原丹，林艷藍，李嬋

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福州中醫(yī)院，福建 福州 350001）

地圖舌，又名游走性舌炎，是一種慢性的淺層剝脫性舌炎，主要表現(xiàn)為絲狀乳頭區(qū)域性剝脫而形成的紅斑區(qū)，其邊緣可見約1～3 mm寬、稍隆起的黃白色或白色弧形邊界［1-2］。其雖無疼痛的表現(xiàn)，卻有病程反復(fù)、遷延不愈的特點，常在兒童和青少年中發(fā)生。相關(guān)研究表明，地圖舌作為一種病理性舌象表現(xiàn)與消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病有較大的關(guān)聯(lián)性，將地圖舌作為疾病的臨床癥狀，通過辨證論治以遣方用藥，往往能夠?qū)ο嚓P(guān)疾病的治療起到很好的療效。地圖舌的影響因素復(fù)雜多變，對其進行客觀化、定量化的研究有助于進一步精確地診治。本研究采用16S rDNA高通量測序技術(shù)，對地圖舌兒童和健康兒童舌苔菌群結(jié)構(gòu)的差異和特征進行了分析，以關(guān)注地圖舌舌苔菌群變化與相關(guān)疾病間的關(guān)系。

1 臨床資料

1.1 病例選擇標準

1.1.1 西醫(yī)診斷標準 參照文獻［2］中的地圖舌診斷標準：舌背、舌腹或舌側(cè)出現(xiàn)斑塊呈地圖樣改變的病理變化，斑塊形狀不規(guī)則，與周圍的舌黏膜有明顯的分界線，顏色呈白色、紅色或黃白色，病變位置呈游走性。

1.1.2 中醫(yī)辨證標準 參照文獻［3］對兒童地圖舌證型進行辨證：① 脾胃虛弱證：見納呆食少，時有腹脹，身困乏力，大便可見溏薄，小便清長，面色或少華，舌質(zhì)淡苔薄，有剝脫，指紋色淡或脈沉細。② 陰液虧損證：體瘦，皮膚干燥，口干喜飲，時有盜汗，舌淡紅，苔薄花剝，指紋色紫或脈細。③ 氣陰兩虛證：納呆，身困乏力，自汗或盜汗，心慌氣短，口干，手足心熱，平素易感冒，舌淡，苔呈花剝，脈細弱或細數(shù)。④ 濕熱內(nèi)蘊證：腹脹，納少，肢體困重，大便黏膩不爽，小便色黃，舌紅，苔黃膩間有剝脫，脈滑數(shù)。⑤ 瘀血阻滯證：時有腹痛，呈刺痛，部位固定，舌淡或紫暗，苔薄有剝脫，或見舌下有瘀點，指紋紫暗或脈沉細。

1.1.3 納入標準 ① 年齡1～12歲；② 患兒及其法定監(jiān)護人同意納入本研究，愿意配合接受問卷及舌苔取樣者。

1.1.4 排除標準 ① 有合并心、腦、肺、腎等重要器官的原發(fā)性疾病或精神疾病患兒；② 資料不完全且無法配合舌苔取樣及問卷調(diào)查患兒。

1.1.5 脫落及中止試驗標準 ① 納入后未能夠按照規(guī)定要求完成研究者；② 研究期間自行要求退出者；③ 留取標本不符合要求者。

1.2 一般資料 收集2021年10月—2022年12月就診于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福州中醫(yī)院兒科門診、住院患兒中舌苔表現(xiàn)為地圖舌患兒30例（D組）及30例無地圖舌的健康兒童（Z組）。2組年齡構(gòu)成、性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。地圖舌患兒分為5種證型，見表2。該項目通過福州市中醫(yī)院倫理委員會批準（倫理審批號：LC-2022-119）。

表1 2組一般資料比較 例

表2 地圖舌組證型及患病情況

2 方 法

2.1 舌苔菌群樣本采集與保存 2組患兒用生理鹽水溶液漱口后，囑其在自然光線下充分暴露全舌。用口腔采樣拭子分別在兒童舌尖、舌中部、舌兩側(cè)及舌根處來回刮拭5～10次采集舌苔樣本，采樣后立即放入樣品的DNA保存液收集管內(nèi)，置于常溫內(nèi)留存。

2.2 舌苔樣本DNA提取及上機測序 使用MultiskanTMGO酶標儀對質(zhì)量合格的舌苔菌群DNA樣品的濃度進行定量分析，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。對16S rDNA基因V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增；使用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測文庫DNA片段的完整性及插入片段大小，使用Illumina高通量測序平臺進行測序。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 測序所得到的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控后嵌合體過濾拼接、過濾，剩余高質(zhì)量的Clean data用于后期分析；通過reads之間的overlap關(guān)系將reads拼接成Tags；采用QIIME軟件進行OTU聚類，獲得各樣品的OTU豐度表格；基于OTU和注釋結(jié)果進行樣品物種復(fù)雜度分析，采用Wilcoxon符號秩檢驗、Kruskal-Wallis秩和檢驗方法組間物種差異分析等。P＜0.05則差異為統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 2組OUT分類注釋統(tǒng)計 為進一步檢測2組的豐度差異顯著物種及特異菌，按97%的相似度進行OTU分類，統(tǒng)計每個樣本在每個OTU中的豐度信息，OTU的豐度初步說明樣本的物種豐富程度。通過Veen圖了解2組菌群的OTU分布差異，2組含有362個共有OTU，其中地圖舌組特有OTU 101個，健康組特有OTU 54個。見圖1。

圖1 2組OUT Veen圖分析

3.2 2組多樣性分析

3.2.1 物種Alpha多樣性分析 Alpha多樣性分析可反映菌群的豐富度和多樣性。其中Shannon、Simpson指數(shù)反映了群落的多樣性情況，Observer species、ACE、Chao1指數(shù)反映了群落的豐富度情況，J指數(shù)反應(yīng)了菌落的均勻度。分析結(jié)果顯示地圖舌組的Shannon、Simpson、ACE、Chao1、J指數(shù)均低于健康組。見圖2。

圖2 2組舌苔菌群Alpha多樣性分析

3.2.2 Beta多樣性分析 Beta多樣性分析是對多個樣本之間群落結(jié)構(gòu)和相似性的對比，分析不同組樣本之間菌群分布的差異，其差異越大，代表不同組間菌群結(jié)構(gòu)差異越大。本研究使用PCoA分析方法，以散點圖表現(xiàn)樣本間的距離來展現(xiàn)分組特征?；赨niFrac距離算法對樣本進行PCoA主坐標分析。主成分分析顯示，造成樣本差異性最大的主坐標成分是橫坐標PCo 1（解釋度為33.43%），其次是縱坐標PCo 2（解釋度為13.21%）。總體上地圖舌組患者口腔菌群的組成和健康組之間存在一定差異，地圖舌組個體間的離散程度較健康組明顯，提示地圖舌組舌苔菌群結(jié)構(gòu)個體間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 2組PCoA分析

3.2.3 地圖舌組和健康組的差異性物種分析 LEfSe分析通過線性判別分析（LDA），從各個分類水平上尋找地圖舌組與健康組舌苔菌群的主要差異物種，根據(jù)不同分組間舌苔菌群豐度的比較結(jié)果，選擇從門到屬進行分析，并建立進化分支圖，其中在LEfSe聚類樹中，藍色節(jié)點表示地圖舌組中起到重要作用的微生物群；橙色節(jié)點表示健康組中起到重要作用的微生物群；在不同分組中沒有發(fā)揮重要作用的微生物類群用黃色節(jié)點表示。由內(nèi)向外，各圈代表的物種水平依次是門、綱、目、科、屬。見圖4。

圖4 2組LEfSe分析聚類圖

通過LDA分析統(tǒng)計2組中有顯著作用微生物類群的LDA值，圖中每個柱狀圖均代表顯著差異物種。藍色代表地圖舌組，橙色代表健康組，其中對地圖舌組影響力最大的是隸屬于巴斯德氏菌目，對健康組影響力最大的是梭桿菌屬。見圖5。

圖5 2組LEfSe分析LDA圖

2組樣本中豐度差異顯著的物種（平均豐度前10的物種）。在屬水平上，地圖舌組在Haemophilus（嗜血桿菌）、Streptococcus（鏈球菌）、Rothia（羅思氏菌）、Graulicatella（顆粒鏈球菌）、Gemella（孿生球菌）均較健康組顯著升高（P＜0.05），健康組在Actinomyces（放線菌）、Leptotrichia（纖毛菌屬）、Megasphaera（巨球型菌）、Lachnoanaerobaculum（于默奧毛絨厭氧桿菌）、Atopobium（奇異菌）均較地圖舌組顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

4 討 論

地圖舌的發(fā)病機制尚無定論，因多數(shù)地圖舌無明顯的疼痛感，且具有自愈傾向，在臨床中常被忽略。近些年兒童的免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及消化系統(tǒng)疾病中地圖舌發(fā)病率逐漸提高，引起了大家的關(guān)注［4-9］。地圖舌可為相關(guān)疾病的發(fā)生提供預(yù)警信息。

針對地圖舌目前西醫(yī)的治療主要包括局部外用涂擦和口服2種［10-11］，但多以對癥治療為主，容易反復(fù)，未能體現(xiàn)地圖舌作為一些相關(guān)疾病的預(yù)警信息而發(fā)揮其未病先防的臨床意義。中醫(yī)學(xué)在整體觀念的指導(dǎo)下認為舌象能夠反映內(nèi)在臟腑的變化，可觀察疾病的淺深，正所謂“有諸內(nèi)必形諸外”，其中地圖舌與脾胃關(guān)系最為密切。小兒脾常不足，氣血生化乏源，且運化失司，易致食積郁而化熱或水濕內(nèi)生蘊而化熱而耗傷陰液以致病，臨床上治療多從脾胃虛弱、陰液虧損、濕熱內(nèi)蘊證型著手［12］。若病程日久者?？梢姎怅巸商摗鲅铚?，通過遣方用藥兼而治之。

舌診作為望診的主要內(nèi)容之一，是中醫(yī)臨證進行辨證論治獲取四診資料的重要方法，目前應(yīng)用微生態(tài)學(xué)相關(guān)檢測技術(shù)是研究舌苔客觀化的一種重要方法和延伸。通過研究疾病舌苔微生態(tài)的組成、分布規(guī)律及與正常菌群進行對比來發(fā)現(xiàn)疾病所呈現(xiàn)的舌象與舌苔微生態(tài)之間的相關(guān)性及規(guī)律。當疾病導(dǎo)致舌部菌群改變時，舌象也會隨之改變，不同疾病所示相同舌苔的細菌比例不同，舌苔菌群密集度、多樣性對特定疾病形成有重要意義，能夠為中醫(yī)病證的診斷提供依據(jù)。由此，利用高通量測序手段對地圖舌兒童與健康兒童進行菌群特征分析，進而發(fā)現(xiàn)內(nèi)在聯(lián)系有助于為臨床相關(guān)疾病的診斷及治療提供微生態(tài)學(xué)證據(jù)［13-14］。

本研究結(jié)果顯示：地圖舌兒童的舌苔菌群與健康兒童之間存在一定的差異性，具體表現(xiàn)為地圖舌兒童的舌苔菌群多樣性明顯低于健康兒童，說明受疾病影響地圖舌兒童的舌苔菌群組成和數(shù)量均發(fā)生一定的變化，出現(xiàn)舌苔菌群失調(diào)現(xiàn)象。在屬水平上，地圖舌兒童和健康兒童舌苔菌群存在差異，其中地圖舌組變形菌門下的嗜血桿菌屬、芽孢桿菌門下的鏈球菌屬及羅思氏菌、顆粒鏈菌、孿生球菌均較健康組顯著升高，這可能是地圖舌兒童區(qū)別于健康兒童舌苔的細菌類群。

嗜血桿菌為一類革蘭陰性的無鞭毛及芽孢的桿菌，其下包括21種細菌，其中對人有致病性的主要有8種，包括有常見的流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、溶血嗜血桿菌、杜克雷嗜血桿菌等，其中流感嗜血桿菌是引起學(xué)齡前兒童感染如肺炎、會厭炎、中耳炎、鼻竇炎等急性呼吸道感染的常見菌種之一［15-17］。臨床研究發(fā)現(xiàn)地圖舌的發(fā)生與呼吸道感染相關(guān)［4］，因此推測是否與嗜血桿菌屬下的菌群分布失調(diào)相關(guān)，臨床上對于地圖舌兒童可以進一步關(guān)注其呼吸系統(tǒng)的情況，做好防護以達到未病先防的目的。

此外，有學(xué)者通過回顧性研究發(fā)現(xiàn)，在銀屑病的患者中地圖舌是一種重要的口腔表現(xiàn)，在銀屑病伴見地圖舌的患者發(fā)病年齡早，且存在銀屑病陽性家族史的概率升高，并同時發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致銀屑病發(fā)病的免疫學(xué)機制與人體對鏈球菌的免疫反應(yīng)有關(guān)，鏈球菌通過產(chǎn)生侵襲性酶和外毒素而引起機體適應(yīng)性免疫反應(yīng)異常，適應(yīng)性免疫機制涉及Th1細胞、Th17細胞異?；罨约凹毎蜃覶NF-α、IL-23、IL-17等顯著升高，從而刺激大量的免疫細胞在表皮或真皮層浸潤和角質(zhì)形成，導(dǎo)致銀屑病皮損產(chǎn)生［18-19］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地圖舌組中鏈球菌較健康組偏高，這為臨床中在治療銀屑病伴見地圖舌的患兒提供從鏈球菌感染出發(fā)的治療新思路及中醫(yī)辨治地圖舌的新方向。

研究還初步探討地圖舌患兒不同證型的舌苔菌群組成，其中脾胃虛弱型、陰液虧損型、濕熱內(nèi)蘊型以奈瑟菌、普氏菌、韋榮氏球菌為主，但占比有所不同，瘀血阻滯型以擬桿菌為主。

綜上，此次研究觀察到地圖舌兒童的舌苔菌群的多樣性明顯低于健康兒童，并通過16S rDNA高通量測序及相關(guān)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)了兩者中差異明顯的菌屬為嗜血桿菌屬、鏈球菌屬、羅思氏菌、顆粒鏈球菌、孿生球菌，這可能是地圖舌兒童與健康兒童舌苔菌群差異菌種，為臨床辨證地圖舌兒童提供了相關(guān)的微生物學(xué)依據(jù)。研究結(jié)果在一定程度上說明地圖舌對于維護整個機體微生態(tài)的平衡十分重要。