程小玲，施金榮，張雪婷，申璦琳，何婧雯，程堯，段凱

武漢生物制品研究所有限責任公司，湖北武漢430207

新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）是由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARSCoV-2）引起的急性感染性肺炎［1］。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）統(tǒng)計數據顯示，截至2022年4月4日，全球489 779 062人確診感染SARACoV-2，導致超過615 萬人死亡［2-3］。SARS-CoV-2 為冠狀病毒科單股正鏈RNA 病毒，是造成COVID-19疫情大暴發(fā)的主要病原體［4-7］。為應對COVID-19 的全球流行，各國紛紛開始研制如核酸疫苗、滅活疫苗等多種類型的疫苗，以期通過接種疫苗的方式預防COVID-19，阻斷SARS-CoV-2 在人群中的傳播以及降低重癥率［8-9］。而通過哺乳動物細胞系制備的生物制品可能含有外源性宿主細胞殘留的雜質，因此必須在下游工藝對宿主細胞DNA、宿主細胞蛋白質等進行清除［10-11］。其中，宿主細胞的外源性DNA 進入人體后存在一定的安全風險，可能傳遞引發(fā)腫瘤，或存在的逆轉錄病毒整合至人體基因組后導致病毒感染，從而威脅疫苗接種者的健康，因此，對疫苗的宿主細胞DNA殘留量進行檢測是疫苗生產過程中非常重要的一項質量控制環(huán)節(jié)［12-14］。

目前國內常用的外源性DNA殘留量檢測方法主要有DNA 探針雜交法、熒光染色法和定量PCR 法。其中探針雜交法耗時長，步驟繁瑣，且僅為半定量，不夠準確［15］；熒光染色法較為簡便，耗時短，但線性范圍較窄，靈敏度低，DNA 殘留量低于1.25 ng／mL 時一般無法準確定量［16-17］。實時定量PCR 方法近年發(fā)展迅速，廣泛應用于分子生物學、醫(yī)藥等多個研究領域，其優(yōu)勢在于可通過觀察熒光信號的積累確定PCR反應中的初始模板量，從而達到更高的檢測精度。本研究旨在建立SARS-CoV-2 滅活疫苗（Vero 細胞）中宿主細胞DNA 殘留量熒光定量PCR 檢測方法，并進行驗證。

1 材料與方法

1.1供試品 SARS-CoV-2滅活疫苗（Vero 細胞）原液（批號分別為202110Y040、SX202201Y001、SX202201-Y002、SX202201Y003、SX202201Y004、SX202202Y005）由本公司制備。

1.2主要試劑及儀器 Vero 殘留DNA 檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）和宿主細胞殘留DNA 樣本前處理試劑盒（磁珠法）購自湖州申科生物技術有限公司；異丙醇、無水乙醇等試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司；熒光定量PCR 儀（型號：ABI 7500Fast）購自美國ABI 公司；HCD 前處理系統(tǒng)（型號：SKRDP-32）購自湖州申科生物技術有限公司。

1.3供試品殘留DNA 的提取 采用磁珠法對供試品中DNA 進行提取和純化，按試劑盒說明書操作：取100 μL 供試品，加入10 μL 濃度為5 mol／L 的氯化鈉溶液、10 μL 蛋白酶K 及100 μL 蛋白酶K 緩沖液，混勻，55 ℃孵育1 h 后，置于HCD 前處理系統(tǒng)，在深孔板對應孔內加入工作結合液、異丙醇、洗滌液A、洗滌液B、磁珠及洗脫液，使用rDNA purify 程序進行提取，洗脫后收集DNA。

1.4定量PCR 反應 采用Taqman探針法，根據試劑盒說明書操作，對供試品中Vero 細胞DNA 含量進行測定。按照試劑盒說明書配制PCR 反應體系Vero熒光定量PCR Mix，使用7500Fast 定量PCR 儀進行DNA片段擴增，兩步法反應程序設置：選擇報告熒光基團FAM，猝滅熒光基團為none，檢測參比熒光ROX。95 ℃預變性10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 個循環(huán)；反應體積30μL。每個循環(huán)退火延伸步驟結束時采集熒光信號，根據標準曲線計算供試品Vero 細胞DNA的初始濃度。

1.5方法的驗證

1.5.1線性范圍 使用Vero殘留DNA檢測試劑盒中的Vero DNA 定量參考品（S0）配制濃度為300（S1）、30（S2）、3（S3）、0.3（S4）、0.03（S5）、0.003（S6）pg／μL的參考品，以循環(huán)數（CT值）為橫坐標，DNA 濃度為縱坐標繪制標準曲線，計算R2、斜率以及標準品、陰性質控（NCS）和無模板對照（NTC）的CT值。試驗重復3次。

1.5.2重復性和中間精密度 取供試品（批號：202110-Y040）12份，每份100μL，其中6份分別加入30 pg／μL的標準品10μL 作為加標供試品，由檢驗員1在同一設備上分別對供試品及加標供試品進行6 次平行提取DNA 和宿主細胞DNA 含量測定，分別計算供試品和加標供試品6 次平行測定結果間的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），驗證方法的重復性。由檢驗員2 在不同時間對同一批供試品和加標供試品分別進行6次平行提取DNA和宿主細胞DNA含量測定，分別計算供試品和加標供試品6 次平行測定結果間及不同人員供試品和加標供試品測定結果間的RSD，驗證方法的中間精密度。

1.5.3定量限 配制濃度分別為0.01、0.003、0.001、0.000 3 pg／μL 的標準品，重復測定6 次，計算同一濃度測定結果間的RSD及回收率。重復孔的變異系數（CV）≤30%且回收率為50% ～150%的濃度確定為該方法的定量限。

1.5.4專屬性 使用樣品稀釋液和純化液稀釋液對供試品及加標供試品進行稀釋，對供試品及加標供試品進行3 次平行提取DNA 和宿主細胞DNA 含量測定，分別計算不同稀釋條件下供試品和加標供試品測定結果間的RSD。

1.5.5耐用性 取供試品和加標供試品，分別于53、55、57 ℃條件下孵育60 min，55 ℃條件下孵育56、60、64 min，對供試品及加標供試品進行平行提取DNA和宿主細胞DNA 含量測定，計算不同孵育溫度及孵育時間測定結果間的RSD。

1.5.6準確度 對供試品及加標供試品分別進行6次平行提取和宿主細胞DNA 含量測定，計算供試品及加標供試品6 次平行測定的加標回收率，以及供試品和加標供試品測定結果間的RSD。

1.6方法的適應性 采用建立的方法檢測5 批（批號：SX202201Y001、SX202201Y002、SX202201Y003、SX202201Y004、SX202202Y005）SARS-CoV-2 滅活疫苗（Vero 細胞）原液中的Vero 細胞DNA 殘留量，確定該方法的適應性。

1.7數據采集及分析 采用ABI 7500Fast 熒光定量PCR 儀自帶分析軟件SDS v1.5.1 計算供試品的Vero細胞DNA濃度。

2 結果

2.1方法的驗證

2.1.1線性范圍 3次測定線性擬合的標準曲線R2均為0.999，斜率在-3.5 ～-3.4 之間，見表1。表明該方法在300 ～0.003 pg／μL之間具有良好的線性。

表1 線性范圍驗證結果Tab.1 Verification for linear range

2.1.2重復性和中間精密度 檢驗員1 供試品和加標供試品6 次平行測定結果的RSD分別為4.5%和1.0%，檢驗員2 供試品和加標供試品6 次平行測定結果的RSD分別為4.0%和1.6%，表明該方法重復性較好；兩名檢驗員12 次平行測定供試品和加標供試品結果的RSD分別為19.5%和12.2%，表明該方法中間精密度較好。見表2。

表2 重復性和中間精密度驗證結果（pg／μL）Tab.2 Verification for repeatability and intermediate precision（pg／μL）

2.1.3定量限 0.01、0.003、0.001和0.000 3 pg／μL濃度參考品6次重復測定結果間的RSD分別為16.4%、18.0%、20.2%和90.3%，回收率分別為130.3%、108.9%、86.7%和111.1%，見表3。標準品濃度為0.001 pg／μL時，測定結果滿足RSD≤30%，回收率在50%～150%，確定該方法的定量限為0.001 pg／μL。

表3 定量限驗證結果（pg／μL）Tab.3 Verification for quantitative limit（pg／μL）

2.1.4專屬性 使用樣品稀釋液與純化液稀釋液稀釋的供試品檢測值間的RSD為3.4%，加標供試品檢測值間的RSD為5.9%，見表4。表明樣品稀釋液對測定結果無明顯影響。

表4 專屬性驗證結果（pg／μL）Tab.4 Verification for specificity（pg／μL）

2.1.5耐用性 供試品和加標供試品于53、55 和57 ℃條件下孵育60 min 檢測結果間的RSD分別為1.6%和0.8%，見表5；供試品和加標供試品于55 ℃條件下孵育56、60 和64 min 檢測結果間的RSD分別為2.0%和7.1%，見表6。表明該方法在不同孵育溫度和孵育時間條件下耐用性良好。

表5 孵育溫度耐用性驗證結果（pg／μL）Tab.5 Verification for incubation temperature durability（pg／μL）

表6 孵育時間耐用性驗證結果（pg／μL）Tab.6 Verification for incubation time durability（pg／μL）

2.1.6準確度 6 次平行測定的加標供試品回收率在79% ～83%之間，供試品和加標供試品測定結果的RSD分別為4.5%和1.0%，見表7。表明該方法準確度較高。

表7 準確度驗證結果（pg／μL）Tab.7 Verification for accuracy（pg／μL）

2.2方法的適應性 5 批供試品的加標回收率均在50% ～150%之間，見表8。表明該方法檢測SARSCoV-2滅活疫苗（Vero 細胞）原液中宿主細胞DNA 殘留量適應性良好。

表8 適應性驗證結果Tab.8 Verification for applicability

3 討論

為了確保SARS-CoV-2 滅活疫苗（Vero 細胞）的安全性，需持續(xù)關注生產工藝中宿主細胞DNA 的去除程度［18-19］。由于Vero 細胞易培養(yǎng)、生長快、能進行規(guī)?；牟《九囵B(yǎng)，人用滅活疫苗大多采用Vero 細胞作為基質進行生產。但宿主細胞DNA 潛在的致癌性和感染性仍是關注的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，Vero 細胞具有致瘤性，外源性DNA 的插入會導致原癌基因的激活及抑癌基因的失活［20-21］。宿主細胞DNA 殘留常被認為是疫苗制品存在的潛在危險因素，影響疫苗制品的安全性［22］。因此，Vero 細胞殘留DNA 檢測是疫苗生產過程中的關鍵質控點。

目前，熒光定量PCR 法主要分為SYBR GreenⅠ染料法和TaqMan探針法，其中SYBR GreenⅠ染料法成本較低，但特異性不強，易產生假陽性信號；TaqMan探針法需針對不同序列合成對應的探針，過程較復雜，成本偏高，但由于合成的擴增分子猝滅時釋放的熒光基團數量一定，不受擴增產物片段大小的影響，檢測結果更為準確［23-25］。本公司規(guī)定DNA 殘留量應不高于100 pg／劑，《中國藥典》三部（2020版）中未收載SARS-CoV-2 滅活疫苗（Vero 細胞）DNA 殘留量檢測的具體方法，本研究依據《中國藥典》三部（2020版）通則3407“外源性DNA 殘留量測定法”的定量PCR 法，選取磁珠法結合Taq-Man 探針法對本公司研制的SARS-CoV-2 滅活疫苗（Vero 細胞）原液進行方法建立及驗證。驗證結果顯示，建立的方法在0.003 ～300 pg／μL范圍內具有較好的線性，且重復性、中間精密度、耐用性良好，定量限為0.001 pg／μL，樣品稀釋液對測定結果無明顯影響，準確度較高，適用性良好。

綜上所述，本研究建立的熒光定量PCR 檢測方法操作簡單、檢測時間短、效率高、專屬性強、重復性好，可滿足SARS-CoV-2 滅活疫苗（Vero 細胞）中宿主細胞DNA殘留量檢測的需求。