劉穎，高展翔

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）肝纖維化由非酒精性脂肪性肝炎發(fā)展而來，隨著病情進一步惡化，可發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌［1］。研究表明，各種慢性肝病都可能伴有肝纖維化，12%～25%的慢性乙型肝炎肝纖維化患者5年內(nèi)可進展為肝硬化［2］，嚴重威脅人類健康，因此及時逆轉(zhuǎn)及阻斷肝纖維化進展具有重大意義。但目前為止，臨床仍缺乏療效肯定的抗肝纖維化藥物。中藥具有多環(huán)節(jié)、多靶點的作用特點，對病理機制復(fù)雜的疾病可發(fā)揮綜合優(yōu)勢，實踐也證明中醫(yī)藥在抗器官纖維化中發(fā)揮了重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，“茵陳三甲散”對防止非酒精性脂肪肝向肝纖維化轉(zhuǎn)變有滿意效果，而其作用機制尚不明確。本研究以Hedgehog（簡稱Hh）信號通路為靶點，研究“茵陳蒿湯”和“薛氏三甲散”及其合方“茵陳三甲散”干預(yù)NAFLD肝纖維化慢性炎癥的過程，從而探究祛濕通絡(luò)法作用于NAFLD肝纖維化的可能機制。

1 材 料

1.1 實驗動物 8周齡SPF級C57BL/6J成年雄性小鼠60只，體質(zhì)量（18±2）g，購自杭州醫(yī)學(xué)院，許可證號為：SCXK（浙）2019-0002。在福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，合格證號為：SYXK（閩）2019-007。

1.2 實驗藥物 中藥（茵陳、梔子、大黃、醋鱉甲、炮山甲、?蟲、僵蠶、柴胡、桃仁）購自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福建省第三人民醫(yī)院；秋水仙堿（上海源葉生物科技有限公司，批號：A05GS144308）。蛋氨酸膽堿缺乏（methionine-choline-deficient，MCD）飼料（無錫帆泊生物技術(shù)有限公司，批號：FB-A020820 02B）。

1.3 主要實驗試劑 天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）、透明質(zhì)酸（HA）、層黏蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原肽（PCⅢ）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：C010-2-1、C009-2-1、C019-1-1、H141-1-1、H148、H491-1）；HE染色液、Masson染色液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號：BA4025、BA4079）；BCA蛋白定量試劑盒、Western blot專用一抗和二抗稀釋液（武漢博士德生物工程有限公司，批號：AR0198、AR1017）；qPCR檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號：Q311-02）。

1.4 實驗儀器 顯微鏡DM4000 B-LED（德國徠卡公司）；上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析儀UPF-3A（北京熱景生物技術(shù)有限公司）；PCR儀（杭州米歐儀器有限公司）；轉(zhuǎn)移脫色搖床（海門其林貝爾儀器制造公司）；超微量紫外可見分光光度計（杭州米歐儀器有限公司）；冷凍離心機（廣州吉迪儀器有限公司）；瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

2 方 法

2.1 實驗藥物制備 茵陳蒿湯由茵陳18 g，梔子12 g和大黃6 g組成；薛氏三甲散由?蟲10 g，醋鱉甲15 g，炮穿山甲3 g，僵蠶10 g，柴胡5 g和桃仁10 g組成；自擬方茵陳三甲散由茵陳18 g，梔子12 g，大黃6 g，醋鱉甲15 g，炮山甲3 g，?蟲10 g，僵蠶10 g，柴胡5 g和桃仁10 g組成。將上述中藥浸泡、煎煮、過濾、濃縮配制成藥液（茵陳蒿湯濃度為0.7 g/mL、薛氏三甲散藥液濃度1.1 g/mL、茵陳三甲散藥液濃度1.8 g/mL），存于4 ℃冰箱里。

2.2 模型建立與評價 將小鼠分為正常組10只和造模組50只，造模組使用MCD飼料建立模型。MCD飼料造模是目前國際上公認的NAFLD造模方法，根據(jù)相關(guān)文獻造模成功案例［3-4］，光鏡下觀察模型組肝組織形態(tài)學(xué)改變，出現(xiàn)肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞脂肪樣變、淋巴細胞浸潤和肝細胞水腫，點灶狀壞死、竇周纖維化，中央靜脈區(qū)有大量膠原纖維沉積，表示造模成功。

2.3 動物分組及干預(yù) 將小鼠用隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、西藥組、祛濕組、通絡(luò)組、祛濕通絡(luò)組，每組各10只。根據(jù)實驗動物標準體質(zhì)量劑量折算表［5］，正常組和模型組給予10 mL/kg蒸餾水灌胃；祛濕組按7.4 g/kg茵陳蒿湯灌胃；通絡(luò)組按10.9 g/kg薛氏三甲散灌胃；祛濕通絡(luò)組按18.3 g/kg自擬方茵陳三甲散灌胃；西藥組按0.1 mg/kg秋水仙堿灌胃。于每日上午9時灌胃，每日1次，連續(xù)8周。

2.4 標本采集 末次灌胃結(jié)束，各組小鼠禁水、禁食12 h后稱體質(zhì)量。采用腹腔注射20%烏拉坦深度麻醉，摘取眼球取血，分離血清（3 000 r/min，15 min）置于-20 ℃低溫冰箱保存。分別取肝左葉組織放于凍存管和4%多聚甲醛中，凍存管先置于液氮內(nèi)保存，隨后放入-80 ℃冰箱內(nèi)。

2.5 觀察指標

2.5.1 肝功能及肝纖維化指標測定 ELISA法分別檢測各組小鼠肝功能指標AST、ALT、TBIL及肝纖維化指標HA、LN、PCⅢ水平，嚴格按照試劑盒說明書上的操作步驟進行。

2.5.2 肝組織病理學(xué)觀察 取約1 cm×1 cm×1 cm大小肝組織，生理鹽水沖洗后放入40 g/L甲醛液中固定，固定后乙醇梯度脫水，二甲苯透明后浸蠟及包埋，制作病理切片。染色后，光鏡下觀察各組小鼠肝組織病理形態(tài)變化。

2.5.3 qPCR檢測 稱取100～150 μg的肝組織塊，用TRIpure裂解液離心提取RNA，加入等體積的異丙醇，12 000 r/min 4 ℃離心5 min，棄掉上清，超凈臺干燥沉淀2～5 min，加入RNase-free water溶解沉淀，-80 ℃保存。RNA電泳：稱取0.25 g瓊脂糖粉，加入25 mL的1×TBE緩沖液，放入微波爐中煮沸30 s，重復(fù)4～5次，煮沸結(jié)束后加1.5 μL核酸染料，倒入制膠盒內(nèi)，等待凝固。取4 μL的RNA樣本和2 μL的1×Loading buffer 進行混合上樣，200 V，10 min。從NCBI上查找小鼠的Shh、Gli1、Gli2、α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）等基因的mRNA序列，并以相應(yīng)種屬的GAPDH作為內(nèi)參基因，根據(jù)引物設(shè)計的原則，用Premier 5.0設(shè)計目標基因和內(nèi)參基因的特異性引物，由上海博尚生物工程技術(shù)有限公司進行合成，見表1。用2-ΔΔCt進行進一步定量分析。

表1 引物序列

2.5.4 Western blot檢測小鼠肝組織中Gli1、Gli2、Shh、α-SMA蛋白表達量 稱取100～150 μg的組織塊，放入含有磁珠的2 mL研磨管中。每管加1 mL的含PMSF的RIPA裂解液（RIPA裂解液：PMSF＝1 000∶1）置于研磨機粉碎。離心后取上清液，BCA法進行蛋白濃度測定，記錄數(shù)據(jù)。取等量蛋白（10 μg）進行10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后，室溫孵育2 h，用一抗、二抗稀釋液稀釋一抗到工作濃度，將膜置于一抗溶液中，置搖床室溫孵育2 h。將膜置于TBST中，漂洗3次，10 min/次。根據(jù)一抗來源選擇合適的二抗，用一抗、二抗稀釋液稀釋HRP標記的二抗到工作濃度（1∶5 000），室溫孵育2 h。TBST洗膜（10 min×3次），顯影并分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 26.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。計量資料服從正態(tài)分布用（）表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 6組小鼠一般狀態(tài) 在實驗前，各組小鼠精神狀態(tài)好，活動能力強，毛色有光澤。隨著天數(shù)的推移，模型組小鼠出現(xiàn)形體消瘦，皮毛紊亂欠光澤，活動減少，反應(yīng)遲緩，攝食量減少。至實驗結(jié)束時，正常組毛色光澤、飲食如常、活潑好動、體型正常；模型組小鼠明顯出現(xiàn)食欲減退，形體瘦弱，體質(zhì)量減輕，毛色暗，毛發(fā)紊亂無光澤，精神萎靡，呈現(xiàn)疾病狀態(tài)；西藥組、祛濕組、通絡(luò)組、祛濕通絡(luò)組小鼠的活動頻率、皮毛光澤度較模型組有不同程度的好轉(zhuǎn)，攝食一般。

3.2 6組小鼠血清AST、ALT、TBIL、HA、LN及PCⅢ水平變化 見表2。

表2 6組小鼠血清AST、ALT、TBIL、HA、LN及PCⅢ指標檢測結(jié)果（）

表2 6組小鼠血清AST、ALT、TBIL、HA、LN及PCⅢ指標檢測結(jié)果（）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與西藥組比較，3） P＜0.05；與祛濕組比較，4） P＜0.05；與通絡(luò)組比較，5） P＜0.05。

組別正常組模型組西藥組祛濕組通絡(luò)組祛濕通絡(luò)組PCⅢ/（ng/mL）3.80±0.20 20.00±2.401）11.40±0.902）7.70±0.302）3）8.30±0.502）3）5.50±0.302）3）4）5）n 10 10 10 10 10 10 ALT/（U/L）35.90±2.20 110.40±13.601）65.40±4.302）68.80±6.502）71.50±4.202）48.10±2.802）3）4）5）AST/（U/L）71.10±3.40 159.50±9.101）112.50±11.002）116.60±11.402）109.90±10.502）84.50±2.702）3）4）5）TBIL/（μmol/L）7.60±0.50 37.00±2.401）22.20±1.102）14.60±0.702）3）15.70±0.802）3）12.60±0.502）3）4）5）HA/（U/L）237.00±6.60 550.90±4.601）426.60±16.102）326.30±13.402）3）330.50±22.102）3）289.70±11.002）3）LN/（μg/mL）7.30±1.00 94.40±6.401）58.70±5.402）34.70±4.102）3）26.50±0.902）3）17.40±1.202）3）4）5）

3.3 6組小鼠肝臟病理形態(tài)變化比較 通過HE和Masson染色進行觀察，正常組肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉完整，細胞形態(tài)正常，肝細胞索排列整齊，無炎癥，無纖維化。肝纖維化模型組小鼠肝組織正常結(jié)構(gòu)破壞嚴重，有肝細胞脂肪樣變、淋巴細胞浸潤和肝細胞水腫，點灶狀壞死，肝纖維增生。西藥組肝纖維化情況有所好轉(zhuǎn)，細胞水腫、排列較紊亂，肝細胞壞死減少，脂肪空泡減少，炎癥減輕，少量纖維組織增生。病理染色發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，祛濕組、通絡(luò)組和祛濕通絡(luò)組肝纖維化的現(xiàn)象均有所好轉(zhuǎn)，纖維增生減少，肝細胞壞死程度減輕，脂肪空泡減少，炎癥細胞浸潤減少，其中祛濕通絡(luò)組脂肪變、水腫、肝細胞壞死和纖維增生較模型組明顯減少。見圖1。

圖1 6組小鼠肝組織病理形態(tài)變化圖（HE、×100；Masson、×100）

3.4 6組小鼠肝組織中Shh、Gli1、Gli2、α-SMA mRNA相對表達量比較 見表3。

表3 6組小鼠Gli1、Gli2、Shh、α-SMA mRNA相對表達水平比較（）

表3 6組小鼠Gli1、Gli2、Shh、α-SMA mRNA相對表達水平比較（）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與西藥組比較，3） P＜0.05；與祛濕組比較，4） P＜0.05；與通絡(luò)組比較，5） P＜0.05。

組別正常組模型組西藥組祛濕組通絡(luò)組祛濕通絡(luò)組α-SMA 1.04±0.03 2.03±0.031）1.71±0.022）1.48±0.022）3）1.48±0.012）3）1.28±0.012）3）4）5）n 10 10 10 10 10 10 Gli1 1.11±0.03 1.99±0.021）1.78±0.032）1.51±0.022）3）1.51±0.052）3）1.25±0.022）3）4）5）Gli2 1.06±0.04 2.01±0.041）1.73±0.022）1.50±0.022）3）1.53±0.032）3）1.27±0.022）3）4）5）Shh 1.02±0.03 1.94±0.031）1.76±0.022）1.54±0.022）3）1.53±0.032）3）1.29±0.022）3）4）5）

3.5 6組小鼠肝組織中Shh、Gli1、Gli2、α-SMA蛋白表達量比較 見圖2。

圖2 6組小鼠肝組織Gli1、Gli2、Shh、α-SMA蛋白表達量比較

4 討 論

茵陳蒿湯出自漢張仲景《傷寒論》，是治療肝膽濕熱的主方；三甲散乃明末瘟疫學(xué)家吳又可治療伏氣“主客交病”之主方，薛氏三甲散出自薛生白《濕熱病篇》，在吳氏三甲散基礎(chǔ)上演變而來，針對濕熱證后期，主客交混，絡(luò)脈凝瘀特點而創(chuàng)立的名方。本研究自擬茵陳三甲散是基于祛濕通絡(luò)立法，以茵陳蒿湯和薛氏三甲散合方而成。全方用藥，清熱祛濕、通絡(luò)化瘀，切中NAFLD肝纖維化主要病機。本實驗結(jié)果可見，祛濕通絡(luò)組在與除正常組外各組小鼠進行兩兩比較中肝功能指標水平和肝纖維化指標水平，以及Gli1、Gli2、Shh、α-SMA的mRNA表達水平及蛋白表達量均顯著降低（P＜0.05），表明自擬茵陳三甲散在減少肝臟損傷，降低肝纖維化方面最為明顯。肝組織病理變化也說明，通過HE和Masson染色觀察到祛濕通絡(luò)組小鼠肝細胞脂肪變、水腫、肝細胞壞死和纖維組織增生較西藥組、祛濕組和通絡(luò)組均減輕（P＜0.05），以上結(jié)果均證實自擬茵陳三甲散在減輕肝纖維化的程度上效果優(yōu)于秋水仙堿、茵陳蒿湯和薛氏三甲散。

肝纖維化發(fā)病機制復(fù)雜，主要病理改變?yōu)楫敻闻K受到炎癥損傷時，肝內(nèi)彌漫性細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的過度沉積［7］，而肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）已被證實是ECM的主要來源，HSCs激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞（myofibroblast，MFB）是發(fā)展為肝纖維化的中心環(huán)節(jié)［8］，因此抗肝纖維化是各種慢性肝病預(yù)后、轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵所在。研究表明，Hh信號通路與非酒精性脂肪性肝炎關(guān)系密切，且能夠激活HSCs，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生［9］，過度激活甚至可發(fā)展為肝硬化和肝癌［10］。Hh信號通路主要由Hh配體、受體（patched、smoothened）和轉(zhuǎn)錄因子Gli1、Gli2和Gli3及其下游靶基因組成［11］。Gli是Hh信號通路末端的最終轉(zhuǎn)錄效應(yīng)因子，主要作用是促使HSCs轉(zhuǎn)換為肌成纖維細胞。α-SMA是肝纖維化活化的重要標志物。Hh信號通路在肝臟中高度保守，在調(diào)節(jié)肝組織的生長、分化、模式化和血管化等方面發(fā)揮著重要作用。本研究顯示，在給予茵陳三甲散灌胃的小鼠肝臟組織內(nèi)Gli1、Gli2、Shh、α-SMA mRNA和蛋白表達量上均低于除正常組外的其他組。提示基于祛濕通絡(luò)立法的茵陳三甲散對小鼠肝纖維化的抑制作用優(yōu)于單用茵陳蒿湯或薛氏三甲散，其作用機制可能與下調(diào)和抑制Gli1、Gli2、Shh、α-SMA的表達，阻止肝星狀細胞活化有關(guān)，從而阻斷Hh信號通路的激活。說明祛濕通絡(luò)法對MCD飼料誘導(dǎo)肝纖維化小鼠具有較好的保護作用，其作用優(yōu)于單用祛濕法或通絡(luò)法。

綜上，祛濕法或通絡(luò)法對改善MCD飼料誘導(dǎo)的小鼠NAFLD肝纖維化均有效，但祛濕通絡(luò)法綜合效果最佳，其作用機制與下調(diào)Gli1、Gli2、Shh、α-SMA的表達，從而抑制Hedgehog信號通路的活化有關(guān)。