胡 婷,張永紅,侯曉林,姚 華,崔德鳳,潘早早,張凌宇,張家希,吳 瓊

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 102206)

豬的繁殖性能關(guān)乎生豬出欄量以及生豬供需穩(wěn)定?，F(xiàn)代化豬場(chǎng)中廣泛采用人工授精方式,公豬出現(xiàn)繁殖障礙造成的經(jīng)濟(jì)損失遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)母豬[1]。公豬處于不良環(huán)境時(shí),精子生理功能受損,造成公豬繁殖力降低。引起公豬繁殖障礙的因素包括日糧中的能量、微量元素、蛋白質(zhì)、礦物元素的水平、飼養(yǎng)管理不當(dāng)、環(huán)境因素、遺傳因素、傳染病等[2]。公豬繁殖與精子發(fā)生、成熟、獲能、頂體反應(yīng)、受精等過(guò)程密不可分,精子的發(fā)生與睪丸生殖細(xì)胞相關(guān)[3]。睪丸支持細(xì)胞(sertoli cell,ST細(xì)胞)是睪丸生殖細(xì)胞的一種,呈不規(guī)則的高錐體形,細(xì)胞基部附著在基膜上,頂部伸至曲精小管腔面[4]。ST細(xì)胞參與構(gòu)成血睪屏障,創(chuàng)造了相對(duì)穩(wěn)定的生精環(huán)境[5],ST細(xì)胞能夠支持、營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)生精細(xì)胞的產(chǎn)生[6],分泌雄激素結(jié)合蛋白,維持較高的雄激素水平[7],分泌睪丸液,有助于精子運(yùn)送[8]。此外,ST細(xì)胞能夠吞噬消化精子形成過(guò)程脫落的殘余胞質(zhì)[9]。

環(huán)境雌激素是一種環(huán)境內(nèi)分泌的干擾化學(xué)物質(zhì),具有與生物激素相似的性質(zhì)[10],可干擾體內(nèi)正常內(nèi)分泌物質(zhì)的合成、釋放、運(yùn)輸、結(jié)合和代謝,從而激活或抑制內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能[11]。在眾多環(huán)境雌激素中,雙酚A(BPA)結(jié)構(gòu)與雌激素相似,具有擬雌激素和抗雄激素的作用因而具有重要的生殖發(fā)育毒性[12-15],廣泛存在于塑料制品及涂料中,主要通過(guò)消化道、呼吸道和皮膚接觸進(jìn)入機(jī)體[16]。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示,大多數(shù)受檢者的體液和組織中均可檢測(cè)到BPA[17]。試驗(yàn)動(dòng)物和人類(lèi)研究證實(shí),BPA對(duì)間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育和功能具有內(nèi)分泌干擾作用[18]。BPA破壞間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育和功能,引起相關(guān)的生殖疾病,如睪丸發(fā)育不全綜合征,青春期延遲和不育[19]。成年大鼠皮下注射0.5% BPA,睪丸重量顯著減輕,精子發(fā)生降低[20]。小鼠在孕期暴露于BPA,其雄性后代每日產(chǎn)生的精子數(shù)量減少,生殖器官明顯變小[21]。BPA誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生,干擾ST細(xì)胞類(lèi)固醇的生成[22],誘導(dǎo)ST細(xì)胞凋亡,生殖細(xì)胞成熟中斷,導(dǎo)致睪丸發(fā)育缺陷[23]。然而,BPA影響豬睪丸支持細(xì)胞功能并造成公豬生殖障礙的機(jī)制目前還不清楚。

為探究環(huán)境雌激素雙酚A影響公豬繁殖能力的作用機(jī)制,本研究分析了不同時(shí)間BPA暴露下豬睪丸支持細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化,進(jìn)一步通過(guò)富集分析明確BPA暴露下豬睪丸支持細(xì)胞信號(hào)通路的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

豬睪丸支持細(xì)胞(ST細(xì)胞)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)徐世文教授饋贈(zèng),凍存于本實(shí)驗(yàn)室。胎牛血清、青/鏈霉素雙抗、DMEM培養(yǎng)基、胰酶、DMSO溶液、Tri-zol試劑購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司,BPA粉末購(gòu)自羅恩公司。ST細(xì)胞在含10%胎牛血清、100 μg·mL-1鏈霉素和100 IU·mL-1青霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng),置于5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。測(cè)序平臺(tái)使用美國(guó)Ilumina公司的Novaseq 6000。

1.2 BPA工作液配制

BPA粉末溶解于DMSO溶液中配制為1 mol·L-1原液,然后倍比稀釋為10-3mol·L-1BPA溶液,-20 ℃保存?zhèn)溆?。?xì)胞暴露前,取500 μL的10-3mol·L-1BPA溶液溶于10 mL的DMEM完全培養(yǎng)基,制備成終濃度為50 μmol·L-1的BPA工作液,0.22 μm濾膜過(guò)濾備用。

1.3 BPA暴露處理

ST細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板,濃度為2.5×106個(gè)·孔-1,試驗(yàn)分為兩組:空白對(duì)照組(C)和BPA暴露組(B)。貼壁后更換培養(yǎng)基為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基+1%雙抗培養(yǎng)基,饑餓處理12 h,BPA處理組細(xì)胞更換含50 μmol·L-1的BPA的DMEM完全培養(yǎng)基,空白對(duì)照組細(xì)胞更換為含與處理組細(xì)胞等量0.1% DMSO的DMEM完全培養(yǎng)基。每種處理?xiàng)l件設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔,BPA暴露6、24 h后收取細(xì)胞樣品進(jìn)行后續(xù)RNA提取。C組以及B組細(xì)胞重復(fù)孔按照不同培養(yǎng)時(shí)間命名為C6-1、C6-2、C6-3,C24-1、C24-2、C24-3,B6-1、B6-2、B6-3,B24-1、B24-2、B24-3。

1.4 RNA提取、文庫(kù)構(gòu)建、庫(kù)檢及上機(jī)測(cè)序

每個(gè)細(xì)胞處理孔加入1 mL Trizol進(jìn)行RNA提取,利用NanoDrop 2000與Qubit對(duì)提取的細(xì)胞RNA濃度及純度進(jìn)行檢測(cè)。質(zhì)檢合格的RNA制備文庫(kù),對(duì)核糖體RNA進(jìn)行酶切,隨機(jī)分成250～300 bp片段。利用Novaseq 6000測(cè)序平臺(tái)對(duì)RNA文庫(kù)進(jìn)行雙端150 bp高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,將測(cè)序圖像信號(hào)經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別轉(zhuǎn)換成文字信號(hào),以Fastq格式儲(chǔ)存為原始數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)比對(duì)組裝與功能注釋

利用FastQC去除原始Fastq數(shù)據(jù)中低質(zhì)量和污染的reads后,獲得clean reads通過(guò)Tophat v2.1.1與豬參考基因組Sus scrofa11.1進(jìn)行比對(duì),利用StringTiev1.3.3b進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組組裝。對(duì)獲得的基因分別基于NR、Swiss-Prot、Pfam、COG、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST功能注釋。

1.6 基因表達(dá)與差異基因分析

利用表達(dá)定量軟件RSEM v1.3.1對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行定量分析,定量指標(biāo)為T(mén)PM。使用DESeq2 v1.24.0鑒定空白對(duì)照組與BPA暴露組細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因(DEGs),使用Benjamini和Hochberg方法(BH)調(diào)整P值控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率,兩組之間表達(dá)倍數(shù)變化(FC)≥ 2或≤0.5,且adjustedP<0.05的基因名被認(rèn)定為DEGs。

1.7 功能富集分析

基于使用Goatools v0.6.5的Fisher精確測(cè)試進(jìn)行GO富集分析,用以確定DEGs的潛在作用。使用KOBAS v2.1.1進(jìn)行KEGG富集分析,用以評(píng)估顯著富集的代謝或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。經(jīng)BH調(diào)整的P<0.05的GO功能或KEGG通路被認(rèn)為顯著富集。

1.8 熒光定量PCR

應(yīng)用Trizol法對(duì)處理后的細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取后,應(yīng)用核酸濃度檢測(cè)儀進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測(cè),使用 Promega RT reagent Kit(Perfect Real Time)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄,用7500 FAST PCR儀進(jìn)行qPCR。mRNA引物序列見(jiàn)表1。

表1 mRNA引物序列Table 1 mRNA primers sequence

2 結(jié) 果

2.1 測(cè)序質(zhì)控和樣本間相關(guān)性分析

本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序12個(gè)樣品共獲得87.63 Gb高質(zhì)量讀取條帶用于后續(xù)組裝和分析,每個(gè)樣品數(shù)據(jù)量平均為5.94 Gb。所有樣本的Q20和Q30平均值分別為97.4%和93%,GC含量平均為53.7%,表明測(cè)序獲得的讀取條帶質(zhì)量高?；赟pearman相關(guān)性分析對(duì)所有12個(gè)樣本的TPM分布構(gòu)建相關(guān)矩陣,結(jié)果表明,不同BPA暴露時(shí)間下的細(xì)胞與空白對(duì)照組細(xì)胞樣品明顯分離,組內(nèi)重復(fù)樣品能夠聚集在一起,表明各組測(cè)序結(jié)果一致性高,測(cè)序數(shù)據(jù)的再現(xiàn)性高(圖1)。

不同顏色的方塊代表兩個(gè)樣本的相關(guān)性The squares with different colors represent the correlation between the two samples圖1 樣本間相關(guān)性熱圖Fig.1 Correlation heatmap between samples

2.2 參考基因功能注釋分析

從所有樣本中共發(fā)現(xiàn)33 004個(gè)基因,包括31 908個(gè)參考基因(96.7%)和1 096個(gè)未注釋的新基因(3.3%)。在31 908個(gè)參考基因中,共22 279(69.8%)個(gè)基因能夠通過(guò)COG(18 137)、GO(18 528)、KEGG(13 218)、NR(21 166)、Swiss Prot(19 103)和Pfam(15 947)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋(圖2A)。

A.基于不同數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋的Upset圖;B.COG功能注釋A.Upset diagram based on different database function annotations;B. COG function annotation圖2 參考基因功能注釋圖Fig.2 Function annotation diagram of referenced genes

隨后將參考基因比對(duì)到COG數(shù)據(jù)庫(kù)中,結(jié)果顯示共獲得18 137個(gè)COG功能注釋信息,劃分為23個(gè)功能分類(lèi)(圖2B)。與細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸相關(guān)的基因分布最多(U),有3 431個(gè)基因。涉及翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶蛋的功能基因(O)數(shù)量次之,有1 887個(gè)基因。基因功能尚未可知的基因(S類(lèi))數(shù)量最多,達(dá)到12 198個(gè),這說(shuō)明BPA暴露后ST細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)仍需深入挖掘。

GO注釋結(jié)果顯示,共有18 528個(gè)基因能夠被注釋為58個(gè)GO分類(lèi)(圖3)。在生物學(xué)過(guò)程類(lèi)別中,細(xì)胞過(guò)程、生物調(diào)節(jié)相關(guān)基因最多,分別為13 998和11 790個(gè)。在細(xì)胞成分類(lèi)別中,注釋到細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞組成成分相關(guān)基因最多,分別為15 988和9 927個(gè)。在分子功能類(lèi)別中,與結(jié)合和催化活性相關(guān)基因最多,分別為12 354、8 852個(gè)。

圖3 GO注釋分析Fig.3 GO annotation analysis

KEGG注釋結(jié)果表明(圖4),注釋到環(huán)境信息處理的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的參考基因數(shù)量最多(2 036個(gè)),注釋到免疫系統(tǒng)相關(guān)的參考基因有1 130個(gè),與內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)基因有1 024個(gè)。

圖4 KEGG注釋分析Fig.4 KEGG annotation analysis

2.3 新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)與樣本間Venn分析

對(duì)新轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能注釋(圖5A),與內(nèi)含子鏈完全匹配的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量最多,達(dá)63 041個(gè)。至少有一個(gè)剪接與參考轉(zhuǎn)錄本共享的潛在新轉(zhuǎn)錄本片段(j)數(shù)量為16 753個(gè),未知的轉(zhuǎn)錄本(u)數(shù)量為1 328個(gè),與參考轉(zhuǎn)錄本外顯子所處鏈的反義鏈有交集的轉(zhuǎn)錄本(x)數(shù)量為727個(gè),完全落入?yún)⒖嫁D(zhuǎn)錄本內(nèi)含子區(qū)的轉(zhuǎn)錄本(i)有611個(gè),與參考轉(zhuǎn)錄本的外顯子有一定的交集的轉(zhuǎn)錄本(o)數(shù)量為458個(gè)。

A.新轉(zhuǎn)錄本類(lèi)型分布圖;B. 組間參考基因Venn圖A. The novel transcript types distribution; B. Venn analysis of reference genes between groups圖5 新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)和Venn分析Fig.5 Prediction of novel transcripts and Venn analysis

對(duì)參考基因進(jìn)行Venn分析獲取不同處理組間共有或特有的基因(圖5B)。BPA暴露6、12 h的細(xì)胞與空白對(duì)照組細(xì)胞共有基因10 601個(gè),BPA暴露6 h后的B6組細(xì)胞特有基因79個(gè),而B(niǎo)PA暴露24 h后的B24組細(xì)胞特有基因增加到291個(gè)。

2.4 差異基因分析

與空白對(duì)照組細(xì)胞相比,BPA暴露6 h導(dǎo)致3 940個(gè)基因表達(dá)顯著差異(圖6A),其中2 261個(gè)基因表達(dá)上調(diào),1 679個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。BPA暴露6 h后,基因表達(dá)上調(diào)差異倍數(shù)前10的基因?yàn)锳CTG1、SPP1、TSP1、BIP、TF、PAI-1、UPA、ODC1、UBC和UBB,基因表達(dá)下調(diào)差異倍數(shù)前10基因?yàn)門(mén)UBA1B、HSPG2、SOD3、S100A6、EMILIN2、TUBB2B、P311、LGALS1、AHCY和FAT1。

BPA暴露6 (A)和24 h(B)的差異基因散點(diǎn)圖Scatter plots of DEGs from cells exposed to BPA for 6 (A) and 24 h (B)圖6 差異基因散點(diǎn)圖Fig.6 Scatter plots of DEGs

BPA暴露24 h后,差異基因數(shù)量達(dá)到6 928個(gè),包括3 222個(gè)上調(diào)基因和3 706個(gè)下調(diào)基因(圖6B)。上調(diào)差異倍數(shù)前10基因分別為FTL、BIP、HSPA8、UBB、UBC、Hsp90、ODC1、CLU、ANXA1和RBP4,下調(diào)差異倍數(shù)前10的基因分別為MT-CO1、FN1、GAPDH、ACTG1、SPP1、ENO1、APLP2、COIII、LDHA和TMSB10。從結(jié)果可以看出,SPP1基因在BPA暴露6 h后表達(dá)增加,但在BPA暴露24 h后表達(dá)降低。在BPA暴露6和24 h后,BIP、UBB、UBC、ODC1四個(gè)基因表達(dá)均明顯升高。

2.5 差異基因GO富集分析

對(duì)BPA暴露6、24 h的差異基因進(jìn)行GO富集分析。如圖7A所示,展示了富集差異倍數(shù)前20的信號(hào)通路。ST細(xì)胞BPA暴露6 h后,與泛素依賴性蛋白質(zhì)分解代謝過(guò)程調(diào)節(jié)相關(guān)的差異基因最多,達(dá)到46個(gè),其次是T細(xì)胞分化調(diào)節(jié)(42個(gè))。BPA暴露6 h的差異基因GO富集弦圖結(jié)果顯示(圖7B),參與泛素依賴性蛋白質(zhì)分解代謝過(guò)程調(diào)節(jié)過(guò)程上調(diào)差異倍數(shù)前10的差異基因有IL-23、p35、p21、SOX9、TRIB3、SOCS1、PI3K、NLRP3、TBX20和NF-κB,下調(diào)差異倍數(shù)前10的基因有SLA-DQB1、CDKN2C、SMAD6、SASH3、MYB、DDA3、CDC20、PLK1、CCNB2和NR2F2。

ST細(xì)胞BPA暴露24 h后差異基因GO富集分析顯示(圖7C),富集通路與BPA暴露后6 h明顯不同,糖酵解過(guò)程富集差異倍數(shù)最高(adjustedP-value=3.78×10-4),富集基因23個(gè)。細(xì)胞外基質(zhì)組織、有機(jī)酸分解代謝過(guò)程、羧酸分解代謝過(guò)程富集差異基因數(shù)量最多,分別為101、94、94個(gè)。GO富集弦圖顯示(圖7D),在參與糖酵解過(guò)程的基因中,除PFKFB2基因上調(diào)外,其他富集的22個(gè)基因均下調(diào),下調(diào)差異倍數(shù)前10的差異基因有GPI、PGK1、PGAM1、HKDC1、TPI1、PFKL、HK1、ENO1、GAPDH、ALDOC。

2.6 差異基因KEGG富集分析

如圖8A所示,在KEGG富集分析中展示了富集差異倍數(shù)前20的信號(hào)通路。BPA暴露6 h后,TNF信號(hào)通路(adjustedP-value=5.90×10-15)、癌癥相關(guān)microRNA(adjustedP-value=1.40×10-11)、p53信號(hào)通路(adjustedP-value=6.94×10-9)、IL-17信號(hào)通路(adjustedP-value=7.52×10-8)、MAPK信號(hào)通路(adjustedP-value=2.88×10-7)等炎癥信號(hào)通路富集差異倍數(shù)較高。KEGG富集弦圖顯示(圖8B),參與TNF信號(hào)通路上調(diào)差異基因包括PTGS2、LIF、CREB5、NF-κB、CCL2、IL6、BIRC2、CREB3L3、CXCL10。BPA暴露24 h后,富集差異倍數(shù)前3的通路為精氨酸和脯氨酸代謝、組氨酸代謝、糖酵解途徑等代謝通路(圖8C),而MAPK信號(hào)通路等炎癥信號(hào)通路在BPA暴露后24 h富集并不明顯。KEGG富集弦圖顯示(圖8D),參與精氨酸和脯氨酸代謝通路上調(diào)差異基因包括ARG1、SMOX、SAT1、ODC1,下調(diào)差異基因包括AGMAT、DAO、AOC1、GATM、GAMT、L3HYPDH。

BPA處理6 h后KEGG富集分析氣泡圖(A)和富集弦圖(B);BPA處理24h后KEGG富集分析氣泡圖(C)和富集弦圖(D)KEGG enrichment analysis bubble map (A) and chordograms (B) after BPA exposure for 6 h; KEGG enrichment analysis bubble map (C) and chordograms (D) after BPA exposure for 24 h圖8 KEGG富集分析Fig.8 KEGG enrichment analysis

2.7 關(guān)鍵差異基因表達(dá)驗(yàn)證

用Real-time PCR對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。BPA暴露后6 h,TNF等炎癥信號(hào)通路相關(guān)差異基因PTGS2、LIF、NF-κB、IL-6、CCL2、TRAF3表達(dá)顯著升高(圖9)。BPA暴露后24 h,精氨酸和脯氨酸等代謝通路相關(guān)差異基因ARG1、SMOX、SAT1、ODC1、FTL、PFKFB2表達(dá)顯著上調(diào)(圖9B)。

Real-time PCR分析BPA處理6(A)、24 h(B)關(guān)鍵差異基因表達(dá)Real-time PCR analysis of DEGs after BPA exposure for 6 (A) and 24 h (B)圖9 差異基因表達(dá)Real-time PCR分析Fig.9 Real-time PCR analysis of DEGs

3 討 論

BPA屬低毒性化學(xué)物,動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BPA有模擬雌激素的效果[24],低劑量也能導(dǎo)致動(dòng)物雌性早熟、精子數(shù)下降、前列腺增長(zhǎng)等。此外,雙酚A 具有一定的胚胎毒性和致畸性,可明顯增加動(dòng)物卵巢癌、前列腺癌、白血病等癌癥的發(fā)生。生殖系統(tǒng)是BPA作用的主要靶器官,BPA對(duì)生殖系統(tǒng)的損傷作用體現(xiàn)在抑制間質(zhì)細(xì)胞中睪丸類(lèi)固醇生成酶和類(lèi)固醇生成,增加炎癥細(xì)胞數(shù)量,導(dǎo)致睪丸發(fā)育缺陷,破壞生殖細(xì)胞的成熟,改變雌激素相關(guān)基因表達(dá),精子生成受限,降低精子質(zhì)量及運(yùn)動(dòng)能力。本研究使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析了豬睪丸支持細(xì)胞暴露于BPA不同時(shí)間后的基因表達(dá)譜變化。與小鼠試驗(yàn)?zāi)Ｐ拖啾?豬與人體在生理結(jié)構(gòu)上更加接近,本研究結(jié)果也為探究BPA對(duì)人生殖系統(tǒng)的作用提供了參考。

3.1 BPA對(duì)炎性反應(yīng)通路的作用

本研究發(fā)現(xiàn),豬睪丸支持細(xì)胞BPA暴露6 h后差異基因功能富集在TNF、MAPK、IL-17等炎性信號(hào)通路。TNF是細(xì)胞凋亡以及炎癥和免疫的主要介質(zhì),TNFα 受體分為2種(TNFRⅠ和TNFRⅡ),存在于多種細(xì)胞表面,TNF-α 與 TNFR的結(jié)合激活了多種信號(hào)通路,通常會(huì)引起細(xì)胞凋亡、炎癥和腫瘤的發(fā)生等。BPA暴露誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞TNF-α 表達(dá)升高,利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)其他炎性因子IL-6、IL-8、IL-1β等均表達(dá)增高,證實(shí)BPA引起豬腎細(xì)胞的炎性反應(yīng)[25]。

MAPK信號(hào)通路是TNF/TNFR1信號(hào)下游通路。MAPK是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者,MAPK通路有MAPK激酶激酶、MAPK激酶和MAPK三種重要的關(guān)鍵酶,3種酶共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化、炎癥反應(yīng)、對(duì)環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)等重要的細(xì)胞生理過(guò)程。研究證實(shí),雙酚類(lèi)化合物能夠激活人卵巢皮質(zhì)細(xì)胞的ERβ/GPR30-MAPK信號(hào)通路,導(dǎo)致細(xì)胞炎癥的發(fā)生[26]。本研究發(fā)現(xiàn),BPA誘導(dǎo)TNF通路中TFNR1以及TRAF2/5、TAK1顯著上調(diào),進(jìn)而激活MKK4/7、MKK3/6和JNK高表達(dá)。

IL-17是一種促炎因子,能夠誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞分泌合成IL-6、IL-8等。JNK/NF-κB信號(hào)通路是典型的細(xì)胞炎癥反應(yīng)通路。巨噬細(xì)胞敲除IL-17A基因后,BPA激活JNK/NF-κB以及誘導(dǎo)脂肪組織炎癥的作用明顯減弱[27]。研究表明,血清雙酚A水平與IL-23和IL-17呈正相關(guān),誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)[28]。本研究發(fā)現(xiàn),BPA誘導(dǎo)IL-17基因上調(diào),IL-17通路下游的NF-κB和炎癥因子IL-23表達(dá)均明顯增加。

研究發(fā)現(xiàn),IL-17與TNF-α共同作用可上調(diào)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞表達(dá)IL-17R和p-p38 MAPK,進(jìn)一步促進(jìn)IL-6、IL-8、MIP-3α等炎癥因子的分泌[29]。四氯化碳通過(guò)TNF/MAPK/NF-κB信號(hào)通路協(xié)同作用誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞炎癥,促進(jìn)TNF-α、IL-6等促炎癥因子上調(diào),加劇了NF-κB、ERK、MAPK蛋白的磷酸化,導(dǎo)致小鼠肝纖維化的發(fā)生[30]。BPA和BPS通過(guò)MAPK/JUN通路誘導(dǎo)綿羊卵巢顆粒細(xì)胞的炎癥反應(yīng),降低了類(lèi)固醇的分泌,影響生殖系統(tǒng)的功能[31]。硫氫化鈉通過(guò)抑制ERK/JNK/MAPK通路緩解BPA導(dǎo)致的鼠肺泡上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生[32]。這些研究表明,不同促炎細(xì)胞通路之間互相聯(lián)系影響。本研究結(jié)果表明,BPA暴露通過(guò)促進(jìn)TNF、p53和MAPK通路協(xié)同激活誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥。

3.2 BPA對(duì)細(xì)胞增殖的作用及致癌機(jī)制

作為環(huán)境雌激素的一種類(lèi)型,已經(jīng)有大量的研究證實(shí)BPA具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用及致癌效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn),豬睪丸支持細(xì)胞暴露于BPA后,p53信號(hào)通路顯著富集。p53是一種抑癌蛋白,p53基因是細(xì)胞周期中的負(fù)調(diào)節(jié)因子,在周期調(diào)控、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)等重要的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,p53蛋白的過(guò)表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)等相關(guān)[33]。研究發(fā)現(xiàn),BPA通過(guò)ERK、EGFR、AR和ERβ等信號(hào)途徑,導(dǎo)致p53磷酸化,進(jìn)而激活EGFR/ERK/p53信號(hào)通路,誘導(dǎo)原發(fā)性和前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯[34],證實(shí)生殖細(xì)胞暴露于BPA后,p53表達(dá)異常激活了p53相關(guān)的信號(hào)通路導(dǎo)致生殖細(xì)胞增殖,誘發(fā)生殖系統(tǒng)癌癥。p53在細(xì)胞凋亡過(guò)程發(fā)揮了重要的作用,BPA暴露于小鼠精原細(xì)胞GC-2后,p53和Bcl-2基因上調(diào),細(xì)胞凋亡率升高[35]。羊生殖細(xì)胞暴露于BPA后,p53通路激活,凋亡蛋白Caspase-3、p53和Bcl-2表達(dá)量顯著上調(diào),細(xì)胞發(fā)生凋亡,生殖細(xì)胞功能降低[36]。BPA暴露也上調(diào)細(xì)胞凋亡和p53通路相關(guān)基因表達(dá)[37]。

3.3 BPA對(duì)糖酵解途徑的作用

KEGG富集分析顯示,BPA暴露24 h后,豬ST細(xì)胞糖酵解和氨基酸代謝顯著富集。研究表明,高濃度的BPA暴露會(huì)增加基礎(chǔ)葡萄糖攝取,促進(jìn)糖酵解,但較低水平的雙酚A沒(méi)有此類(lèi)效果[38]。亞毒性濃度的BPA暴露不僅促進(jìn)癌細(xì)胞系OVCAR-3細(xì)胞的增殖,同時(shí)促進(jìn)糖酵解代謝,增加細(xì)胞內(nèi)ATP、乳酸和丙酮酸產(chǎn)生[39]。短期或長(zhǎng)期暴露雙酚類(lèi)化合物也可以增加中性粒細(xì)胞糖酵解功能[40]。

3.4 BPA對(duì)氨基酸代謝的作用

氨基酸代謝是BPA暴露24 h后富集差異倍數(shù)最高的信號(hào)通路。大量研究證明,BPA暴露是導(dǎo)致氨基酸代謝紊亂的原因之一。代謝組學(xué)研究表明,50 μg·kg-1的BPA暴露可誘導(dǎo)SD大鼠血漿中19種代謝物表達(dá)上調(diào),32種代謝物表達(dá)下調(diào),其中檸檬酸循環(huán)、丁酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及甘油磷脂代謝顯著紊亂[41]。妊娠期母鼠BPA暴露可以導(dǎo)致子代公鼠谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLAST以及GLT-1蛋白的上調(diào)表達(dá),谷氨酸代謝酶GS、GLS、GDH下調(diào)表達(dá)[42]。

4 結(jié) 論

本研究利用轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)探究了豬睪丸支持細(xì)胞暴露于BPA不同時(shí)間后的基因表達(dá)譜。BPA暴露6 h后,豬睪丸支持細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的促炎反應(yīng),TNF信號(hào)通路富集差異倍數(shù)最高。與BPA暴露6 h不同的是,豬睪丸支持細(xì)胞在BPA暴露24 h后氨基酸及糖代謝通路富集,包括精氨酸和脯氨酸、組氨酸、糖酵解途徑等代謝通路。本研究初篩了BPA損傷豬睪丸支持細(xì)胞功能的信號(hào)通路及關(guān)鍵基因,為進(jìn)一步探究BPA誘導(dǎo)公豬生殖障礙的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。