō)明，陰溝腸桿菌OMR2-3 菌株和路德維希腸桿菌OML3-4 菌株能夠促進(jìn)多年生稻的細(xì)胞伸長(zhǎng)、光合作用和生物量積累。

表1 陰溝腸桿菌OMR2-3 菌株和路德維希腸桿菌OML3-4 菌株對(duì)多年生稻PR23 和云大107 的促生效果

圖7 陰溝腸桿菌OMR2-3 菌株和路德維希腸桿菌OML3-4菌株對(duì)多年生稻的促生效果

3 結(jié)論與討論

內(nèi)生菌是植物微生態(tài)的重要組成部分，遍布在植物組織內(nèi)，與宿主形成緊密的互利共生關(guān)系。內(nèi)生菌通過(guò)固氮作用、促進(jìn)有機(jī)和無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)（磷、鐵和鉀）的吸收、產(chǎn)生植物激素（吲哚乙酸、生長(zhǎng)素、赤霉素等）等機(jī)制直接促進(jìn)寄主的生長(zhǎng)[24-27]。本研究從小粒野生稻中共篩選到具有溶磷能力內(nèi)生細(xì)菌43 株，固氮內(nèi)生細(xì)菌19 株，產(chǎn)鐵載體內(nèi)生細(xì)菌29 株，產(chǎn)IAA 內(nèi)生細(xì)菌13株，分別占總分離菌株數(shù)量的50.6%、22.3%、34.1%和15.3%。已有研究從澳洲野生稻[28]、尼瓦拉野生稻[29]、南方野生稻[22]、藥用野生稻[30]和普通野生稻[31]中篩選到具有以上促生功能的內(nèi)生細(xì)菌。說(shuō)明野生稻蘊(yùn)含豐富的內(nèi)生細(xì)菌資源，可作為微生物肥料和微生物菌劑開(kāi)發(fā)的重要菌種篩選來(lái)源。

野生稻內(nèi)生細(xì)菌能有效定殖于不同栽培稻和多年生稻品種，通過(guò)菌株特異性調(diào)控機(jī)理促進(jìn)寄主生長(zhǎng)。普通野生稻（O. rufipogon）內(nèi)生無(wú)丙二酸檸檬酸桿菌（Citrobacter amalonaticus）具有固氮功能，顯著提高秈型水稻華航1 號(hào)株高和鮮物質(zhì)量[32]。藥用野生稻（O. officinalis）內(nèi)生細(xì)菌克雷伯菌（Klebsiella variicola）具有固氮、產(chǎn)IAA 和鐵載體能力，顯著提高水稻中嘉早17 號(hào)的分蘗數(shù)、株高和葉綠素含量[33]。本研究從小粒野生稻中篩選到具有固氮作用、產(chǎn)鐵載體和IAA 的陰溝腸桿菌OMR2-3 菌株，以及具有溶磷、固氮和產(chǎn)IAA 的路德維希腸桿菌OML3-4 菌株，其對(duì)多年生稻PR23 和云大107 的株高、根長(zhǎng)、鮮物質(zhì)量、葉綠素和氮素含量具有不同程度的促進(jìn)作用。目前研究還發(fā)現(xiàn)，陰溝腸桿菌和路德維希腸桿菌分別對(duì)煙草[34]和小麥[35]也具有促生作用。因此深入研究野生稻內(nèi)生細(xì)菌介導(dǎo)的促生效應(yīng)，將有助于定向改善水稻對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性及其生產(chǎn)力，為水稻生物育種及增產(chǎn)提供新途徑。

植物種子內(nèi)生菌群是建立植物內(nèi)生菌群的基礎(chǔ)，種子內(nèi)生菌群能夠隨著種子萌發(fā)轉(zhuǎn)移至幼苗，促進(jìn)寄主生長(zhǎng)發(fā)育[36]。本研究采用菌株浸種和拌土方法來(lái)構(gòu)建多年生稻種子內(nèi)生菌群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OMR2-3 菌株拌土處理對(duì)多年生稻PR23 無(wú)顯著促生作用，可能是由于土壤微生物的稀釋效應(yīng)[37]對(duì)OMR2-3 菌株的運(yùn)動(dòng)和定殖起到了負(fù)面影響。因此，針對(duì)不同菌株需采取適宜的接種方法，建立多年生稻生態(tài)菌肥的播種和田間管理措施，精準(zhǔn)培育“多年生稻-微生物共生體”。本研究?jī)H進(jìn)行了2 株菌株的多年生稻促生效果評(píng)價(jià)，后續(xù)還需挖掘更多的多年生稻促生菌株，深入分析促生菌株的大田長(zhǎng)期效應(yīng)及對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)的影響，構(gòu)建多年生稻“促生微生物組”，助力多年生稻綠色輕簡(jiǎn)化生產(chǎn)。