龍黎南,儲莉鳴,丁曉穎,張治萍,胡逸凡,王 珣,謝震宇

(上海市浦東新區(qū)婦幼保健院1.婦產科;2.醫(yī)教科;3.院辦,上海 201206)

妊娠期婦女由于體內激素水平變化,口腔微生態(tài)菌群失衡,加之孕期生活習慣改變和疏于口腔衛(wèi)生維護,易發(fā)展為妊娠期牙周病。據統(tǒng)計,全球范圍內妊娠期牙周病的患病率為30%～100%[1]。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)是一種革蘭陰性厭氧菌,是牙周病的關鍵致病菌[2]。研究表明,P.gingivalis不僅與牙周病密切相關,而且能夠黏附、侵入上皮細胞,激活細胞內信號轉導通路、誘導絨毛外滋養(yǎng)層細胞凋亡[3-5]或分泌毒性產物,或隨血液循環(huán)播散至全身,與不良妊娠結局(adverse pregnancy outcomes,APO)關系密切[6-8]。但目前研究主要集中于牙周病與不良妊娠結局[9-10],對于P.gingivalis的研究主要在體外細胞學和動物學實驗[3,11-12],臨床上關于妊娠期P.gingivalis的感染狀況及其與不良妊娠結局的前瞻性研究目前尚未見到?；诖?本研究通過檢測孕早期孕婦唾液中的P.gingivalis以了解孕婦P.gingivalis的感染狀況,探討妊娠期P.gingivalis感染的影響因素,并從孕早期建立隊列,通過前瞻性隊列研究分析P.gingivalis感染對不良妊娠結局的影響,為提高妊娠期口腔健康、制定孕期口腔保健服務策略提供科學依據,從而做到早期干預,預防不良妊娠結局的發(fā)生,改善妊娠結局。

1研究對象與方法

1.1研究對象

選取2021年12月至2022年2月在上海市浦東新區(qū)婦幼保健院初診的孕早期孕婦為研究對象。納入標準:①孕周<14周;②在本院定期產檢、分娩;③依從性好;④無認知功能障礙和精神障礙者。排除標準:①嚴重肝、腎、心等器官功能不全;②存在泌尿系統(tǒng)感染;③資料不全,妊娠結局失訪;④妊娠結局為自然流產者。本研究通過上海市浦東新區(qū)婦幼保健院醫(yī)學倫理學委員會批準,所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2基本資料收集

收集所有研究對象的基本信息,包括年齡、戶籍、教育程度、疾病史、不良孕產史、吸煙、孕產次、受孕方式、孕前體質指數(body mass index,BMI)、半年內牙周治療等情況。

根據國際婦產科聯(lián)盟對高齡的定義及孕產婦風險預警評估分類,將不同年齡分層為:<35歲、35～<40歲、≥40歲。疾病史:妊娠前患有糖尿病、高血壓、自身免疫性疾病其中一種,定義為既往有疾病史。不良孕產史:該孕婦既往妊娠時至少包括早產、低出生體重、死胎、死產、出生缺陷其中一種出生結局,即定義為不良孕產史。孕前BMI=孕前體重(kg)/身高(m)2,根據中國成人超重和肥胖預防控制指南(2020年),按不同BMI分層為BMI<24kg/m2、超重(24.0kg/m2≤BMI<28kg/m2)、肥胖(BMI≥28kg/m2)。吸煙:根據目前狀態(tài)分為:吸煙、曾經吸煙(現在已經戒煙≥6個月)、從未吸煙。

1.3唾液P.gingivalis 熒光定量PCR檢測

1.3.1試劑、材料

唾液采集器購自深圳華晨陽科技有限公司,唾液基因組DNA提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司,SYBR Green PCR試劑盒購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司,P.gingivalis菌株(ATCC33277)由河南科技大學腫瘤研究所惠贈。

1.3.2孕婦唾液樣本采集、DNA提取

在采集唾液樣本前30min,孕婦用清水將口腔內雜物洗漱干凈,期間不能進食或飲用飲料,向采集漏斗中輕輕吐入唾液,直至液體唾液達2mL,將保存液緩緩倒入采集漏斗內,上下顛倒充分混勻。按照唾液基因組DNA提取試劑盒說明書提取唾液樣本DNA,-80℃下凍存。

1.3.3P.gingivalis實時PCR

根據P.gingivalis16S rDNA基因序列(GeneBank:NR_040838),使用Primer Premier 5軟件設計特異性引物,序列為:forward:5′-AATAACGGGCGATACGA-3′;reverse:5′-TGTTCCTCCGCTTGTGC-3′。PCR反應體系為20μL:SYBR Green Mix 10μL,上下游引物各0.5μL,DNA模板2μL;反應條件:95℃ 5min,95℃ 10 s,60℃ 30s,40個循環(huán),所有反應在ABI-7300型實時PCR(real time PCR)儀上進行,利用ABI Prism 7300 SDS software軟件分析擴增結果。每次反應均設P.gingivalis陽性對照、唾液鏈球菌(S.salivarius)陰性對照及空白對照。

1.4孕期隨訪、觀察不良妊娠結局指標

根據P.gingivalis感染狀況將研究對象分為感染組、對照組。兩組間戶籍、孕次、產次、BMI、受孕方式差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。①隨訪孕期產檢情況:產檢次數、孕期增重、B族鏈球菌(group B Streptococcus,GBS);②觀察兩組的孕產婦合并癥、并發(fā)癥:妊娠期高血壓、子癇前期、妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)、早產、胎膜早破、胎兒生長受限(fetal growth restriction,FGR)、低出生體重、產后出血、新生兒感染,診斷標準依據人民衛(wèi)生出版社《婦產科學》第9版[13]。

1.5統(tǒng)計學方法

2結果

2.1基本情況

本研究共納入390例孕婦,年齡18～45歲,平均年齡(33.26±3.49)歲,其中<35歲201例(51.54%),35～<40歲148例(37.95%),≥40歲41例(10.51%);初產婦167例(42.82%)、經產婦223例(57.18%);本市戶籍105例(26.92%)、外地戶籍285例(73.08%)。

2.2孕婦唾液P.gingivalis的檢測結果

孕婦唾液P.gingivalis的實時PCR檢測結果見圖1,可見擴增曲線重復性好,溶解曲線單一峰代表引物特異性較好,以Ct<29為陽性;Ct≥29為陰性。

注:A為P.gingivalis real time PCR擴增曲線;B為P.gingivalis real time PCR溶解曲線。

2.3妊娠期P.gingivalis的感染狀況及影響因素分析

390例孕婦中,P.gingivalis陽性176例,陰性214例,妊娠期P.gingivalis感染率為45.13%。單因素分析結果顯示,孕婦年齡、文化程度、既往疾病史、不良孕產史、吸煙、胎兒數目、半年內牙周治療、陰道炎與P.gingivalis感染顯著相關(P<0.05),見表1。

表1 妊娠期P.gingivalis感染影響因素的單因素分析 [n(%)]

以妊娠期是否P.gingivalis感染為因變量,納入單因素分析中差異有統(tǒng)計學意義的因素為自變量,進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示,相對于年齡<35歲,年齡35～<40歲、≥40歲孕婦P.gingivalis感染的風險均增加(OR=1.674,95%CI:1.058～2.648,P<0.05;OR=2.085,95%CI:1.026～4.238,P<0.05);吸煙的孕婦P.gingivalis感染的風險是未吸煙孕婦的2.916倍(OR=2.916,95%CI:1.051～8.094,P<0.05),但曾經吸煙對比從未吸煙的孕婦無統(tǒng)計學差異(P>0.05);低文化程度(高中及以下)、不良孕產史、患有陰道炎(OR=2.017,95%CI:1.310～3.105;OR=1.788,95%CI:1.017～3.144;OR=1.877,95%CI:1.217～2.896)均是妊娠期P.gingivalis感染的獨立危險因素(P<0.05)。但在控制了年齡、文化程度、吸煙等因素后,半年內有牙周治療并不是P.gingivalis感染的保護因素(P>0.05),見表2。

表2 妊娠期P.gingivalis感染影響因素的Logistic回歸分析

2.4感染組與對照組的孕期情況、分娩結局的比較

兩組間產檢次數、孕期增重、妊娠期高血壓、胎膜早破、產后出血、低出生體重、新生兒感染情況比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。但感染組GBS陽性、子癇前期、GDM、早產、FGR的發(fā)生率明顯高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

表3 兩組孕期情況、分娩結局的比較

2.5妊娠期P.gingivalis感染對不良妊娠結局的影響

將至少出現子癇前期、GDM、早產、FGR其中一種,定義為不良妊娠結局,以是否有不良妊娠結局為因變量,納入感染組、對照組間有統(tǒng)計學差異的因素為自變量,納入多因素Logistic回歸分析。結果顯示,在控制了年齡、雙胎、不良孕產史、GBS陽性等因素后,P.gingivalis感染明顯增加了不良妊娠結局的發(fā)生風險(OR=2.175,95%CI:1.291～3.662),P.gingivalis感染的孕婦不良妊娠結局的發(fā)生率是未感染孕婦的1.778倍(RR=1.778,95%CI:1.223～2.432),見表4。

表4 不良妊娠結局影響因素的Logistic回歸分析

3討論

妊娠期常見的牙周致病菌有:牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)、中間普氏菌(P.intermedia)、伴放線聚集桿菌(A.actinomycetemcomitans)、具核梭桿菌(F.nucleatum)等。P.gingivalis是一種革蘭陰性厭氧菌,具有菌毛、牙齦素、脂多糖等多種毒力因子,直接入侵牙周或母胎組織,造成全身和胎盤組織的免疫環(huán)境失調和氧化應激,或釋放細菌產物間接通過炎癥介質等傳播到胎兒-胎盤單位[11],導致早產、子癇前期、早產低出生體重兒等多種不良妊娠結局[6-8,14]。Amarasekara等[15]通過鑒定、比較子癇前期與正常孕婦胎盤組織中的細菌,發(fā)現P.gingivalis存在子癇前期孕婦的胎盤組織中,而正常孕婦胎盤中均未發(fā)現P.gingivalis;Vanterpool等[16]通過免疫熒光組織法在胎盤、臍帶標本中檢測P.gingivalis并定位,結果顯示臍帶P.gingivalis感染與子癇前期顯著相關,胎盤中的P.gingivalis與早產顯著相關,提示胎盤絨毛間質、臍帶P.gingivalis感染可能是不良妊娠結局的重要因素。因此,研究妊娠期女性P.gingivalis的感染狀況及對不良妊娠結局的影響,對通過改善口腔健康預防不良妊娠結局的發(fā)生具有重要的臨床意義。

3.1妊娠期P.gingivalis感染對不良妊娠結局的影響

本研究在控制了混雜因素后,結果顯示P.gingivalis感染明顯增加了子癇前期、GDM、早產、FGR不良妊娠結局的風險,可能作用機制主要包括①P.gingivalis與絨毛外滋養(yǎng)層細胞凋亡有關,Ren等[3]通過P.gingivalis感染人絨毛外滋養(yǎng)層細胞(HTR8/SVneo細胞),發(fā)現P.gingivalis誘導炎性因子IFN-γ和IL-8分泌,通過激活ERK1/2和P38信號通路,導致人絨毛外滋養(yǎng)層細胞凋亡;Hirohata[4]等將HTR8/SVneo細胞接種于含有P.gingivalis的培養(yǎng)基,發(fā)現P.gingivalis能夠抑制滋養(yǎng)層細胞的侵襲和隨后的血管重塑,從而影響胎盤生長及胎兒健康,導致子癇前期、FGR等多種不良妊娠結局。②P.gingivalis感染與氧化應激有關,Napa等[17]發(fā)現P.gingivalis脂多糖能誘導牙齦成纖維細胞線粒體含量增加、活動增強,產生大量過氧化氫(H2O2),H2O2等活性氧在血漿及胎盤中顯著增加,與抗氧化劑的平衡失調,在子癇前期的發(fā)生中起重要作用[18]。③P.gingivalis可能改變腸道菌群,引起糖代謝異常、胰島素抵抗,參與了GDM的發(fā)病機制,且與體內血糖水平呈正相關[19-20]。張欣等[21]探討口腔菌群、腸道菌群與GDM的關系,結果顯示P.gingivalis與口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test,OGTT)血糖水平顯著正相關。

目前發(fā)現P.gingivalis感染導致不良妊娠結局的可能作用途徑主要有2種:①P.gingivalis破壞牙周組織,血行播散或直接入侵母胎組織[15-16];②P.gingivalis作為病原菌,間接通過細菌產物或炎性介質的釋放進入母體循環(huán)達到母胎界面,從而增加不良妊娠結局的發(fā)生[11]。

3.2妊娠期P.gingivalis感染的高危因素

本研究結果顯示,妊娠期P.gingivalis感染率高達45.13%,與2014年陳琳等調查的上海市孕婦牙周病患病率為49.6%相近,但楊秀巧等[22]通過調查380名妊娠期婦女顯示,妊娠期牙周病患病率為87.1%,數據差距之大的原因可能與臨床對牙周病的主觀診斷不統(tǒng)一或調查對象所處的妊娠周期不同有關,妊娠中晚期孕婦比早期更容易患牙周病,但本研究對象選擇了妊娠早期孕婦,原因為:①本研究目的為早干預、早治療,從而降低不良妊娠結局;②P.gingivalis感染在妊娠早期就干擾了絨毛外滋養(yǎng)層細胞向子宮血管侵襲,影響妊娠過程中子宮螺旋動脈重塑,導致不良妊娠結局[4-5,23]。

既往研究發(fā)現,妊娠牙周病與年齡[22]、文化程度[24-25]、吸煙[26]有關。楊秀巧等[22]將孕婦年齡按20～27歲、28～35歲和35歲以上進行年齡分組,研究表明隨著妊娠婦女年齡的增大,牙周炎癥狀況加重。本研究結果顯示,高齡、低文化程度、吸煙同樣是妊娠期P.gingivalis感染的危險因素,年齡越大,其感染風險越大,與妊娠期牙周病相同。但本研究還發(fā)現,陰道炎、既往不良孕產史均是妊娠期P.gingivalis感染的獨立危險因素,可能原因:①引起慢性牙周炎癥的細菌包括革蘭陰性桿菌和厭氧菌,與細菌性陰道病患者的細菌相似[27];②既往不良孕產史與P.gingivalis感染可能為雙向關聯(lián)的關系,一方面,P.gingivalis感染引起前次不良妊娠結局,另一方面,既往不良妊娠結局可能引起了隱匿的胰島素抵抗、炎癥等,使機體對P.gingivalis易感性增加。

3.3妊娠期P.gingivalis感染的治療

妊娠期牙周基礎治療可改善孕婦的口腔微生態(tài),本研究顯示,半年內有牙周治療史的孕婦P.gingivalis感染率明顯降低,但在排除了其他因素后,半年內有牙周治療史并不是P.gingivalis感染的保護因素。關于孕期牙周治療能否減少不良妊娠結局的發(fā)生目前尚無定論,Liu等[28]研究發(fā)現妊娠期牙周治療明顯降低GDM的發(fā)生率;Bi等[29]系統(tǒng)地評估了妊娠期牙周治療對妊娠結局的影響,結果顯示妊娠期牙周治療可降低圍產期死亡率和早產的風險,并提高新生兒出生體重;但也有研究發(fā)現,妊娠期牙周基礎治療并不能降低不良妊娠結局的風險[30-31],其原因可能為:①P.gingivalis在妊娠早期就參與了不良妊娠結局的發(fā)病機制;②治療時間太晚,P.gingivalis已經感染了胎盤等組織,牙周基礎治療不能有效地抑制。因此,如何同時抑制口腔、胎盤中的P.gingivalis及選擇P.gingivalis感染的治療時機,從而預防不良妊娠結局的發(fā)生,需要進一步深入的研究。

綜上所述,妊娠期P.gingivalis的感染率高,是不良妊娠結局發(fā)生的危險因素,應關注妊娠期P.gingivalis的感染狀況及口腔衛(wèi)生狀況,尤其加強高齡、低文化水平、吸煙、患有陰道炎、既往不良孕產史高危人群的口腔健康教育,從而早期干預、治療,降低不良妊娠結局的發(fā)生,提高人口出生質量。但本研究局限于單中心,地域差異無法兼顧,且納入的影響因素僅包括孕婦的基本資料,未包含平時口腔保健狀況及習慣,可能存在選擇偏倚,尚需更大樣本,擴大范圍進一步探討。