魏利莎 沈鵬

摘要 ［目的］評(píng)估大黃酸對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)和豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2增殖的影響。［方法］用0.3～19.2 μg/mL大黃酸處理金黃色葡萄球菌，分光光度計(jì)法檢測(cè)肉湯培養(yǎng)法菌液在600 nm處的OD值，觀察并拍照平板培養(yǎng)法細(xì)菌的生長(zhǎng)情況；用1～5 μmol/L大黃酸處理加或未加脂多糖刺激的IPEC-J2細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。［結(jié)果］大黃酸在低劑量（0.3 μg/mL）時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有顯著抑制作用；大黃酸在高劑量（10 μmol/L）時(shí)對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的增殖也有顯著抑制作用，同時(shí)，大黃酸不能緩解脂多糖誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞的增殖抑制。［結(jié)論］低劑量的大黃酸可通過抑制腸道致病菌的生長(zhǎng)來緩解由致病菌引起的腸道炎癥，但不能直接作用于豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2。

關(guān)鍵詞 大黃酸；脂多糖；金黃色葡萄球菌；IPEC-J2細(xì)胞

中圖分類號(hào) R285? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2023）13-0146-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.13.035

Study on the Potential Mechanism of Rhein in the Treatment of Diarrhea

WEI Li-sha1，SHEN Peng2

（1.School of Marine and Biological Engineering，Yancheng Teachers University，Yancheng，Jiangsu 224000;2.Microbiological Laboratory，Yancheng Center for Disease Control and Prevention，Yancheng，Jiangsu 224000）

Abstract ［Objective］To evaluate the effect of rhein on the growth of Staphylococcus aureus and the proliferation of porcine small intestinal epithelial cell IPEC-J2.［Method］Staphylococcus aureus was treated with 0.3-19.2 μg/mL rhein.The OD value at 600 nm was detected by spectrophotometer for Staphylococcus aureus cultured in liquid medium，and the Staphylococcus aureus cultured in plate were observed and photographed.IPEC-J2 cells were treated with 1-5 μmol/L rhein with or without lipopolysaccharide （LPS） stimulation.The proliferation of IPEC-J2 cells was detected by CCK-8 kit.［Result］Rhein significantly inhibited the growth of Staphylococcus aureus at low dose （0.3 μg/mL）.Rhein could significantly inhibit the proliferation of IPEC-J2 cells at high dose （10 μmol/L） as well.Meanwhile，rhein could not alleviate the proliferation inhibition of IPEC-J2 cells induced by LPS.［Conclusion］Low-dose rhein can alleviate intestinal inflammation caused by intestinal pathogens through inhibiting the growth of intestinal pathogens，but it at least cannot directly act on porcine intestinal epithelial cells IPEC-J2.

Key words Rhein;LPS;Staphylococcus aureus;IPEC-J2 cells

基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目（82200976）。

作者簡(jiǎn)介 魏利莎（1992—），女，江蘇鹽城人，講師，博士，從事代謝性炎癥與腸道疾病方面的研究。

收稿日期 2023-02-02

腹瀉是全世界發(fā)病率和死亡率較高的疾病，大量證據(jù)表明，中藥可有效緩解腹瀉癥狀，特別是針對(duì)慢性腹瀉療效突出［1-3］。大黃是我國(guó)歷史最悠久、知名度最高的中藥之一，大黃酸（1，8- 二羥基-3-羧基蒽醌，Rhein）是富含于大黃根莖中的蒽醌類化合物，具有胃腸道保護(hù)作用［4］。有研究報(bào)道，大黃酸對(duì)多種細(xì)菌具有抑制作用［5-6］。但是對(duì)腸道致病菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是否也有同樣的抑制效果還不清楚。金黃色葡萄球菌是常見的引起病人腹瀉的腸道致病菌［7］。因此，該研究以大黃酸為代表，分別分析其對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的作用和對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2增殖的影響，從腸道細(xì)菌和腸上皮細(xì)胞2個(gè)角度，探討中藥治療腹瀉的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試材。IPEC-J2細(xì)胞來自美國(guó)菌種保藏中心（ATCC），由鹽城師范學(xué)院藥學(xué)院饋贈(zèng)；金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC29213）由江蘇省鹽城市疾病預(yù)防控制中心提供。

1.1.2 試劑。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（貨號(hào)022010），購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（貨號(hào)HB0109），購(gòu)自海博生物技術(shù)有限公司；胎牛血清（FBS，貨號(hào)FSP010），購(gòu)自依科賽生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基（貨號(hào)BL304A）、0.25%胰酶消化液（貨號(hào)BL512A）、Hanks緩沖液（貨號(hào)BL559A）、二甲基亞砜（DMSO，貨號(hào)BL165B），購(gòu)自蘭杰柯科技有限公司；100X青霉素-鏈霉素溶液（貨號(hào)E607011），購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；細(xì)菌試驗(yàn)大黃酸（貨號(hào)S31389），購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；細(xì)胞試驗(yàn)大黃酸（貨號(hào)HY-N0105），購(gòu)自MCE（MedChemExpress）公司；LPS（貨號(hào)L2880），購(gòu)自美國(guó)默克公司；細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒（CCK-8，貨號(hào)C0039），購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器。

細(xì)菌培養(yǎng)箱BC-J80S，上海博訊；722S可見分光光度計(jì)，上海新茂儀器有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱，賽默飛311；SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 營(yíng)養(yǎng)肉湯法培養(yǎng)金黃色葡萄球菌。

稱取0.06 g大黃酸（S31389）溶解于20 mL DMSO中配制成3 mg/mL母液，0.22 μm 濾器過濾后凍于-80? ℃?zhèn)溆?。金黃色葡萄球菌前1 d 晚上平板劃線，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落金黃色葡萄球菌于3 mL無菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃搖床培養(yǎng)2～3 h作為種子菌，準(zhǔn)備32個(gè)含3 mL無菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管，每管接種20 μL種子菌，按大黃酸 0、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6和19.2 μg/mL的工作濃度加入相應(yīng)體積母液，每個(gè)濃度重復(fù)4管，于37 ℃搖床培養(yǎng)過夜，第2天對(duì)試管拍照并用分光光度計(jì)測(cè)菌液在600 nm處的OD值。

1.2.2 平板法培養(yǎng)金黃色葡萄球菌。

分別將含0、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6和19.2 μg/mL大黃酸的瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，凝固后每平板加入100 μL種子菌并涂布，37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，第2天取出培養(yǎng)皿觀察并進(jìn)行拍照。

1.2.3 IPEC-J2細(xì)胞培養(yǎng)及處理。IPEC-J2細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS和1X青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在含5% CO2的37? ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代，吸掉廢液后先用Hanks緩沖液洗3遍，再用0.25%胰酶消化液消化3 min，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后按1∶3進(jìn)行傳代。

100 mg大黃酸（HY-N0105）粉末溶解于17 mL DMSO中配成20 mmol/L母液，經(jīng)0.22 μm濾器過濾后分裝凍存于-20 ℃冰箱，避免反復(fù)凍融。研究大黃酸對(duì)IPEC-J2細(xì)胞增殖影響時(shí)，共設(shè)置4組，0 μmol/L大黃酸組作為對(duì)照組（CK）、1 μmol/L大黃酸組作為處理①、10 μmol/L大黃酸組作為處理②、100 μmol/L大黃酸組作為處理③。每組重復(fù)10次。處理后細(xì)胞在37? ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

10 mg LPS粉末溶解于1 mL Hanks緩沖液中配成10 mg/mL母液，經(jīng)0.22 μm濾器過濾后分裝凍存于-20? ℃冰箱，避免反復(fù)凍融。研究大黃酸能否緩解LPS誘導(dǎo)引起的IPEC-J2細(xì)胞炎癥時(shí)，共設(shè)置4組，0 μmol/L大黃酸 + 0 μg/mL LPS作為對(duì)照組（CK）、0 μmol/L大黃酸 + 50 μg/mL LPS組作為處理①、1 μmol/L大黃酸 + 50 μg/mL LPS組作為處理②、5 μmol/L大黃酸 + 50 μg/mL LPS組作為處理③。每組重復(fù)10次。每組細(xì)胞先加入對(duì)應(yīng)濃度的大黃酸預(yù)處理1 h后，再加入對(duì)應(yīng)濃度的LPS進(jìn)行處理，然后在37? ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖。IPEC-J2細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用Hanks緩沖液洗滌3次，0.25%胰酶消化3 min，獲得細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照每孔0.5×103 cells接種到96孔板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，過夜培養(yǎng)后先加入相應(yīng)的處理，24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)于37? ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育3 h，在酶標(biāo)儀中檢測(cè)450和650 nm處的吸光度（A），用A450-A650值表示細(xì)胞的增殖能力。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

該試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，選用unpaired student t test方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大黃酸對(duì)IPEC-J2細(xì)胞增殖的影響

該研究在驗(yàn)證大黃酸能否緩解LPS誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞炎癥前，觀察不同濃度大黃酸對(duì)IPEC-J2細(xì)胞增殖的影響。如圖1所示，與CK相比，IPEC-J2細(xì)胞增殖能力隨著大黃酸處理濃度增加而減弱，10 μmol/L大黃酸（處理②）已能顯著抑制IPEC-J2細(xì)胞的增殖（P<0.001）。這表明大黃酸對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的增殖呈劑量依賴的抑制作用。

2.2 大黃酸對(duì)IPEC-J2細(xì)胞炎癥的緩解作用 從圖2可看出，與CK相比，經(jīng)50 μg/mL LPS（處理①）誘導(dǎo)后，IPEC-J2細(xì)胞增殖能力顯著下降（P<0.000 1）；與LPS組相比，無論用1 μmol/L大黃酸（處理②）或5 μmol/L大黃酸（處理③）預(yù)處理LPS刺激前的IPEC-J2細(xì)胞，均不能緩解之后LPS刺激引起的IPEC-J2細(xì)胞增殖抑制（P>0.05）。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，大黃酸緩解腹瀉的機(jī)制不是通過直接作用于IPEC-J2細(xì)胞。

2.3 大黃酸對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑制作用

該研究分別用肉湯培養(yǎng)法和平板培養(yǎng)法觀察0～19.2 μg/mL 大黃酸對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響。從圖3可以看出，隨著大黃酸處理濃度增加，過夜培養(yǎng)后菌液逐漸變得澄清。600 nm處的OD值結(jié)果（圖4）表明，0.3 μg/mL大黃酸已能顯著抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)（P<0.01）。平板培養(yǎng)法結(jié)果也顯示，隨著大黃酸處理濃度增加，金黃色葡萄球菌數(shù)量越來越少（圖5）。這說明大黃酸對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有抑制作用，且呈劑量依賴作用。

3 討論

腹瀉為臨床高發(fā)疾病，經(jīng)漫長(zhǎng)發(fā)展史可進(jìn)展為結(jié)直腸癌，威脅人類生命安全。越來越多的證據(jù)表明，腸道菌群失調(diào)與慢性腹瀉的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8］。目前，腸道致病菌引起的腹瀉以抗生素治療為主。然而，抗生素殺菌具有廣譜性，殺害致病菌的同時(shí)，體內(nèi)的益生菌也會(huì)受到影響，嚴(yán)重?fù)p害腸道功能；此外，長(zhǎng)期不合理使用抗生素，使得大量的致病菌產(chǎn)生耐藥性，影響治療效果且治療成本高［9］。最新研究表明，中藥正逐漸成為治療腹瀉特別是慢性腹瀉的最佳方案［10］，但其作用靶點(diǎn)與機(jī)制尚不清晰，而該研究則以大黃塊莖中的大黃酸為例，對(duì)其治病機(jī)理進(jìn)行了分析。

首先，該研究發(fā)現(xiàn)大黃酸在低劑量（0.3 μg/mL）時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有抑制作用，這與之前發(fā)現(xiàn)的大黃酸的殺菌功能相符［11-12］。該研究發(fā)現(xiàn)大黃酸不能直接緩解LPS誘導(dǎo)引起的IPEC-J2細(xì)胞的增殖抑制，反而本身對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的增殖呈劑量依賴的抑制作用，這與最近報(bào)道的大黃酸的潛在抗癌作用相符［13］。近年來，不同課題組利用動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大黃酸可以改善LPS誘導(dǎo)引起的大鼠腸屏障損傷［14］或緩解葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)引起的小鼠結(jié)腸炎［15］?？紤]到復(fù)雜的腸道內(nèi)環(huán)境，并不清楚大黃酸是直接還是間接作用于腸上皮細(xì)胞。該研究提供了直接的證據(jù)，大黃酸可能通過調(diào)節(jié)腸道微生物來間接改善受損的腸上皮細(xì)胞。然而，大黃酸對(duì)腸道細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制作用是否具有針對(duì)性，即對(duì)腸道益生菌的生長(zhǎng)是否也有抑制作用，以及對(duì)其他類型腸道致病菌的生長(zhǎng)是否同樣具有抑制作用等，都有待后續(xù)深入研究。

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