程相寧,張 韻,何佳蔚,陳政錕,金美蘭,丁紅雷*,王慶華*

(1.西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物支原體學(xué)實(shí)驗(yàn)室,重慶 400715;2.西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,重慶 400715)

白色念珠菌(Candidaalbicans)又名白假絲酵母菌,是廣泛存在于人和動(dòng)物皮膚、口腔、上呼吸道等處的一種條件性致病真菌[1]。家禽的白色念珠菌病又稱霉菌性口炎,俗稱鵝口瘡,多見(jiàn)于幼齡雞、鴿、火雞和鵝,表現(xiàn)為上消化道黏膜形成白色假膜,甚至出現(xiàn)潰瘍[2];造成患禽脾、胸腺、哈德氏腺、法氏囊、骨髓等免疫器官萎縮,引起免疫抑制,進(jìn)而容易導(dǎo)致其它病原的繼發(fā)感染[3]。人和哺乳動(dòng)物較少發(fā)病。

禽白色念珠菌病是一種條件性疾病,當(dāng)菌群失調(diào)或宿主抵抗力較弱時(shí),以及飼養(yǎng)管理不善和飼養(yǎng)環(huán)境差就會(huì)發(fā)生;以幼齡禽多發(fā),成年禽亦有發(fā)生。該病發(fā)生以夏秋炎熱多雨季節(jié)為甚。病禽和帶菌禽是主要傳染來(lái)源。病原通過(guò)分泌物、排泄物污染飼料、飲水經(jīng)消化道感染。整體發(fā)病率不高,國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。但近年來(lái)鴿白色念珠菌病的發(fā)生在我國(guó)呈上升趨勢(shì),給養(yǎng)鴿業(yè)帶來(lái)極大經(jīng)濟(jì)損失。雛鴿感染主要是通過(guò)帶菌親鴿的“鴿乳”而傳染。2020年10月,重慶某鴿場(chǎng)出現(xiàn)大批幼鴿喉頭被黃色干酪樣物堵塞無(wú)法進(jìn)食,最終導(dǎo)致死亡的現(xiàn)象。本課題組采集樣品后進(jìn)行了病原分離鑒定、人工感染試驗(yàn)及藥物敏感性測(cè)定,找到了引起該鴿場(chǎng)雛鴿發(fā)病的病原,為該鴿場(chǎng)此類傳染病的防控提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料采集

重慶某鴿場(chǎng)1～3周齡幼鴿出現(xiàn)喉頭被干酪樣物阻塞導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)食、最終死亡的現(xiàn)象。在該鴿場(chǎng)取5只有上述典型癥狀的幼鴿帶回實(shí)驗(yàn)室。用乙醚將鴿子麻醉后剪開(kāi)頸部左側(cè)動(dòng)脈放血,至血液流干凈后待下一步解剖處理。

1.2 主要試劑、培養(yǎng)基及參考菌株

快速DNA提取檢測(cè)試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;3-(N-嗎啡啉)丙磺酸-游離酸(3-(N-Morpholino) propane-sulfonic acid,MOPS)、2×SanTaqMaster Mix購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;革蘭染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;乳酸酚棉藍(lán)染色液購(gòu)自北京酷來(lái)搏科技有限公司;胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;氟苯尼考購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;灰黃霉素、培氟沙星購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;水溶性兩性霉素B、制霉菌素、克霉唑購(gòu)自南京都萊生物技術(shù)有限公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂(Yeast extract peptone dextrose agar,YEPD)培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室制備。白色念珠菌CMCC(F)98001菌株購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 病原分離

無(wú)菌操作取病鴿喉頭、嗉囊、腺胃、肌胃、心、肺、肝、腎、脾,以接種環(huán)輕刮病鴿的嗉囊、腺胃、肌胃內(nèi)表面以及無(wú)菌切開(kāi)的喉頭干酪樣物、心、肺、肝、腎、脾內(nèi)部,劃線接種含1%慶大霉素PDA平板,28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 d,每天觀察菌落生長(zhǎng)情況;待長(zhǎng)出菌落后用接種環(huán)挑取平板上單個(gè)菌落再次劃線接種含1%慶大霉素PDA平板進(jìn)行純培養(yǎng),3 d后觀察菌落形態(tài),并挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色和棉藍(lán)染色(根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作),染色后在400倍顯微鏡下鏡檢。

1.4 病原的分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)鏡檢結(jié)果,挑取對(duì)應(yīng)的單菌落接種YEPD液體培養(yǎng)基,30 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)20 h。取1 mL菌液置于1.5 mL離心管,10 000 r·min-1室溫離心1 min,棄上清,沉淀用快速DNA提取檢測(cè)試劑盒提取分離菌株基因組,制備DNA模板。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4]設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物CaF:5′-TTTATCAACTTGTCACACCAG-3′和CaR:5′-ATCCCGCCTTACCACTACCG-3′。PCR反應(yīng)體系:2×SanTaqPCR mix 12.5 μL,CaF、CaR各1 μL(10 mmol·L-1),ddH2O 9.5 μL,模板1 μL。反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增的目的片段為白色念珠菌rDNA基因間轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列。擴(kuò)增的片段送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步進(jìn)行BLAST序列比對(duì)。

1.5 芽管生成試驗(yàn)

于載玻片上滴加5 μL胎牛血清,用接種環(huán)挑取單菌落與血清混合均勻,蓋上蓋玻片,37 ℃培養(yǎng),每小時(shí)在顯微鏡下鏡檢,3 h內(nèi)觀察到芽管生成判定為芽管生成陽(yáng)性。

1.6 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

21只3日齡健康雛雞購(gòu)自重慶某種雞場(chǎng),經(jīng)病原學(xué)檢測(cè)為白色念珠菌陰性。隨機(jī)取14只為試驗(yàn)組,其余7只為對(duì)照組。取分離菌CAL2020P8接種20 mL YEPD液體培養(yǎng)基,30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)20 h,用滅菌PBS將菌液濃度調(diào)整為1×107CFU·mL-1,以1 mL·只-1的劑量嗉囊接種試驗(yàn)組雞,對(duì)照組嗉囊注射等量滅菌PBS。兩組雞隔離,常規(guī)飼養(yǎng)。接種后每天觀察雞的精神、飲食、糞便等情況。每3 d宰殺試驗(yàn)組雞2只與對(duì)照組雞1只。按“1.3”的方法取嗉囊和肝等組織分離病原。取每只雞的嗉囊、肝、腎,保存于40 mL·L-1甲醛固定液中,送成都里來(lái)生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心制作組織切片,并將切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色與高碘酸-希夫染色(periodic acid-Schiff,PAS)染色,顯微鏡下觀察組織學(xué)病變和病原生長(zhǎng)情況。

1.7 藥物敏感性試驗(yàn)

根據(jù)《肉湯稀釋法抗真菌敏感性試驗(yàn)參考方法(第四版)》(CLSI M27-A4)[5],采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)分離菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性。使用的抗真菌藥物包括兩性霉素B、制霉菌素、灰黃霉素和克霉唑,抗細(xì)菌藥物包括氟苯尼考和培氟沙星。兩性霉素B耐藥折點(diǎn)按《抗真菌藥敏試驗(yàn)的流行病學(xué)臨界值(第三版)》(CLSI M59)[6]耐藥折點(diǎn)判讀,制霉菌素和克霉唑耐藥折點(diǎn)根據(jù)文獻(xiàn)[7-8]給定的耐藥折點(diǎn)耐藥折點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 菌株分離鑒定

病鴿的喉頭被黃色干酪樣物堵塞(圖1),造成其無(wú)法吞咽食物和水。其他組織器官無(wú)肉眼可見(jiàn)的病變。在5只病鴿的喉頭干酪樣物分離到5株菌,命名為CAL2020P1～CAL2020P5;在嗉囊分離到3株菌,命名為CAL2020P6～CAL2020P8。在腺胃、肌胃、心、肺、肝、腎、脾中未分離到病原。

圖1 患鴿喉頭被干酪樣物堵塞Fig.1 The larynx of the affected pigeon is blocked by caseous substance

分離的菌株使用白色念珠菌特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,所有分離株均能擴(kuò)增出與預(yù)期片段大小相同的約500 bp的片段(圖2)。擴(kuò)增的rDNA基因間轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列測(cè)序后進(jìn)行BLAST序列比對(duì),所有菌株擴(kuò)增片段的核苷酸序列完全一致,且與白色念珠菌rDNA基因間轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列最為相似(圖3),其中與白色念珠菌44(GenBank accession number:OP627169.1)的序列完全一致,與其它白色念珠菌,如Gm(GenBank accession number:OP629553.1)、29_v9g_F(GenBank accession number:OP601587.1)、J115(GenBank accession number:OP824698.1)等的rDNA基因間轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列的相似性也超過(guò)98.5%。

M.DNA marker;1.陽(yáng)性對(duì)照CMCC(F)98001;2.陰性對(duì)照;3.CAL2020P1;4.CAL2020P2;5.CAL2020P3;6.CAL2020P4;7.CAL2020P5;8.CAL2020P6;9.CAL2020P7;10.CAL2020P8M.DNA marker; 1.Positive control CMCC(F)98001;2.Negative control;3.CAL2020P1; 4.CAL2020P2; 5.CAL2020P3; 6.CAL2020P4; 7.CAL2020P5; 8.CAL2020P6; 9.CAL2020P7; 10.CAL2020P8圖2 PCR擴(kuò)增白色念珠菌rDNA基因間轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列Fig.2 Amplification of the intergenic transcriptional spacer sequence of rDNA gene from Candida albicans by PCR

圖3 分離菌rDNA基因間轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic trees of the isolated bacteria based on intergenic transcriptional spacer sequence of rDNA

分離菌株在含1%慶大霉素PDA平板上生長(zhǎng)為乳白色、不透明、邊緣呈放射狀的菌落(圖4A、B)。對(duì)分離菌株進(jìn)行革蘭染色,病原菌在400倍顯微鏡下呈卵圓形、黑色或粉紫色著色不均勻的革蘭陽(yáng)性酵母樣菌體, 有些長(zhǎng)出芽體(圖4C);棉藍(lán)染色顯示菌體長(zhǎng)出長(zhǎng)長(zhǎng)的菌絲(圖4D)和孢子(圖4D,a)。所有分離菌在胎牛血清中孵育3 h內(nèi),在顯微鏡下均觀測(cè)到芽管生成(圖4E)。

A和B. 白色念珠菌在含1%慶大霉素PDA平板的菌落形態(tài);C. 白色念珠菌革蘭染色后的真菌形態(tài);D. 白色念珠菌棉藍(lán)染色后的孢子和菌絲形態(tài)(a. 白色念珠菌的孢子和菌絲形態(tài);b. 白色念珠菌的菌絲形態(tài));E. 白色念珠菌形成的芽管(a. 孵育1 h;b. 孵育2 h;c. 孵育3 h)A and B. Colony morphology of Candida albicans on PDA plate containing 1% gentamicin; C. Fungal morphology of Candida albicans after Gram staining; D. Morphology of spores and hyphae of Candida albicans after cotton blue staining (a. Morphology of spores and hyphae of Candida albicans; b. Morphology of hyphae of Candida albicans); E. Germ tubes of Candida albicans (a. Incubate for 1 h; b. Incubate for 2 h; c. Incubate for 3 h)圖4 白色念珠菌CAL2020P8的菌落形態(tài)、真菌形態(tài)及芽管生成Fig.4 Colony morphology, fungal morphology and germ tube formation of Candida albicans strain CAL2020P8

根據(jù)分子生物學(xué)鑒定結(jié)果、菌落形態(tài)和真菌形態(tài)、生化特性,確定分離的病原為白色念珠菌。

2.2 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

試驗(yàn)組雞在接種菌株CAL2020P8后第3天出現(xiàn)采食量下降,嗉囊觸之較為堅(jiān)硬;隨著感染時(shí)間延長(zhǎng),上述癥狀逐漸加重;在感染后第9天癥狀最嚴(yán)重,之后逐漸減輕;從第12天開(kāi)始,部分雞的臨床癥狀逐漸消失,至第21天所有雞的臨床癥狀均消失。未接種病原的對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)任何臨床癥狀。在感染后的第3、6、9、12、15、18、21天每天宰殺試驗(yàn)組雞2只和對(duì)照組雞1只,進(jìn)行剖檢。結(jié)果可見(jiàn)在感染第9天病變最為嚴(yán)重,嗉囊明顯增厚、上有白色物質(zhì)附著(圖5);感染第12天后病變逐漸減輕且在感染第21天消失。

A. 對(duì)照組雞的嗉囊;B. 試驗(yàn)組雞的嗉囊A. Crop of chicken from control group; B. Crop of chicken from tested group圖5 雞接種白色念珠菌第9天的嗉囊病變Fig.5 Crop lesions of chicken inoculated with Candida albicans on the 9th day

2.3 組織切片染色與觀察

將人工感染后第3、6、9、12、15、18、21天的嗉囊、肝、腎制作組織切片,分別進(jìn)行HE染色和PAS染色。肝、腎的HE切片未見(jiàn)任何病變,PAS染色也未見(jiàn)白色念珠菌感染。嗉囊HE染色的結(jié)果顯示:感染第3天時(shí)表皮角質(zhì)層開(kāi)始脫落(圖6A、F);感染第6天時(shí)表皮的鱗狀上皮細(xì)胞開(kāi)始變性壞死、脫落(圖6B、G);感染第9天時(shí)表皮鱗狀上皮細(xì)胞變性壞死現(xiàn)象達(dá)到高峰(圖6C、H);感染第12天時(shí)表皮出現(xiàn)輕微結(jié)痂(圖6D、I);感染第21天時(shí)表皮基本恢復(fù),只有部分角質(zhì)層未完全恢復(fù)(圖6E、J);對(duì)照組無(wú)任何病變(圖6K～O)。

A. 感染3 d的嗉囊(20×);B. 感染6 d的嗉囊(20×);C. 感染9 d的嗉囊(20×);D. 感染12 d的嗉囊(20×);E. 感染21 d的嗉囊(20×);F. 感染3 d的嗉囊(100×);G. 感染6 d的嗉囊(100×);H. 感染9 d的嗉囊(100×);I. 感染12 d的嗉囊(100×);J. 感染21 d的嗉囊(100×);K. 灌服PBS 3 d的嗉囊(20×);L. 灌服PBS 6 d的嗉囊(20×);M. 灌服PBS 9 d的嗉囊(20×);N. 灌服PBS 12 d的嗉囊(20×);O. 灌服PBS 21 d的嗉囊(20×)A. Crop after infection on day 3 (20×); B. Crop after infection on day 6 (20×); C. Crop after infection on day 9 (20×); D. Crop after infection on day 12 (20×); E. Crop after infection on day 21 (20×); F. Crop after infection on day 3 (100×); G. Crop after infection on day 6 (100×); H. Crop after infection on day 9 (100×) ; I. Crop after infection on day 12 (100×); J. Crop after infection on day 21 (100×); K. Crop on day 3 after PBS administration (20×); L. Crop on day 6 after PBS administration (20×); M. Crop on day 9 after PBS administration (20×); N. Crop on day 12 after PBS administration (20×); O. Crop on day 21 after PBS administration (20×)圖6 白色念珠菌感染雞后不同時(shí)間點(diǎn)嗉囊的組織病理變化(HE染色)Fig.6 Histopathological changes of crop in chicken infected with Candida albicans at different time points (HE staining)

PAS染色的結(jié)果顯示:感染第3天時(shí)開(kāi)始在表皮角質(zhì)層出現(xiàn)白色念珠菌菌絲(圖7A、F);隨著感染時(shí)間延長(zhǎng),菌絲數(shù)量逐漸增加(圖7B、G);在感染第9天時(shí)達(dá)到高峰(圖7C、H);之后菌絲數(shù)逐漸下降(圖7D、I),并在第21天時(shí)完全消失(圖7E、J);在對(duì)照組嗉囊未見(jiàn)白色念珠菌(圖7K～O)。

A. 感染3 d的嗉囊(20×);B. 感染6 d的嗉囊(20×);C. 感染9 d的嗉囊(20×);D. 感染12 d的嗉囊(20×);E. 感染21 d的嗉囊(20×);F. 感染3 d的嗉囊(100×);G. 感染6 d的嗉囊(100×);H. 感染9 d的嗉囊(100×);I. 感染后12 d的嗉囊(100×);J. 感染21 d的嗉囊(100×);K. 灌服PBS 3 d的嗉囊(20×);L. 灌服PBS 6 d的嗉囊(20×);M. 灌服PBS 9 d的嗉囊(20×);N. 灌服PBS 12 d的嗉囊(20×);O. 灌服PBS 21 d的嗉囊(20×)A. Crop after infection on day 3 (20×); B. Crop after infection on day 6 (20×); C. Crop after infection on day 9 (20×); D. Crop after infection on day 12 (20×); E. Crop after infection on day 21 (20×); F. Crop after infection on day 3 (100×); G. Crop after infection on day 6 (100×); H. Crop after infection on day 9 (100×) ; I. Crop after infection on day 12 (100×); J. Crop after infection on day 21 (100×); K. Crop on day 3 after PBS administration (20×); L. Crop on day 6 after PBS administration (20×); M. Crop on day 9 after PBS administration (20×); N. Crop on day 12 after PBS administration (20×); O. Crop on day 21 after PBS administration (20×)圖7 白色念珠菌感染雞后不同時(shí)間點(diǎn)嗉囊中白色念珠菌菌絲生長(zhǎng)情況(PAS染色)Fig.7 Growth of Candida albicans mycelium in crop after infection of chicken at different time points (PAS staining)

2.4 藥物敏感性結(jié)果

測(cè)定8株白色念珠菌分離株對(duì)4種抗真菌藥物和2種抗細(xì)菌藥物的敏感性。由表1可見(jiàn),分離菌株對(duì)兩性霉素B、制霉菌素、克霉唑敏感,對(duì)灰黃霉素的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)均>64 μg·mL-1,對(duì)氟苯尼考和培氟沙星的MIC均>512 μg·mL-1。

表1 白色念珠菌分離株對(duì)4種抗真菌藥物和2種抗細(xì)菌藥物的藥物敏感性Table 1 The susceptibility of 4 antifungals and 2 antimicrobials to Candida albicans isolates

2.5 白色念珠菌的再分離及鑒定

試驗(yàn)組和對(duì)照組雞剖檢后,采集喉頭干酪樣物、嗉囊進(jìn)行白色念珠菌的再分離。刮取所有感染組雞的兩個(gè)部位接種含1%慶大霉素PDA平板,均有菌長(zhǎng)出;使用白色念珠菌rDNA基因間轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列引物,在分離菌均能擴(kuò)增出270 bp左右的片段,說(shuō)明能在這些部位再次分離出白色念珠菌。而對(duì)照組的相應(yīng)部位接種1%慶大霉素PDA平板,沒(méi)有菌長(zhǎng)出。

3 討 論

白色念珠菌在自然界廣泛存在,是健康動(dòng)物上呼吸道和腸道等處的常在菌。盡管在健康和發(fā)病家禽中都分離到另外一些念珠菌,但白色念珠菌是導(dǎo)致家禽發(fā)病的最主要病原。念珠菌病又名鵝口瘡,是一種內(nèi)源性的條件性真菌病。禽類的念珠菌病最易發(fā)生在口腔和嗉囊。雞、火雞、鵝、鴿、珍珠雞、雉、翎頜松雞、鵪鶉、孔雀、吸蜜鸚鵡、小鸚鵡、鸚鵡和長(zhǎng)尾小鸚鵡都有發(fā)生過(guò)念珠菌病的報(bào)道[2,9]。家禽念珠菌病往往呈散在發(fā)生,且主要發(fā)生于幼齡禽。現(xiàn)階段我國(guó)家禽中發(fā)生念珠菌病的報(bào)道較為少見(jiàn)[10]。

根據(jù)發(fā)病鴿場(chǎng)負(fù)責(zé)人介紹,近年來(lái),我國(guó)廣東省很多養(yǎng)鴿場(chǎng)出現(xiàn)幼鴿喉頭被干酪樣物堵塞,最終導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)食而死亡的情況。而該養(yǎng)殖場(chǎng)的鴿子則購(gòu)自廣東省曾經(jīng)暴發(fā)過(guò)此類疾病的鴿場(chǎng)。根據(jù)幼鴿出現(xiàn)的臨床癥狀,作者初步懷疑該病是念珠菌病或毛滴蟲(chóng)病。

在病原的鑒定中,除了進(jìn)行常規(guī)的菌落和病原菌形態(tài)觀察,作者還通過(guò)棉藍(lán)染色確定了分離菌菌絲和孢子的存在,通過(guò)芽管生成試驗(yàn)確定了分離菌芽管的生成。根據(jù)上述結(jié)果以及此次疫情的流行病學(xué)、病鴿的臨床癥狀和病理剖檢變化,初步判定分離的病原為白色念珠菌。為了進(jìn)一步確認(rèn),作者擴(kuò)增了白色念珠菌的rDNA基因間轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列,通過(guò)序列測(cè)定確定擴(kuò)增的基因片段和白色念珠菌rDNA基因間轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列片段的核苷酸序列完全一致。最終確定從發(fā)病幼鴿分離的菌株為白色念珠菌,并通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)證明了分離菌株的致病性。作者還采集病料檢查了幼鴿是否感染毛滴蟲(chóng),結(jié)果在顯微鏡下沒(méi)有觀察到毛滴蟲(chóng)的存在。因此,作者確定造成該鴿場(chǎng)幼鴿發(fā)病的病原為白色念珠菌。

幼鴿出生后需要母鴿喂食一個(gè)月左右才能獨(dú)立采食。該鴿場(chǎng)雖然出現(xiàn)幼鴿念珠菌病的暴發(fā),但未見(jiàn)青年鴿和母鴿發(fā)病,雖然在母鴿和青年鴿的喉頭和嗉囊也能分離到白色念珠菌。這說(shuō)明白色念珠菌主要導(dǎo)致不能獨(dú)立進(jìn)食的幼鴿發(fā)病;而對(duì)于成年鴿,白色念珠菌是其上消化道的常在病原。

在動(dòng)物回歸試驗(yàn)中,用鴿作為感染動(dòng)物是最好的選擇。但由于鴿的養(yǎng)殖企業(yè)和養(yǎng)殖戶較少,作者沒(méi)有找到無(wú)特定病原體(specific pathogen free,SPF)鴿?？紤]到白色念珠菌也能導(dǎo)致雞發(fā)病,作者選擇使用白色念珠菌陰性的雛雞作為攻毒動(dòng)物。試驗(yàn)結(jié)果表明,在幼鴿分離的白色念珠菌具有較強(qiáng)的致病力,能導(dǎo)致雞發(fā)病。這進(jìn)一步說(shuō)明導(dǎo)致鴿場(chǎng)發(fā)病的病原是白色念珠菌。

作者測(cè)定了分離菌株對(duì)部分抗菌藥物的敏感性。結(jié)果顯示抗細(xì)菌藥物對(duì)分離菌完全無(wú)效;分離菌對(duì)兩性霉素B、制霉菌素和克霉唑敏感;雖然沒(méi)有灰黃霉素對(duì)白色念珠菌的耐藥標(biāo)準(zhǔn),但灰黃霉素對(duì)分離菌的MIC均大于64 μg·mL-1。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果,鴿場(chǎng)投喂了制霉菌素,同時(shí)還加強(qiáng)了鴿場(chǎng)的生物安全措施,如通風(fēng)、消毒以及糞便清理,但沒(méi)有明顯減少幼鴿的發(fā)病。作者分析出現(xiàn)此種情況可能有如下原因:一是由于幼鴿不能自由采食,需要母鴿喂養(yǎng),因此鴿場(chǎng)實(shí)際是向母鴿投喂藥物,再由母鴿將混有藥物的飼料喂給幼鴿,這就造成幼鴿接受的藥物沒(méi)有達(dá)到治療的劑量。二是白色念珠菌具有復(fù)雜的致病和耐藥機(jī)制。白色念珠菌形成的生物膜對(duì)大多數(shù)已知的抗真菌藥物天然具有抗性,如多烯類藥物(包括制霉菌素和兩性霉素B)對(duì)白色念珠菌生物膜無(wú)效[3]。此外,白色念珠菌還能上調(diào)藥物外排泵的表達(dá)[11-12],大量分泌細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致藥物無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[13-14]等。

考慮到現(xiàn)有藥物對(duì)鴿白色念珠菌病的治療效果,鴿場(chǎng)應(yīng)按照《中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法》要求,及時(shí)淘汰和無(wú)害化處理所有鴿。之后對(duì)鴿場(chǎng)進(jìn)行徹底的消毒,直至清除鴿場(chǎng)中所有的白色念珠菌。然后再?gòu)臎](méi)有暴發(fā)過(guò)傳染病的鴿場(chǎng)購(gòu)入新的鴿。鴿場(chǎng)在今后的養(yǎng)殖過(guò)程中也應(yīng)加強(qiáng)生物安全措施,如入場(chǎng)車輛、人員、物資的清洗消毒,鴿場(chǎng)消毒藥的選擇及合適消毒頻率的確定,鴿場(chǎng)糞便的清理等。此外,鴿場(chǎng)還可制備白色念珠菌卵黃抗體[15]飼喂種鴿,用于預(yù)防白色念珠菌感染。

4 結(jié) 論

從暴發(fā)某種傳染病鴿場(chǎng)的發(fā)病幼鴿分離到8株真菌,通過(guò)分離培養(yǎng)、分子生物學(xué)鑒定和動(dòng)物回歸試驗(yàn)等確定導(dǎo)致該鴿場(chǎng)發(fā)病的病原為白色念珠菌,藥物敏感性試驗(yàn)測(cè)定發(fā)現(xiàn)分離菌對(duì)兩性霉素B、制霉菌素和克霉唑敏感。對(duì)鴿場(chǎng)投喂制霉菌素不能減少鴿的發(fā)病。因此建議鴿場(chǎng)對(duì)鴿進(jìn)行淘汰和無(wú)害化處理,對(duì)鴿場(chǎng)進(jìn)行全面徹底的消毒。對(duì)之后新購(gòu)入鴿加強(qiáng)檢疫和提高生物安全防控措施,以防再次發(fā)生類似疫情。