馬志宇，高向紅，龐焦，劉羽欣，李明玉，王從綱，李憲臻

大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034

異麥芽酮糖（α-D-吡喃葡萄糖基-1，6-果糖，isomaltulose）是蔗糖的同分異構(gòu)體，天然存在于蜂蜜、甘蔗汁中，甜度約為蔗糖的50%［1-3］。目前，異麥芽酮糖主要在食品工業(yè)中作為蔗糖的替代品用于保健品、糖尿病患者食品和運(yùn)動(dòng)飲料的生產(chǎn)中。此外，異麥芽酮糖還在化工領(lǐng)域中被用作生產(chǎn)一些表面活性劑和高分子聚合物的原材料，因此是一種具有較好發(fā)展前景的功能糖［4-5］。目前工業(yè)上主要利用蔗糖異構(gòu)酶（sucrose isomerase，SI）催化蔗糖轉(zhuǎn)化成異麥芽酮糖，相比利用化學(xué)法合成具有較大優(yōu)勢(shì)，如反應(yīng)條件溫和、制備過程綠色環(huán)保、反應(yīng)專一性較高等。由于異麥芽酮糖的應(yīng)用愈加廣泛，導(dǎo)致異麥芽酮糖市場(chǎng)需求量逐年增長，但其生產(chǎn)主要由國外公司壟斷，市場(chǎng)售價(jià)約1.5 萬元／噸，因此，提高SI 的利用率從而降低異麥芽酮糖的生產(chǎn)成本越發(fā)受到重視［6］。

目前已發(fā)現(xiàn)多種產(chǎn)SI 的細(xì)菌，包括大黃歐文菌（Erwinia rhapontici）、沙雷桿菌（Serratia plymuthica）、多源發(fā)散菌（Pantoea dispersa）和克雷伯桿菌（Klebsiella sp.）等［7］。但野生菌普遍產(chǎn)酶水平較低，難以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)要求，如Erwinia rhaponticiNX-5的發(fā)酵酶活為1.3 U／mL，Klebsiella sp.LX3 的發(fā)酵酶活為15.12 U／mL［8-9］。因此，目前研究人員主要通過異源表達(dá)手段制備重組SI，并將其固載于水不溶性載體上，制備成固定化酶以提高利用率。如利用ε-多聚-L-賴氨酸修飾的介孔TiO2及ε-多聚-L-賴氨酸和明膠制備的海綿對(duì)SI 進(jìn)行固定化，分別具有93.3%和84.5%的酶活力回收率［10-11］；利用殼聚糖-戊二醛交聯(lián)法、海藻酸鈉-羧甲基纖維素鈉混合包埋法及交聯(lián)酶聚集體法對(duì)SI進(jìn)行固定化，分別實(shí)現(xiàn)了70.3%、32.5%和30.9%的酶活力回收率［12］。綜上所述，通過傳統(tǒng)的吸附法、結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法雖然成功將SI 制備成固定化酶，但需要首先利用色譜技術(shù)對(duì)純酶進(jìn)行分離純化，進(jìn)一步利用水不溶性載體與純酶進(jìn)行固載反應(yīng)，該過程中的分離純化、制備載體和固定化反應(yīng)相關(guān)化學(xué)試劑均增加了固定化酶的生產(chǎn)成本，不利于固定化SI 的大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用［13］。近年研究發(fā)現(xiàn)，利用特定標(biāo)簽序列與酶蛋白融合表達(dá)，能夠誘導(dǎo)其在細(xì)胞內(nèi)形成具有催化活性的包涵體（catalytically-active inclusion bodies，CatIBs，簡稱活性包涵體），其表達(dá)量大、易分離純化、尤其是表達(dá)和固定化過程同步進(jìn)行，無需額外的載體材料及固載反應(yīng)，是一種新型自固定化酶，不僅在理論上改變了過去“包涵體是完全無活性的蛋白聚集體”的觀點(diǎn)，而且作為一種新型酶異源表達(dá)和固定化方法，具有較好的工業(yè)應(yīng)用潛力［14-15］。目前源于細(xì)胞表面蛋白tetrabrachion 的四聚化卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（tetrameric coiled-coli domain of the cell-surface protein tetrabrachion，TdoT）已被用作制備活性包涵體的融合標(biāo)簽，不僅成功制備出脂肪酶A、賴氨酸脫羧酶等活性包涵體，而且通過與苯甲醛裂解酶和乙醇脫氫酶融合后在胞內(nèi)成功制備出共定位活性包涵體，進(jìn)一步在體外實(shí)現(xiàn)了一鍋法級(jí)聯(lián)反應(yīng)（one-pot cascade reaction），表現(xiàn)出較好的適用性和效果［16-18］。

源自Klebsiella sp.LX3 的SI 具有較高蔗糖轉(zhuǎn)化率（99.5%）和主產(chǎn)物為異麥芽酮糖等優(yōu)勢(shì)［9，19］，本研究以其為研究對(duì)象，將TdoT 分別融合在去除自身天然信號(hào)肽序列的SI 的N／C-端，構(gòu)建重組表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)一步分離純化活性包涵體后進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征，從而為重組SI的異源表達(dá)和高效利用提供新策略。

1 材料與方法

1.1SI、質(zhì)粒及菌株 源自Klebsiella sp.LX3的SI（NCBI accession number：AAK82938）、攜帶不包含天然信號(hào)肽的SI編碼基因的質(zhì)粒pET-28a-SI、E.coliBL21（DE3）、E.coliDH10B、N／C-端分別融合有組氨酸標(biāo)簽的質(zhì)粒pET-24b-6 × His-SI和pET-24b-SI-6 × His 由大連工業(yè)大學(xué)生物催化技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室保存并提供；攜帶TdoT基因的質(zhì)粒pET-24a-TdoT由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成。

1.2主要試劑及儀器 卡那霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、Triton-X100、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、QuickCutTMBamHⅠ和QuickCutTMXho Ⅰ、DpnⅠ、T4 DNA連接酶、DNA和蛋白質(zhì)相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品購自寶生物工程（大連）有限公司；異麥芽酮糖購自美國Sigma 公司；其他化學(xué)試劑購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；Milli-Q超純水過濾系統(tǒng)購自美國Millipore公司；Infinite F50酶標(biāo)儀購自瑞士TECAN公司；PCR儀、電轉(zhuǎn)儀購自德國Eppendorf 公司；NanoVue plus 超微量紫外分光光度計(jì)、ImageQuant LAS4000 凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國通用電氣（中國）有限公司；高效液相色譜分析儀（Agilent Technologies 1260 Infinity）購自美國安捷倫科技公司；Thermo Fisher Scientific Hypersil APS-2，4.6 mm×250 mm，5μm氨基柱購自美國Thermo Fisher Scientific；UV5200 紫外分光光度計(jì)購自上海元析儀器有限公司。

1.3培養(yǎng)基及緩沖液配制 LB 液體培養(yǎng)基：含10 g／L胰蛋白胨、5 g／L酵母粉、10 g／L NaCl，pH 7.2；LB固體培養(yǎng)基：在LB 液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂；LLB培養(yǎng)基：含10 g／L胰蛋白胨、5 g／L酵母粉、5 g／L NaCl，pH 7.2。Buffer A緩沖液：Na2HPO4·12 H2O 16.937 g、NaH2PO4·2 H2O 0.62 g，溶于450 ～750 mL去離子水，調(diào)pH至8.0后，加入50 mL甘油，去離子水定容至1 L；Buffer B 緩沖液：取0.5 mL Triton-X100 溶于100 mL Buffer A 緩沖液；Buffer C 緩沖液：Na2HPO4·12 H2O 16.937 g、NaH2PO4·2 H2O 0.62 g，溶于450 ～750 mL去離子水，調(diào)pH至8.0后，用去離子水定容至1 L。

1.4重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 引物序列見表1，引物由吉林庫美生物科技有限公司合成。以pET-28a-SI為模板，利用引物P1／P2 擴(kuò)增含有酶切位點(diǎn)的SI基因片段。PCR 反應(yīng)體系：PrimeSTAR?HS DNA Polymerase 0.5 μL，5 × PrimeSTAR Buffer 10 μL，P1、P2 引物各2 μL，dNTP 4 μL，模板DNA 2 μL，加滅菌水至50μL。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃45 s，72 ℃2 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將回收的PCR 產(chǎn)物與pET-24a-TdoT用QuickCutTMBamHⅠ和QuickCutTMXhoⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，利用DNA 膠回收試劑盒回收線性化載體和目的基因片段，經(jīng)T4 DNA連接酶16 ℃連接15 h；連接產(chǎn)物利用熱激轉(zhuǎn)化至E.coliDH10B感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含50μg／mL 卡那霉素的LB 固體平板，挑取單菌落利用引物P5／P6 進(jìn)行菌落PCR 鑒定。PCR反應(yīng)體系：rTaq DNA Polymerase 0.2μL，10×rTaq Buffer 2 μL，P5、P6 引物各2 μL，dNTP 1.6 μL，模板菌液1μL，加滅菌水至20μL。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；94 ℃30 s，53 ℃30 s，72 ℃3 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將驗(yàn)證正確的陽性單克隆繼續(xù)培養(yǎng)和提取質(zhì)粒后送吉林庫美生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pET-24a-TdoT-SI。采用RF（restriction free-cloning）克隆技術(shù)構(gòu)建pET-24b-SITdoT表達(dá)載體［20］：以pET-24a-TdoT為模板，利用引物P3／P4進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：PrimeSTAR?HS DNA Polymerase 0.5 μL，5 × Prime-STAR Buffer 10 μL，P3、P4 引物各2 μL，dNTP 4 μL，模板DNA 2μL，加滅菌水至50μL。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃45 s，72 ℃30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，利用DNA 膠回收試劑盒進(jìn)行回收，將其作為第2 輪PCR 反應(yīng)的長引物，繼續(xù)以pET-24b-SI-6 ×His為模板進(jìn)行第2輪PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：PrimeSTAR?HS DNA Polymerase 0.25μL，5×Prime-STAR Buffer 5 μL，dNTP 2 μL，第1 輪PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物2μL，pET-24b-SI-6×His質(zhì)粒1μL，加滅菌水至25μL。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；94 ℃60 s，65 ℃60 s，68 ℃10 min，共15 個(gè)循環(huán)；94 ℃60 s，55 ℃50 s，68 ℃8 min，共20 個(gè)循環(huán)；最后68 ℃延伸15 min。反應(yīng)結(jié)束加入DpnⅠ分解模板質(zhì)粒后，將反應(yīng)產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化至E.coliDH10B 感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含50μg／mL卡那霉素的LB固體平板，挑取單菌落利用引物P5／P6進(jìn)行菌落PCR鑒定，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與E.coliDH10B／pET-24a-TdoT-SI相同。將驗(yàn)證正確的陽性單克隆繼續(xù)培養(yǎng)和提取質(zhì)粒后送吉林庫美生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為為pET-24b-SI-TdoT。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 將pET-24a-TdoT-SI和pET-24b-SI-TdoT以及pET-24b-6×His-SI和pET-24b-SI-6 × His 分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性單克隆，接種至5 mL含50μg／mL卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r／min 培養(yǎng)14 h，得到種子液；將種子液以1%接至含50μg／mL卡那霉素的LLB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r／min 培養(yǎng)至A600達(dá)0.6 ～0.8 時(shí)，加入誘導(dǎo)劑，其中重組工程菌E.coliBL21（DE3）／pET-24a-TdoT-SI加入終濃度為0.8 mmol／L的IPTG，E.coliBL21（DE3）／pET-24b-SI-TdoT加入終濃度為0.1 mmol／L 的IPTG，E.coliBL21（DE3）／pET-24b-6×His-SI和E.coliBL21（DE3）／pET-24b-SI-6 × His 加入終濃度為0.5 mmol／L 的IPTG，將上述加入IPTG的菌液繼續(xù)16 ℃，200 r／min培養(yǎng)20 h，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

1.6活性包涵體的分離純化 參考文獻(xiàn)報(bào)道的緩沖液清洗法對(duì)活性包涵體進(jìn)行分離純化［21］。將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液離心收集并用Buffer A重懸后，在冰水浴中超聲破碎（功率500 W，破碎3 s，間隔5 s，破碎20 min）；將破碎后的全菌樣品6 740×g離心15 min，分離可溶性上清和含有包涵體的沉淀組分；將沉淀依次用Buffer B 和Buffer C 洗滌2 和3 次后，6 740×g離心15 min 回收，Buffer C 充分懸浮后得到活性包涵體酶液；取少量活性包涵體酶液，加入等體積的10%SDS 溶液處理5 min 以徹底溶解包涵體，利用BCA 蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將細(xì)胞破碎上清液和洗滌后的活性包涵體樣品進(jìn)行12%SDS-PAGE檢測(cè)。

1.7活性包涵體酶活力檢測(cè) 取4 mg／mL活性包涵體酶液100μL，與含4%蔗糖的緩沖液400μL 混勻，在40 ℃下于200 r／min 反應(yīng)2 h 后，100 ℃沸水中處理15 min 進(jìn)行滅酶。將滅酶后的反應(yīng)產(chǎn)物6 740×g離心15 min，收集上清液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過后，進(jìn)行HPLC 檢測(cè)：利用Thermo Fisher Scientific Hypersil APS-2，4.6 mm × 250 mm，5 μm 氨基柱對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，采用示差檢測(cè)器，流動(dòng)相為乙腈∶水（80∶20），柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10μL，流速為1.0 mL／min。根據(jù)異麥芽酮糖標(biāo)準(zhǔn)品與其對(duì)應(yīng)峰面積擬合出的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)產(chǎn)物中異麥芽酮糖的濃度并計(jì)算酶活力。酶活力單位定義：以蔗糖為底物，每分鐘釋放1μmoL異麥芽酮糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。相對(duì)酶活定義：以同組的最高酶活為100%，計(jì)算所得比值為相對(duì)酶活。

1.8活性包涵體的酶學(xué)性質(zhì)表征

1.8.1最適反應(yīng)溫度確定 將活性包涵體酶液與含4%蔗糖的pH 6.0 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液混勻，分別在30、35、40、45、50、55 ℃條件下反應(yīng)并測(cè)定酶活力以確定最適反應(yīng)溫度。

1.8.2最適反應(yīng)pH 確定 將活性包涵體酶液分別與含4%蔗糖的pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液混勻，在最適反應(yīng)溫度下反應(yīng)并測(cè)定酶活力以確定最適反應(yīng)pH。 。

1.8.3酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)檢測(cè) 將活性包涵體酶液分別與不同濃度（10、20、40、50、100、200、250、400、500、800 mmol／L）蔗糖溶液混合，在最適反應(yīng)條件下進(jìn)行催化反應(yīng)后，采用HPLC法檢測(cè)產(chǎn)物異麥芽酮糖的生成量并計(jì)算反應(yīng)速度。利用GraphPad Prism 5.0 基于Michaelis-Menten 方程進(jìn)行非線性擬合得到動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和Vmax，并計(jì)算kcat／Km。

1.9產(chǎn)物特異性分析 將100 μL 濃度4 mg／mL 的TdoT-SI 活性包涵體酶液與400 μL 含4%蔗糖的pH 5.5 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液混勻；將100μL 濃度4 mg／mL 的SI-TdoT 活性包涵體酶液與400 μL 含4%蔗糖的pH 5.0 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液混勻。將上述活性包涵體轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系分別在30、35、40 ℃下，于200 r／min 反應(yīng)12 h 后，將酶轉(zhuǎn)化樣品經(jīng)100 ℃沸水處理15 min進(jìn)行滅酶，再經(jīng)6 740×g離心15 min 得到反應(yīng)產(chǎn)物上清，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后采用HPLC法檢測(cè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)物。

1.10數(shù)據(jù)采集及分析 采用EXCEL 2016 軟件分析數(shù)據(jù)，Origin 9軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定E.coliDH10B／pET-24a-TdoT-SI的菌落PCR 產(chǎn)物在1 500 ～2 250 bp 處可見單一條帶，大小與預(yù)期擴(kuò)增序列（2 055 bp）相符；E.coliDH10B／pET-24b-SI-TdoT的菌落PCR 產(chǎn)物在1 500 ～2250 bp處可見單一條帶，大小與預(yù)期擴(kuò)增序列（2 049 bp）相符。見圖1。測(cè)序結(jié)果表明質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖1 轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒工程菌的菌落PCR鑒定Fig.1 Colony PCR identification of engineered bacteria transformed with recombinant plasmid

2.2活性包涵體的鑒定E.coliBL21（DE3）／pET-24b-6×His-SI和E.coliBL21（DE3）／pET-24b-SI-6×His的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)12%SDS-PAGE分析，在相對(duì)分子質(zhì)量約66 400 處可見與6×His-SI 和SI-6×His 理論相對(duì)分子質(zhì)量（68 14 0）相符的目的蛋白條帶，且主要以包涵體形式表達(dá)，經(jīng)酶活力檢測(cè)包涵體沉淀無催化活性，表明無論在N／C-端融合組氨酸標(biāo)簽，重組SI蛋白均主要以無活性包涵體形式表達(dá)。見圖2。

圖2 重組6×His-SI和SI-6×His 的SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins of 6 ×His-SI and SI-6×His

E.coliBL21（DE3）／pET-24a-TdoT-SI和E.coliBL21（DE3）／pET-24b-SI-TdoT的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)12%SDS-PAGE分析，可見與TdoT-SI和SI-TdoT理論相對(duì)分子質(zhì)量（73 180）相符的目的條帶，表明融合蛋白成功被誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白TdoT-SI 和SITdoT 仍主要以包涵體形式存在于沉淀樣品中；將包涵體進(jìn)行酶活檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其具有較高催化活性，表明融合TdoT標(biāo)簽誘導(dǎo)SI表達(dá)為活性包涵體。見圖3。

圖3 重組TdoT-SI和SI-TdoT 的SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins of TdoTSI and SI-TdoT

2.3活性包涵體的酶學(xué)性質(zhì)表征

2.3.1最適反應(yīng)溫度 TdoT-SI 和SI-TdoT 活性包涵體均在40 ℃時(shí)具有最高酶活力，并且在30 ～40 ℃，酶活力隨溫度升高而增加，在35 ～45 ℃，二者均具有超過80%的酶活力，高于45 ℃后，TdoT-SI和SI-TdoT活性包涵體酶活力均迅速下降。見圖4。

圖4 溫度對(duì)TdoT-SI 和SI-TdoT酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on enzymatic activity of TdoTSI and SI-TdoT

2.3.2最適反應(yīng)pH pH 4.0 ～5.0時(shí)，隨著pH升高，TdoT-SI 和SI-TdoT 活性包涵體酶活力均增加，并且分別在pH 5.5 和5.0 時(shí)具有最高酶活力；pH 5.0 ～6.0時(shí)，二者均具有超過80%的催化活性，在pH高于6.5后，酶活力迅速下降。見圖5。

圖5 pH對(duì)TdoT-SI 和SI-TdoT酶活力的影響Fig.5 Effect of pH on enzymatic activity of TdoT-SI and SITdoT

2.3.3酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù) 在最適反應(yīng)條件下測(cè)定TdoT-SI 和SI-TdoT 活性包涵體的比活力分別為（622.6±17.5）和（252.6±17.1）U／g。TdoT-SI對(duì)底物蔗糖的Km為（103.9 ± 9.5）mmol／L，Vmax為（3761 ±113.3）μmol／（L·min），kcat為（5.7 ± 0.2）s-1，kcat／Km為（0.06 ± 0.002）L／（mmol·s）；SI-TdoT 對(duì)底物蔗糖的Km為（54.4 ± 6.6）mmol／L，Vmax為（1 141.0 ±37.3）μmol／（L·min），kcat為（1.7 ± 0.09）s-1，kcat／Km為（0.03±0.002）L／（mmol·s），表明TdoT標(biāo)簽融合在SI 的N／C-端形成的活性包涵體對(duì)底物蔗糖具有不同的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，SI-TdoT 與底物蔗糖的結(jié)合能力更強(qiáng)，但催化效率略低于TdoT-SI。

2.4產(chǎn)物特異性 TdoT-SI 和SI-TdoT 活性包涵體在30 ～40 ℃，轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)物中的異麥芽酮糖含量并無較大幅度的變化，而產(chǎn)物中海藻酮糖的含量普遍隨轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度的升高而呈降低的趨勢(shì)，同時(shí)單糖（果糖和葡萄糖）含量隨溫度升高而增加。見表2。

表2 不同溫度下融合TdoT 標(biāo)簽SI 催化產(chǎn)物組成分析（%，x ±s，n=2）Tab.2 Composition analysis of catalytic reaction products of SI fused with TdoT tag at different temperatures（%，x±s，n=2）

3 討論

目前我國由于對(duì)異麥芽酮糖生產(chǎn)相關(guān)的主要酶制劑SI 的制備及應(yīng)用存在技術(shù)瓶頸，導(dǎo)致異麥芽酮糖的生產(chǎn)成本和價(jià)格較高，影響了市場(chǎng)拓展。將SI進(jìn)行固定化有望提高其利用率，傳統(tǒng)方法雖然有效提高了SI的利用率，但由于固定化反應(yīng)需要采用載體材料和額外的固定化反應(yīng)試劑，且需要首先得到純酶，因此在工業(yè)上應(yīng)用會(huì)增加額外的分離純化和制備成本［10-12］。本研究通過融合TdoT標(biāo)簽誘導(dǎo)SI形成活性包涵體，其表達(dá)和固定化同步進(jìn)行，無需額外的載體材料和固定化反應(yīng)而且分離純化過程簡單，相比傳統(tǒng)固定化方法具有較大優(yōu)勢(shì)。

將酶進(jìn)行固定化通常會(huì)導(dǎo)致其空間構(gòu)象發(fā)生變化進(jìn)而影響酶活力，有研究報(bào)道，利用ε-多聚-L-賴氨酸修飾的介孔TiO2固載SI 的比活力為39.41 U／g，利用ε-多聚-L-賴氨酸和明膠制備的海綿對(duì)SI 進(jìn)行固定化，比活力為71.58 U／g［10-11］。本研究通過將SI在細(xì)胞內(nèi)同步表達(dá)和固定化制備成活性包涵體，不僅無需載體材料和額外的固定化反應(yīng)，且TdoT-SI和SI-TdoT 活性包涵體的比活力分別為（622.6±17.5）和（252.6±17.1）U／g，表明具有較高的酶活力。此外，本研究產(chǎn)物特異性分析結(jié)果顯示，制備的2種活性包涵體與文獻(xiàn)報(bào)道的源自Klebsiellasp. LX3、Klebsiella pneumoniaeNK33-98-8 等SI 的產(chǎn)物特異性類似，即均在30 ～40 ℃，隨轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度的提高海藻酮糖含量下降，同時(shí)單糖含量增加，但異麥芽酮糖的含量無明顯變化，表明將SI 表達(dá)為活性包涵體后仍具有較好的產(chǎn)物特異性［19，22］。

本研究通過融合表達(dá)技術(shù)，利用卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域TdoT 作為融合標(biāo)簽成功將SI 表達(dá)為活性包涵體，實(shí)現(xiàn)了表達(dá)和固定化的同步進(jìn)行，其作為一種新型自固定化酶，無需載體材料和用于傳統(tǒng)固定化反應(yīng)的化學(xué)試劑，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，本研究也進(jìn)一步證實(shí)了其他文獻(xiàn)中提出的觀點(diǎn)，即相比無活性的包涵體，活性包涵體具有特定的空間組織結(jié)構(gòu)，從而使包涵體中包含部分酶蛋白的類天然結(jié)構(gòu)，因此表現(xiàn)出酶活力［23-26］，從而促進(jìn)了關(guān)于包涵體結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的理論研究。由于TdoT 標(biāo)簽融合在SI 的N／C-端形成的活性包涵體對(duì)底物蔗糖表現(xiàn)出不同的動(dòng)力學(xué)常數(shù)，表明形成的活性包涵體由于微觀結(jié)構(gòu)的不同影響了與底物的結(jié)合和催化過程，因此，后續(xù)研究可針對(duì)活性包涵體進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析以闡明影響其形成和功能活性的分子機(jī)制，從而為進(jìn)一步的精細(xì)設(shè)計(jì)和優(yōu)化奠定基礎(chǔ)，促進(jìn)SI 的高效制備進(jìn)而降低異麥芽酮糖的生產(chǎn)成本。