劉娜，王亞萍，趙琳娜，王學碩，崔生輝

中國食品藥品檢定研究院，北京100050

腸道出血性大腸埃希菌（enterohemorrhagicEscherichia coli，EHEC）是一種人畜共患病的致瀉性大腸埃希菌［1］，會導致患者出現(xiàn)腹瀉、高燒、出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒綜合征等一系列疾?。?］，具有疾病發(fā)展速度快、病死率高等特點［3］，給人體健康造成嚴重傷害［4］。牛肉等肉制品以及蔬菜是EHEC 的重要來源［5-6］?；贓HEC 的強致病性，國內(nèi)外不少研究機構(gòu)對不同血清型的EHEC［7-8］，從不同層面［9-10］研究其致病機理［1，11-15］，以期將EHEC 感染風險降至最低［16-17］。而耐藥菌株以及多種亞型的出現(xiàn)［5，18］，擴大了EHEC 感染的潛在危害性，引起世衛(wèi)組織以及多個國家的高度重視［19］。

將EHEC 感染風險和致死率降至最低的關(guān)鍵是提升檢測能力和檢驗效率。目前，國內(nèi)檢驗EHEC的依據(jù)是GB4789.6-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗致瀉大腸埃希氏菌檢驗》，其中陽性對照一般至少需提前1 ～2 d 接種純化，遇到緊急檢驗任務時，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法遠不能滿足要求，因此，時效性一直是EHEC 檢驗乃至整個微生物檢驗的瓶頸。即用型EHEC 標準物質(zhì)可以緩解時間的緊迫性，但我國目前尚無此方面的報道。

我國在即用型微生物標準物質(zhì)研究方面起步較晚［20］，因此，需各一線實驗室依據(jù)實際工作需要研制相關(guān)標準物質(zhì)。本課題組通過篩選EHEC 菌株并將其申報為中國醫(yī)學細菌保藏管理中心（China Medical Bacterial Species Conservation and Management Center，CMCC）標準菌株，進一步研制了EHEC 菌株及其基因組DNA 標準物質(zhì)，并進行檢驗及使用效果評價，以期提高EHEC 檢驗的時效性，同時也彌補我國此方面的空白。

1 材料與方法

1.1菌株 160 株來源于腹瀉患者的大腸埃希菌為本實驗室保藏。

1.2主要試劑及儀器 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MAC 培養(yǎng)基、EMB 培養(yǎng)基和TSA 培養(yǎng)基購自美國BD 公司；生理鹽水購自中國國藥集團；腸道菌增菌肉湯購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；凍干保護劑由本院提供；VITEK COMPACT 2 全自動微生物分析系統(tǒng)購自法國梅里埃公司；基質(zhì)輔助激光電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix-Assisted Laser Desorption／Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）購自德國Bruker 公司；LABCONCO FreeZone12L冷凍干燥機購自德國LABCONCO 公司；HYC-940 螺旋涂布儀購自西班牙IΜL公司。

1.3菌株篩選與申報 依據(jù)GB4789.6-2016，從160株來源于患者的大腸埃希菌中篩選出EHEC菌株，按照CMCC管理規(guī)定，分別用MALDI-TOF MS、VITEK COMPACT 2及16s RNA基因序列測定方法確定菌株種屬，再測定eae、stx1、stx2基因序列，并在NCBI 上分析。將上述鑒定的相關(guān)材料提交至CMCC。

1.4EHEC菌株標準物質(zhì)的制備 將新鮮培養(yǎng)的EHEC標準菌株（2 代）經(jīng)5μm 濾膜過濾，重懸于凍干保護劑中，以20μL／樣品的方式進行速凍，通過比較凍干前后CFU 數(shù)目，計算凍干存活率。根據(jù)凍干存活率制備濃度適宜的菌懸液，以20μL／樣品的方式進行速凍，再于冷凍干燥機中進行冷凍干燥，制備樣品（103CFU／樣品）。將樣品放入2 mL 西林瓶中，用冷凍干燥機進行真空壓蓋，最終制備樣品600個。

1.5EHEC 基因組DNA 標準物質(zhì)的制備 用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取EHEC 標準菌株基因組DNA，用Qubit 熒光計檢測DNA 溶液濃度。依據(jù)預實驗結(jié)果，取20μg DNA，加入20 mL 凍干保護劑中，混勻，按照菌株標準物質(zhì)制備方法制備基因組DNA樣品（20 ng／樣品）600個。

1.6標準物質(zhì)的均勻性檢驗

1.6.1菌株標準物質(zhì) 從制備的EHEC 菌株樣品中隨機抽取20 瓶，每瓶溶解于1 mL 生理鹽水溶液中，通過螺旋涂布儀以E50 模式涂布于TSA 平板，每個樣品設(shè)2個平行，于（36±1）℃培養(yǎng)18 ～24 h后進行菌落計數(shù)，分析均勻性。依據(jù)GB4789.6-2016進行檢驗。

1.6.2基因組DNA 標準物質(zhì)從制備的EHEC 基因組DNA 樣品中隨機抽取20 瓶，每瓶溶解于0.1 mL去離子水中，取2μL 作為模板，依據(jù)GB4789.6-2016進行檢驗。

1.7標準物質(zhì)的穩(wěn)定性檢驗

1.7.1運輸穩(wěn)定性 將EHEC 菌株和基因組DNA 樣品置于25、37 ℃環(huán)境中，分別于1、3、5、7 d 各抽取3個樣品，按照均勻性檢驗方法檢測運輸穩(wěn)定性。其中菌株樣品以均勻性結(jié)果的CFU 均數(shù)為基數(shù)計算存活率。

1.7.2保存穩(wěn)定性 將EHEC 菌株和基因組DNA 樣品置于4、-20 ℃冰箱中，其中4 ℃保存的樣品分別于0、7、14、28 d 各抽取3 個，-20 ℃保存的樣品分別于28、60 d 各抽取3 個，按照運輸穩(wěn)定性檢測方法檢測保存穩(wěn)定性。

1.8協(xié)同標定組織3家有資質(zhì)的實驗室（代號為A、B、C）進行協(xié)同標定，向每家實驗室分別發(fā)放隨機抽取的EHEC 菌株和基因組DNA 樣品各10 個，并提供作業(yè)指導書。菌株樣品作業(yè)指導書內(nèi)容為：將每個樣品溶解于1 mL 生理鹽水中，使用渦旋振蕩器充分混勻作為原液，取100μL原液與900μL生理鹽水混勻，制成1∶10 稀釋液，分別取原液和稀釋液100μL，用L 棒或全自動螺旋涂布儀涂布于TSA 平板，設(shè)2 個平行，將平板置于（36±1）℃培養(yǎng)18 ～24 h后，統(tǒng)計樣品CFU數(shù)目，并依據(jù)GB4789.6-2016對菌落進行檢驗。

1.9使用效果評價 參考GB29921-2013《食品安全國家標準食品中致病菌限量》選擇20 種食品（呀土豆蜂蜜黃油薯片、呀土豆番茄薯片、呀土豆烤雞薯片、九日蜂蜜薯片、香老太五香腐乳、香老太秘制白腐乳、香老太秘制辣腐乳、香老太桂林腐乳、樂之餅干、太平餅干、老布特麥麩餅干、老布特南瓜餅干、愛優(yōu)諾優(yōu)益力特殊嬰兒配方奶粉、萌臻嬰兒配方羊奶粉、寶素力幼兒配方奶粉、貝因美特殊醫(yī)學用途嬰兒配方奶粉、老綏遠手撕風干牛肉、內(nèi)蒙古保牛乳業(yè)風干牛肉、大牧場手撕風干牛肉、草原心意手撕牛肉）作為基質(zhì)，對制備的EHEC 菌株樣品進行驗證。稱取每種基質(zhì)2 份（25 g／份），1 份作為驗證基質(zhì)，1 份作為本底對照。隨機取3 個菌株樣品，用3 mL 生理鹽水溶解作為待驗證菌液，取100μL 加入至各驗證基質(zhì)作為試驗組，另取100μL 生理鹽水加入至本底作為對照組，依據(jù)GB4789.6-2016進行檢驗。

1.10統(tǒng)計學分析 應用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，通過單因素方差分析方法分析均勻性檢驗數(shù)據(jù)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1菌株篩選與申報 從160株來源于患者的大腸埃希菌中篩選出1 株EHEC 菌株，eae、stx1、stx2基因擴增均為陽性，見圖1。依照CMCC相關(guān)規(guī)定提供生化、MALDI-TOF MS、16s RNA基因序列以及eae、stx1、stx2序列等鑒定資料，申報為標準菌株CMCC（B）43207。

圖1 EHEC菌株eae、stx1、stx2基因擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of amplification products of eae，stx1 and stx2 gene in EHEC strain

2.2標準物質(zhì)的均勻性 20 個EHEC 菌株樣品計數(shù)結(jié)果見表1。經(jīng)分析，數(shù)值分布符合正態(tài)分布，最大值為2 500 CFU／樣品，最小值為1 820 CFU／樣品，中位數(shù)為2 280 CFU／樣品，均值為2 286 CFU／樣品。經(jīng)單因素方差分析，差異無統(tǒng)計學意義［F菌株樣品=0.662 ＜FINV（0.05，19，20），P＞0.05］。

表1 EHEC樣品均勻性計數(shù)結(jié)果（×103 CFU／樣品）Tab.1 Uniformity counting results of EHEC samples（×103CFU／sample）

2.3標準物質(zhì)的穩(wěn)定性

2.3.1運輸穩(wěn)定性 EHEC 菌株樣品于25 和37 ℃存放7 d，樣品活菌數(shù)與設(shè)定的103CFU／樣品要求一致。EHEC基因組DNA樣品于25和37 ℃存放7 d后，eae、stx1、stx2基因均仍為陽性。進一步分析發(fā)現(xiàn)，于37 ℃存放時，隨著時間的延長，樣品中活菌數(shù)減少的速率加快，前3 d 活菌數(shù)無明顯變化，至5 d 時，活菌數(shù)減少達10%，至7 d時，又繼續(xù)減少約20%；而于25 ℃存放的樣品存活率明顯高于37 ℃存放的樣品。見表2。我國樣品運輸一般3 d內(nèi)到達，偏遠地區(qū)5 ～7 d 內(nèi)到達，制備的標準物質(zhì)仍滿足103CFU／樣品要求。

表2 EHEC樣品運輸穩(wěn)定性計數(shù)結(jié)果Tab.2 Counting results of transport stability of EHEC samples

2.3.2保存穩(wěn)定性 EHEC 樣品于-20 ℃保存60 d或4 ℃保存28 d后，樣品活菌數(shù)仍滿足設(shè)定的103CFU／樣品要求，見表3。EHEC 菌株樣品和基因組DNA 樣品于-20 ℃保存60 d、4 ℃保存28 d 后，eae、stx1、stx2基因均為陽性。

表3 EHEC樣品保存穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab.3 Results of preservation stability test of EHEC samples

2.4協(xié)同標定結(jié)果 隨機抽取的EHEC 菌株和基因組DNA 樣品經(jīng)3 家實驗室鑒定均為EHEC。3 家實驗室檢測樣品活菌含量均在103CFU／樣品的水平，見表4。且eae、stx1、stx2基因均為陽性。

表4 3家實驗室協(xié)作標定結(jié)果（×103 CFU／樣品）Tab.4 Collaborativecalibrationresultsof3laboratories（×103CFU／sample）

2.5使用效果評價 20 種食品中加入標準物質(zhì)均能檢出目標菌，而樣品本底均未檢出。

3 討論

EHEC 血清類型眾多［21-23］，且不同時間、不同區(qū)域國家EHEC 感染有不同的特點［24-25］。本研究通過從腹瀉患者來源的大腸埃希菌中篩選EHEC 菌株，并將其申報為CMCC標準菌株CMCC（B）43207，豐富了我國本土來源的EHEC 標準菌株數(shù)據(jù)庫，為今后我國相關(guān)標準修訂等奠定了基礎(chǔ)。在申報標準菌株的基礎(chǔ)上，進一步研制了自主知識產(chǎn)權(quán)的EHEC菌株及其基因組DNA 標準物質(zhì)，且兩種標準物質(zhì)均已被納入國家藥品標準物質(zhì)清單中，其中EHEC 菌株標準物質(zhì)編號為80024，基因組DNA 標準物質(zhì)編號為80056。-20 ℃可作為兩種標準物質(zhì)長期存放條件，而4 ℃可作為短期保存條件。EHEC 菌株及其基因組DNA 標準物質(zhì)不僅可用于加強對食品中EHEC 檢驗的質(zhì)量控制，還可用于實驗室內(nèi)部培養(yǎng)基質(zhì)量、陽性對照、方法確認、人員考核、檢驗環(huán)境等各環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制。此外，研制的EHEC 菌株及其基因組DNA標準物質(zhì)均不含基質(zhì)，既可直接使用，也可依據(jù)不同目的添加不同基質(zhì)，具有很強的靈活性，為今后EHEC的準確、快速檢驗提供了支持。

本實驗室對多個種屬菌株的凍干存活率均有研究，存活率最低的為副溶血弧菌（不足1%），而EHEC菌株的凍干存活率高達80%，高于很多糞腸球菌、金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌。初步表明在凍干過程中，革蘭陽性菌與革蘭陰性菌的細胞壁差異不是影響凍干存活率的關(guān)鍵因素。在大腸埃希菌種屬范圍內(nèi)比較，凍干存活率介于40%～80%之間，可見菌株種屬同樣不是影響凍干存活率的關(guān)鍵因素，凍干存活率的高低可能與菌體內(nèi)某條代謝途徑有關(guān)。在協(xié)同標定中關(guān)于菌株標準物質(zhì)的計數(shù)部分，本實驗室采取的是螺旋涂布儀接種，而組織的3 家實驗室采取的是L棒涂布方法。計數(shù)結(jié)果顯示，所有實驗室測得活菌數(shù)雖然均滿足103CFU／樣品的要求，但本實驗室測得數(shù)目普遍高于其他3 家實驗室，且樣品之間的誤差較小。造成此差異的原因可能是涂布方法的不同，螺旋涂布采用的是E50 模式，接樣針接觸培養(yǎng)基面積有限，且涂布軌跡清晰明確；而L 棒涂布則是用100 μL 樣品液進行涂布，L 棒接觸培養(yǎng)基的面積明顯大于螺旋涂布的接樣針，且涂布軌跡不如螺旋涂布儀統(tǒng)一，可能因此造成了誤差。

我國對EHEC 等微生物污染造成的食品安全問題高度重視。在保證結(jié)果準確可靠的前提下，優(yōu)化檢驗方法、提高時效性是國家對各微生物實驗室提出的新要求。本研究研制的EHEC 菌株及其基因組DNA 標準物質(zhì)可提高EHEC 檢驗的時效性，同時也彌補了我國在EHEC標準物質(zhì)方面的空白。