陳菲，張亞玲，王芳，李泓漪，周延，翁泳佳，程彩霞

1.山西醫(yī)科大學，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院，山西太原 030001；3.山西醫(yī)科大學轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心，山西太原030010

食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率分別位于我國第三和第四［1］。食管癌組織學類型主要分為食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC），我國以ESCC 為主。目前ESCC 的主要治療手段包括手術(shù)、化療和放療，其中放化療效果顯著，但仍有局限性，高等級發(fā)生率ESCC 患者5 年生存率僅10%［2］。目前，分子靶向治療在多種實體腫瘤中治療效果顯著，也成為ESCC治療的研究熱點［3］。

研究顯示，癌癥通過獲取體細胞遺傳學改變，進而調(diào)控與細胞生長和凋亡相關(guān)基因的功能［4］。通過對這些癌基因和抑癌基因靶向改變的鑒定，使得對癌癥發(fā)病機理的認知加速，特別是以體細胞拷貝數(shù)變異（somatic copy number variation，SCNV）為靶標的遺傳學改變，其在腫瘤發(fā)生和癌癥治療中起核心作用［5］。SCNV具有使抑癌基因失活和活化癌基因的潛能，因此在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［6-7］。

本實驗前期對104 份ESCC 患者腫瘤樣本進行了14對全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）和90 對外顯子測序（whole exome sequencing，WES），并運用GISTIC 2.0 軟件對14 例WGS 分析SCNV，發(fā)現(xiàn)126個顯著改變區(qū)域，包括8q24.13-8q24.21，F(xiàn)AM84B包含其中。在104份樣本中，46份FAM84B基因發(fā)生拷貝數(shù)擴增，已經(jīng)過熒光原位雜交試驗（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）驗證這一結(jié)果；59份FAM84B顯著高表達。提示FAM84B的擴增及其蛋白表達水平的升高與ESCC進展有關(guān)，F(xiàn)AM84B可能是ESCC易感性的潛在診斷標志［8］。FAM84B也稱LRATD2，位于染色體8q24.21，在其他癌癥中已證實該區(qū)域染色體擴增［9］。一些研究顯示，F(xiàn)AM84B基因拷貝數(shù)擴增與癌癥發(fā)生密切相關(guān)：FAM84B在乳腺癌［10］、前列腺癌［11］、ESCC［8］中表達增高；此外，F(xiàn)AM84B在前列腺癌細胞中顯著高表達促進細胞侵襲、裸鼠成瘤和肺轉(zhuǎn)移［12］。但FAM84B的作用機制尚不清楚。本研究通過體外試驗探索FAM84B基因在ESCC 中的表達及其生物學功能，及其對ESCC細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1細胞及質(zhì)粒人ESCC細胞系KYSE150、KYSE450、TE-1 及食管上皮細胞系NE-3 購自ATCC，由山西醫(yī)科大學轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心樣本庫儲存；質(zhì)粒pCMV-3 × flag-FAM84B購自北京普爾普樂生物技術(shù)有限公司。

1.2主要試劑及儀器FAM84B小干擾試劑、riboFECTTMCPReagent 轉(zhuǎn)染試劑購自廣東銳博生物科技有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)基、0.25%胰酶、胎牛血清購自美國Hyclone 公司；MTT、二甲基亞砜和optiMEM購自美國Sigma 公司；Lipo2000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；兔抗人FAM84B、CDK4、CDK6、CCND1多克隆抗體購自美國Abcam 公司；鼠抗人GAPDH、p53、p21 多克隆抗體購自武漢三鷹生物科技有限公司；IRDye?800CW 熒光二抗購自美國LICOR 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑、SYBRgreen、Stepone plus PCR 儀購自日本TaKaRa公司；96、6孔細胞培養(yǎng)板購自美國康寧公司；酶標儀購自美國BioTek公司；實時熒光PCR儀和定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3臨床樣本 508份ESCC腫瘤樣本及其鄰近正常組織收集自中國食管癌高發(fā)區(qū)山西省腫瘤醫(yī)院和新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院。本研究獲得山西醫(yī)科大學機構(gòu)審查委員會和研究委員會批準，并獲得所有參與者書面同意。508 對腫瘤和正常組織樣本由2名病理學家獨立使用蘇木精和伊紅（H＆E）染色診斷為ESCC。508 名ESCC 患者的醫(yī)療記錄和生存數(shù)據(jù)均已獲得。

1.4SCNV 分析及數(shù)據(jù)庫查詢 用BIC-seq253鑒定ESCC中SCNV；GISTIC 2.05識別復發(fā)性臂級和局灶性SCNA 節(jié)段；癌癥基因組圖譜（the cancer genomeatlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫或其他癌癥基因組數(shù)據(jù)庫的cBiobrowser分析ESCC中FAM84B擴增情況。

1.5細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清和1%雙抗的RMPI-1640 培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)KYSE150、KYSE450、TE-1、NE-3細胞，細胞融合度為85%～95%時傳代，0.25%胰酶消化，收集生長狀態(tài)良好的細胞進行后續(xù)試驗。

1.6小干擾RNA轉(zhuǎn)染 將細胞以3×105個／孔接種6 cm培養(yǎng)皿中，每孔培養(yǎng)液最終體積為3 mL，細胞密度達30%～50%時進行轉(zhuǎn)染，設(shè)150-NC（未轉(zhuǎn)染組）和FAM84B-Si1 和FAM84B-Si2 轉(zhuǎn)染組。將1 × ribo-FECTTMCPBuffer 240 μL、20 μmol／L siRNA 儲存液10 μL、riboFECTTMCPReagent 轉(zhuǎn)染試劑20 μL 混勻，室溫靜置15 min 后加入6 cm 培養(yǎng)皿，48 ～72 h 后收集細胞，實時熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染效率。siRNA序列分別為：5'-CCCGCACTGGGCCGTATAT-3'和5'-CCTACCGGCTGCAGATTCA-3'。

1.7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將細胞接種至10 cm 培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液最終體積為8 mL。設(shè)450-NC（未轉(zhuǎn)染組）和FAM84B-EXP 轉(zhuǎn)染組。將1 mL optiMEM 與24μL Lipo2000 混勻，制成A 液，將1 mL optiMEM 與24 μg 質(zhì)粒pCMV-3 × flag-FAM84B混勻，制成B 液；將A液室溫孵育5 min后加入B液混勻，靜置15 ～20 min；將混合液加入10 cm培養(yǎng)皿中，4 ～6 h后換成無雙抗安全培養(yǎng)基，48 h后收集細胞沉淀，Western blot 法檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.8實時熒光定量PCR 法 用Trizol 和氯仿法提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，用Stepone plus PCR儀和SYBRgreen 進行實時熒光定量PCR 反應。根據(jù)GenBank中登錄的FAM84B序列（NC_000008.11）及Primer Premier 5 軟件設(shè)計特異性擴增引物。FAM84B（前鏈）：5'-ACCCACCTAAGTTACAAGGAAG-3'，F(xiàn)AM84B（后鏈）：5'-GTAGAACACGGAGCATTCCAC-3'；GAPDH（前鏈）：5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'，GAPDH（后鏈）：5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。引物由Thermo公司合成。反應體系為：ddH2O 10.5μL，cDNA模板1μL，ROX 0.5μL，MIX酶12.5μL，上、下游引物各1μL。反轉(zhuǎn)錄反應條件：37 ℃15 min；85 ℃5 s；4 ℃+∝。qPCR 反應條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃34 s，40 個循環(huán)；95 ℃15 s；60 ℃1 min；95 ℃15 s。所有樣本重復檢測3 次。利用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.9Western blot 法 將細胞收集至1.5 mL 離心管中，用含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液冰上溶解1 h；4 ℃，12 000×g離心30 min，BCA 法測定蛋白濃度。取50 μg，經(jīng)10% SDS-PAGE 分離后，4 ℃，300 mA 轉(zhuǎn)膜2 h；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入兔抗人FAM84B、CDK4、CDK6、CCND1 多克隆抗體和鼠抗人GAPDH、p53、p21多克隆抗體（均1∶500稀釋），4 ℃過夜；加入IRDye?800CW 熒光二抗（1∶1 000稀釋），室溫避光孵育2 h。使用Image J軟件分析圖像，以目的條帶和GAPDH 條帶灰度分析值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.10MTT 試驗 將細胞以5 000 個／孔接種96 孔板，設(shè)5 ～7 個復孔，每孔培養(yǎng)液終體積為200 μL，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48、72、96 h 后，棄培養(yǎng)液，加入5 mg／mL MTT，20 μL／孔，37 ℃恒溫培養(yǎng)4 h；棄培養(yǎng)液，加入DMSO，200 μL／孔，孵育10 min；上酶標儀檢測A600。

1.11硬克隆形成試驗 將細胞以500 個／孔接種6孔板，每孔培養(yǎng)液終體積為2 mL，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 ～14 d；PBS 洗滌2 次，4%多聚甲醛固定30 min；0.5%結(jié)晶紫染色25 ～30 min；顯微鏡下＞50個細胞為可計數(shù)克隆。

1.12統(tǒng)計學分析 采用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。呈正態(tài)分布計量資料的比較采用t檢驗和單因素方差分析，非正態(tài)分布計量資料的比較采用秩和檢驗。檢驗水準α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1FAM84B基因在ESCC中拷貝數(shù) 擴增結(jié)果顯示，F(xiàn)AM84B存在于8q24.21附近，并且存在1個顯著放大的病灶峰（q=4.37 E-28），在508 份腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)109份FAM84B基因拷貝數(shù)擴增（21.45%）。FAM84B基因拷貝數(shù)擴增比例為23.9%（23／96），高于其他癌種。見圖1。表明FAM84B基因在ESCC 中存在顯著拷貝數(shù)擴增現(xiàn)象。

圖1 GISTIC 2.0軟件對ESCC隊列SCNV變化的分析Fig.1 Analysis of SCNV changes of ESCC cohort by GISTIC 2.0 software

2.2ESCC 細胞中FAM84B敲低和過表達效率驗證在NE-3、KYSE150、TE-1、KYSE450細胞中，KYSE150和TE-1 細胞FAM84BmRNA 水平較高，見圖2A。與150-NC 組相比，F(xiàn)AM84B-Si1 和FAM84B-Si2 組敲低效率分別為（57.65±20.06）%和（68.10±1.05）%（F分別為6.334、7.156，P均＜0.01），見圖2B；FAM84BEXP 組的過表達效率為（65.22±7.07）%，與450-NC組相比差異有統(tǒng)計學意義（F=4.131，P＜0.05），見圖2C。

圖2 ESCC細胞系中FAM84B表達水平Fig.2 Expression level of FAM84B in ESCC cell line

2.3敲低FAM84B對ESCC細胞增殖的抑制作用 MTT試驗結(jié)果顯示，在KYSE150 細胞中，敲低FAM84B表達后，細胞增殖能力降低，見圖3A。平板克隆形成試驗結(jié)果顯示，在KYSE150 細胞中，與150-NC 組克隆數(shù)［（172±10）個］相比，F(xiàn)AM84B-Si1、FAM84B-Si2 組克隆數(shù)［（46±3）和（47±5）個］減少，差異有統(tǒng)計學意義（F分別為6.451、6.122，P均＜0.01），見圖3B、3C。表明FAM84B促進KYSE150細胞增殖。

圖3 敲低FAM84B ESCC細胞系KYSE150細胞的增殖變化情況Fig.3 Proliferation changes of ESCC cell line KYSE150 with knockdown of FAM84B

2.4過表達FAM84B對ESCC 細胞增殖的促進作用MTT試驗結(jié)果顯示，在KYSE450細胞中，過表達FAM84B后，細胞增殖能力增強，見圖4A。平板克隆形成試驗結(jié)果顯示，在KYSE450 細胞中，與450-NC 組克隆數(shù)［（75 ± 7）個］相比，過表達FAM84B后，F(xiàn)AM84BEXP 組克隆數(shù)［（163±10）個］增多，差異有統(tǒng)計學意義（F=5.634，P＜0.01），見圖4B。表明FAM84B促進KYSE450細胞增殖。

圖4 過表達FAM84B ESCC細胞系KYSE450的增殖變化情況Fig.4 Proliferation changes of ESCC cell line KYSE150 with overexpression of FAM84B

續(xù)圖4 過表達FAM84B ESCC細胞系KYSE450的增殖變化情況Fig.4（Continued）Proliferation changes of ESCC cell line KYSE150 with overexpression of FAM84B

2.5敲低FAM84B對p53介導的細胞周期的促進作用與150-NC組相比，F(xiàn)AM84B-Si1和FAM84B-Si2組、p53、p21表達升高，CDK4、CDK6、CCND1表達降低，見圖5。表明FAM84B可能通過調(diào)節(jié)p53信號通路，影響CDK4／CDK6／CCND1復合物表達，進而影響細胞周期。

圖5 Western blot 檢測敲低FAM84B KYSE150 細胞系中蛋白表達情況Fig.5 Detection of protein expression in KYSE150 cell line with knockdown of FAM84B by Western blot

3 討論

SCNV 是癌癥中最重要的體細胞畸變之一，其在腫瘤發(fā)生和癌癥治療中起核心作用。其中，致癌基因激活通常是因為染色體拷貝數(shù)擴增，而腫瘤抑制基因失活通常由與突變相關(guān)的雜合性缺失或純合性缺失引起。因此，SCNV 的研究在癌癥的預后和治療改善中起重要作用［5］。本研究對508份ESCC患者的石蠟組織進行WGS 和WES，發(fā)現(xiàn)FAM84B基因在ESCC中拷貝數(shù)擴增。在另一項小型隊列研究中（n=59），發(fā)現(xiàn)39 例（66%）ESCC 患者中FAM84B 表達增加［13］。另外，F(xiàn)AM84B基因擴增及其在蛋白質(zhì)水平表達升高也存在于臨床前病變中［8，14］。其他腫瘤中也發(fā)現(xiàn)FAM84B基因上調(diào)，如前列腺癌、乳腺癌和黑色素瘤［15］，并證實與前列腺癌、乳腺癌和ESCC的不良預后有關(guān)。本研究敲低FAM84B后，ESCC 細胞系KYSE150的MTT和硬克隆形成試驗結(jié)果顯示，細胞增殖減慢；而過表達FAM84B后，ESCC 細胞系KYSE450 的MTT和硬克隆形成試驗結(jié)果顯示，細胞增殖加快。因此，F(xiàn)AM84B拷貝數(shù)擴增很可能與ESCC增殖有關(guān)。

P53是經(jīng)典的腫瘤抑制蛋白，其在腫瘤生長過程中控制細胞周期、DNA復制和不受控制的細胞分裂［16］。其中，控制細胞周期是通過抑制細胞周期由G1 期向S 期轉(zhuǎn)化，使細胞周期停滯來實現(xiàn)［17］。當p53 蛋白發(fā)生突變或聚集時會失去功能，導致腫瘤進展和生長［18］。p53 的一個廣泛公認的轉(zhuǎn)錄靶標是p21，其充當各種p53功能的下游介質(zhì)，如誘導細胞生長停滯和衰老［19］。已有研究顯示，p53 在ESCC 的診斷和治療中均是有效的分子靶標［20］。因此，本研究對FAM84B與p53之間的關(guān)系進行了探討。結(jié)果顯示，敲低FAM84B后，Western blot分析顯示，p53、p21蛋白表達升高，而CDK4／CDK6／CCND1 復合物表達降低。在一項乳腺癌的的研究中也發(fā)現(xiàn)，用CDK4／6 抑制劑處理過的乳腺癌細胞系中，p21表達水平降低［21］。因此，F(xiàn)AM84B可能通過抑制p53進而促進ESCC細胞增殖。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM84B基因在ESCC 中拷貝數(shù)擴增，并且可能通過抑制p53介導的周期蛋白的合成，促進ESCC細胞在體外增殖。因此，F(xiàn)AM84B基因可能作為ESCC潛在的新治療靶點，但FAM84B在腫瘤發(fā)生中的作用復雜，其在ESCC中的作用機制尚需進一步探討。