馮明橋 馮育才 勾偉 雷嬌嬌 韓繼懷 江龍 王尤 汪珊

摘要 ［目的］ 明確貴州省道真縣黨參莖基腐病的病原及其防治藥劑。［方法］ 利用組織分離法和柯赫氏法則進行病原菌的分離和致病性驗證，利用形態(tài)學(xué)與 rDNA－ITS 對致病菌進行鑒定，之后通過大田防治試驗測定5種殺菌劑對黨參莖基腐病的防治效果。［結(jié)果］ 引起道真黨參莖基腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）；殺菌劑大田防治試驗結(jié)果表明，50%多菌靈可濕性粉劑對病害的防治效果最佳，病害防治效果為81.63%；25%甲霜靈可濕性粉劑的防治效果次之，防治效果為74.49%；40%乙膦鋁可濕性粉劑、65%代森鋅可濕性粉劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑對黨參莖基腐病的防治效果較差為30.61%～51.02%。 ［結(jié)論］道真大沙河黨參莖基腐病的病原為尖孢鐮刀菌，50%多菌靈可濕性粉劑對黨參莖基腐病的防治效果較好。

關(guān)鍵詞 黨參；莖基腐??；鐮刀菌；病原菌鑒定；防治藥劑

中圖分類號 S435.672? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）13-0132-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.13.031

Identification of the Pathogen of Codonopsis pilosula Stem Base Rot and Screening of Its Control Agents

FENG Ming-qiao，F(xiàn)ENG? Yu-cai，GOU? Wei? et al

（Guizhou Dashahe Provincial Nature Reserve Administration Bureau， Daozhen，Guizhou?? 563500）

Key words ［Objective］ To identify the pathogen of stem base rot of Codonopsis pilosula in Daozhen County， Guizhou Province and its control agents. ［Method］ The pathogenic bacteria were isolated and verified by tissue isolation method and Koch's rule. The pathogenic bacteria were identified by morphology and rDNA ITS， and then the control effect of five fungicides on stem base rot of Codonopsis pilosula was determined by field control test. ［Result］ Fusarium oxysporum was the pathogen causing the stem base rot of Codonopsis pilosula.The field control experiment of fungicide showed that 50% carbendazim wettable powder had the best effect on disease control， and the disease control effect was 81.63%;the control effect of 25% metalaxyl wettable powder was the second， and the disease control effect was 74.49%;40% ethyl phosphine aluminum wettable powder， 65% Daisen zinc wettable powder and 70% thiophanate methyl wettable powder had a poor effect on the stem base rot of Codonopsis pilosula， which was 30.61%-51.02%. ［Conclusion］ The pathogen of stem base rot of Codonopsis pilosula in Daozhen Dasha River was F. oxysporum， and 50% carbendazim wettable powder had good control effect on stem base rot of Codonopsis pilosula.

Key words Codonopsis pilosula;Stem base rot;Fusarium oxysporum;Pathogen identification;Control agents

基金項目 貴州省林業(yè)廳2017年林業(yè)優(yōu)秀青年人才培養(yǎng)專項“洛黨參病蟲害調(diào)查及主要病蟲害綠色防控技術(shù)研究”（黔林科合J〔2017〕15號）。

作者簡介 馮明橋（1987—），男，貴州正安人，工程師，從事自然保護區(qū)管理及科學(xué)研究。通信作者，高級工程師，從事自然保護區(qū)科學(xué)研究。

收稿日期 2022-08-08

黨參（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.）為桔?？泣h參屬多年生草本植物，其根性平、味甘，具有補中益氣、健脾益肺之功效［1］，還具有免疫調(diào)節(jié)、改善胃潰瘍、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)糖脂代謝及抗腫瘤等藥理作用［2］。研究表明，黨參富含生物堿、聚炔類、木質(zhì)素類、黃酮類化合物和多糖等活性成分［3］。隨著市場需求加大，貴州黨參的種植面積不斷增加，病害問題日益加重。劉春葉等［4］在貴州道真縣洛黨參主要病害發(fā)生動態(tài)中發(fā)現(xiàn)了白粉?。⊿phaerotheca codonopisi）、根腐?。‵usarium oxysporiums）和銹病（Puccinia campanumoeae）。2021年，首次在道真的黨參上發(fā)現(xiàn)莖基腐病，為害面積

呈逐年上升趨勢，據(jù)調(diào)查，一般田間發(fā)病率為5%～10%，嚴(yán)重的達(dá)30%以上，該病害已成為制約當(dāng)?shù)攸h參發(fā)展的主要因素之一，嚴(yán)重影響了黨參的產(chǎn)量與品質(zhì)，給種植戶帶來巨大的經(jīng)濟損失［5］。筆者從形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)對黨參莖基腐病病原菌進行分離與鑒定、致病性的檢測及防治藥劑的簡單篩選，為進一步了解道真的黨參莖基腐病病害防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黨參來自貴州省道真縣陽溪鎮(zhèn)陽壩村黨參種植基地1年生苗。防治試驗所用藥劑見表1。

1.2 試驗地概況

田間試驗在貴州省道真縣陽溪鎮(zhèn)陽壩村（107°38′2″～107°38′41″E、29°8′18″～29°8′56″N）進行，平均海拔1 550.2 m，月平均氣溫0.6～22.6 ℃，空氣濕度11.2%～77.1%，pH 5.4～6.9。

1.3 病樣采集與病原菌分離和純化

2022年4月在貴州省道真大沙河自然保護區(qū)黨參生產(chǎn)基地采集發(fā)病植株，裝入塑封袋帶回實驗室。采用常規(guī)組織分離法，剪取莖基部病健交界處1 mm×1mm 組織塊在 75%乙醇中浸泡 5 s，然后轉(zhuǎn)移至1.5%次氯酸鈉溶液中消毒1 min，無菌水漂洗3次晾干，置于 PDA 培養(yǎng)基平板內(nèi)于 25 ℃培養(yǎng) 5～7 d。從菌落邊緣切取菌絲塊置于PDA 培養(yǎng)基，在25 ℃培養(yǎng)7～10 d。將分離純化的菌株轉(zhuǎn)接至PDA斜面4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 致病性測定

利用無菌昆蟲針挑取PDA培養(yǎng)的疑似致病菌的菌絲，穿刺黨參幼苗莖部，后用無菌土掩埋莖基部。每個菌株接種處理30株黨參苗，以無菌昆蟲針穿刺黨參幼苗莖部作為對照。以上接種處理30 d后，觀察并記錄黨參發(fā)病情況，統(tǒng)計發(fā)病率和病情指數(shù)。病情指數(shù)根據(jù)分級標(biāo)準(zhǔn)進行測定：0級，莖基部沒有病斑；1級，莖基部有輕微病斑，病斑面積占 5%；3級，莖基部有病斑，病斑面積占10%；5級，莖基部有嚴(yán)重病斑，病斑面積占25%；7級，莖基部有嚴(yán)重病斑，病斑面積占50%以上［6］。病害發(fā)生率和病情指數(shù)的計算公式：

病害發(fā)生率=發(fā)病株數(shù)調(diào)查總株數(shù)×100%

病情指數(shù)=（各級發(fā)病數(shù)×相對應(yīng)病級）調(diào)查總株數(shù)×5×100

1.5 黨參莖基腐病病原菌的鑒定

參考Weir等［7］方法進行病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定，主要對病原菌菌落特征、顏色、菌絲及孢子大小等進行觀察。參考李婕等［8-9］的方法利用rDNA -ITS分子測序?qū)Σ≡M行測序，具體方法：首先利用CTAB法提取病原菌總DNA，利用真菌通用引物ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′）和 ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）進行序列擴增，PCR擴增體系和反應(yīng)程序與漆永紅等［6］的方法一致。得到序列后通過NCBI的Blast 進行序列的比對分析，同時利用 MEGA 7.0進行包含致病菌 ITS 序列在內(nèi)的系統(tǒng)進化樹，綜合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)的方法進行病原菌的鑒定。

1.6 田間防治試驗

設(shè)計5個處理，即表1中的5種藥劑，清水處理作為對照。每個處理的小區(qū)面積為2 m×10 m，每個處理3個重復(fù)。于2022年5月試驗地有莖基腐病發(fā)生時開始藥劑噴施，從第1次噴施開始，每隔10 d噴藥1次，連續(xù)噴藥3次。每種藥劑的用量為1 500 g/hm2。在最后一次噴藥10 d后統(tǒng)計黨參莖基腐病的病害發(fā)生率和病情指數(shù)進而計算防治效果。防治效果計算公式：

防治效果=對照病情指數(shù)-處理對照指數(shù)對照病情指數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 黨參莖基腐病致病菌分離及致病性檢測

道真黨參莖基腐病田間發(fā)病癥狀見圖1A。黨參莖基腐病發(fā)生初期，在莖的基部產(chǎn)生白色的小菌落，腐爛狀，向上延伸至葉片周圍，葉片感病以后變薄變透明的同時逐漸腐爛，其間葉子漸變成黃綠色。后期莖基和葉片成水漬狀癱軟匍匐在地上，直至整個植株稀爛于地上。采用組織分離法由黨參莖基部分離獲得真菌20余菌株，通過形態(tài)學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)其中15種屬于鐮刀菌屬（Fusarium spp.）真菌。選取15個鐮刀菌屬真菌中的5個菌株（DS-1、DS-2、DS-3、DS-4、DS-5）進行黨參大田的回接試驗，發(fā)現(xiàn)5個菌株均可引起黨參莖基腐?。▓D1B）。5個菌株引起黨參莖基腐病的病害發(fā)生率為85%～92%，病情指數(shù)為76～88。其中，菌株DS-4的發(fā)病率和病情指數(shù)最高分別為92%和88。

2.2 黨參莖基腐病病原菌的形態(tài)學(xué)特征

對回接試驗引起發(fā)病的5個菌株進行形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)其在PDA培養(yǎng)基上的顏色、質(zhì)地相同，菌絲和孢子一致。在PDA培養(yǎng)基上菌落白色、粉色至紫色。大型分生孢子鐮孢形，中間粗，兩端尖細(xì)，具3～5個橫隔膜，多為3個隔，大小為（23.5～32.9）μm×（2.4～3.5）μm，足胞明顯。小型分生孢子橢圓形、長橢圓形，單胞，無色，假頭狀，大小為（3.5～14.1）μm×（1.8～2.9）μm。根據(jù)形態(tài)特征，查閱真菌鑒定手冊，5個引起黨參莖基腐病菌株的形態(tài)學(xué)特征與尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）一致（圖2）。

2.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

隨機選取5個致病菌株的1個進行DNA的提取和rDNA-ITS序列的擴增。結(jié)果獲得長度為541 bp 的序列。 NCBI 的 Blast 比對結(jié)果顯示，該序列與 GenBank 登錄號為MW760815的F.oxysporum的序列覆蓋度為 100%，序列相似性為 100% 。由圖3可知，致病菌株的ITS序列與尖孢鐮刀菌聚為一類，親緣關(guān)系較近。由此結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定黨參莖基腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌。菌株DS-4的GenBank號為OP164704。

2.4 不同殺菌劑對黨參莖基腐病的田間防治效果

由表2可知，清水處理下黨參莖基腐病的發(fā)生率達(dá)95%，且病情指數(shù)較高達(dá)98。5種藥劑處理下，黨參莖基腐病的病害發(fā)生率和病情指數(shù)均有所下降。其中，多菌靈600倍液處理下的病害發(fā)生率最低為28%，病情指數(shù)為18，防治效果達(dá)81.63%；其次是甲霜靈500倍液處理下的病害發(fā)生率為35%，病情指數(shù)為25，防治效果達(dá)74.49%。而另外3種藥劑處理，黨參莖基腐病的病害發(fā)生率均高于56%，防治效果36.73%～51.02%。

3 結(jié)論與討論

貴州道真地區(qū)春季濕熱多雨，黨參4—5月處于幼苗時期，易受病害的侵染，而對病害的有效防治必須要準(zhǔn)確掌握引起病害的病原菌［10］，故該研究對貴州道真黨參的莖基腐病致病菌進行分離純化、致病性檢測，并通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)進行分析，確定引起黨參莖基腐病的主要致病菌為尖孢鐮刀菌。尖孢鐮刀菌是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中土傳病害的重要病原菌之一，具有很強的寄生和腐生能力，目前已報道的黨參病害中，尖孢鐮刀菌是根腐病病原菌的優(yōu)勢菌種［11-13］。該試驗中，選取5種常用化學(xué)藥劑對黨參莖基腐病進行簡單的防治，結(jié)果表明，多菌靈對黨參莖基腐病的防治效果較好，為黨參莖基腐病的田間防治提供理論依據(jù)。但需要注意的是，該研究的防治試驗是在發(fā)病初期開始連續(xù)噴施，進而取得了更好的防治效果。不同地區(qū)應(yīng)根據(jù)病害發(fā)生規(guī)律，在早期予以施藥。此外，需要注意在病害防治過程中，長期且單一地使用同一種化學(xué)藥劑進行病害防治，病原菌可能會對其產(chǎn)生抗性，防治效果會逐漸減弱，故在實際生產(chǎn)中，應(yīng)多種藥劑交替使用，且發(fā)現(xiàn)病株以后，應(yīng)及時對病害侵染地進行消殺工作，防止其進一步擴大。

參考文獻(xiàn)

［1］ 李忠虎，藺海明，陳垣，等.不同干燥方式對黨參多糖含量的影響［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，42（3）：64-67.

［2］ 劉美霞，戚進，余伯陽.黨參藥理作用研究進展［J］.海峽藥學(xué)，2018，30（11）：36-39.

［3］ 謝琦，程雪梅，胡芳弟，等.黨參化學(xué)成分、藥理作用及質(zhì)量控制研究進展［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2020，54（8）：94-104.

［4］ 劉春葉，張盈，廖國會，等.貴州道真縣洛黨參主要病害發(fā)生動態(tài)及防控對策［J］.中國植保導(dǎo)刊，2018，38（9）：53-57.

［5］ 龔成文，米永偉，漆永紅，等.甘肅中藥材連作障礙問題探析［J］.甘肅科技，2020，36（4）：153-155.

［6］ 漆永紅，李敏權(quán)，曹素芳，等.黨參莖基腐病鐮孢菌鑒定及其對殺菌劑的敏感性研究［J］.農(nóng)學(xué)學(xué)報，2021，11（2）：74-78.

［7］ WEIR B S，JOHNSTON P R，DAMM U.The Colletotrichum gloeosporioides species complex［J］.Studies in mycology，2012，73（1）：115-180.

［8］ 李婕，李永川，楊虹，等.甘蔗黑腐病病原菌的鑒定［J］.云南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2014，36（1）：139-143.

［9］ 劉小玉，余鳳玉，付登強，等.油茶炭疽病病原菌的分離與鑒定［J］.中國果菜，2018，38（11）：40-42.

［10］ 王珊珊，乜蘭春，李潘，等.植物病原真菌毒素的分類、致病機制及應(yīng)用前景［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（3）：94-97.

［11］ 趙純森，李德望，衛(wèi)揚斗，等.黨參根腐病病株上分離的幾種病原真菌的致病性及其生物學(xué)特性：黨參根腐病研究續(xù)報Ⅰ［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，1989，28（6）：23-25.

［12］ 余中蓮，雷美艷，蒲盛才，等.重慶黨參真菌病害種類調(diào)查及病原鑒定［J］.中藥材，2015，38（6）：1119-1122.

［13］ 孫新榮，張西梅，高薇薇，等.甘肅黨參根腐病發(fā)生危害與防治［J］.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，65（12）：90-91.