高 靜,常 暢,李志強,郝文斌,王常娟,周 蕾,錢曉蕾,武海博,王琳冬

(河北北方學院附屬第二醫(yī)院,河北 張家口 075100)

子癇前期是妊娠特異性并發(fā)癥的一種,其全球發(fā)病率為5%～7%［1］。在妊娠20周左右,患有子癇前期的孕婦會出現(xiàn)伴或不伴有蛋白尿的高血壓,會導致不良妊娠結(jié)局［2］。目前研究認為“兩階段紊亂理論”是導致子癇前期發(fā)生發(fā)展的機制,著床異常和胎盤缺氧可誘導自由基和缺氧誘導因子-1ɑ(HIF-1ɑ)的產(chǎn)生［3］。其中胎盤缺氧可導致滋養(yǎng)層細胞凋亡,進而影響滋養(yǎng)層的侵襲和螺旋動脈的重塑;HIF-1ɑ高表達可影響胎盤的發(fā)育,可導致胎盤滋養(yǎng)層細胞相關(guān)疾?。?］,且可誘發(fā)可溶性FMS樣酪氨酸激酶-1通過胎盤進入母體循環(huán)并抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和胎盤生長因子(PIGF)的產(chǎn)生,導致母體內(nèi)皮功能障礙［5］。有證據(jù)表明,妊娠期高血壓病與不同微小RNA(miRNA)表達的改變有關(guān),miRNA是小的非編碼RNA(19～22 nt),參與靶mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,其與許多生物學和病理過程密切相關(guān),包括細胞增殖、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生等［6］。其中miR-20ɑ-5p已被證實可作為妊娠糖尿病患者早期篩查的生物標志物［7］,其可通過調(diào)控VEGF/Akt軸的激活而參與H2O2誘導的滋養(yǎng)層細胞凋亡［8］。然而miR-20ɑ-5p和HIF-1ɑ在子癇前期中的相關(guān)作用仍不清楚,本研究基于生物信息學探討了二者的表達與子癇前期發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其相互作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月—2019年12月在河北北方學院附屬第二醫(yī)院接受治療,且符合第 7版《婦產(chǎn)科學》中重度子癇前期臨床診斷標準的58例孕婦作為子癇前期組,年齡20～35(26.2±5.1)歲,妊娠(31.77±2.98)周,排除合并慢性高血壓、腎病、糖尿病、其他內(nèi)科疾病及嚴重的全身性疾病者,臨床及隨訪資料不完整者。另選取同期健康妊娠孕婦56例作為健康組,年齡20～36(26.8±5.3)歲,妊娠(38.17±1.48)周。2組年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經(jīng)河北北方學院附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準(2021124D),所有入選者均對研究知情同意。

1.2研究方法 記錄2組分娩新生兒體重［按照均數(shù)2 495 g分為低體重兒(≤2 495 g)和高體重兒(>2 495 g)］,采用qRT-PCR檢測2組孕婦分娩后胎盤組織中HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p表達情況,分析HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p間的相關(guān)性及與子癇前期預后的關(guān)系,通過miRDB、TargetScan和miRWalk網(wǎng)站分析二者間的潛在機制。

1.3胎盤組織中HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p表達檢測方法 收集2組孕婦分娩后臍帶附著處旁邊的胎盤組織200 mg,置于PE管中行qRT-PCR檢測。采用ABI PRISM 7500熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems,Foster City,CA,U.S.A),TRIzol試劑(Takara,Qingdao,China)進行RNA的提取;根據(jù)說明書的要求采用PrimeScript RT試劑盒和gDNA Eraser(TakaRa Bio Inc., Shiga,JP)將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA;采用SuperScripll試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,California,U.S.A)將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。相對定量通過GAPDH進行歸一化。設(shè)計PCR引物序列:miR-20ɑ-5p 上游為5’-ATTTCACGAATATCACGT-3’,下游為5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’;HIF-1ɑ 上游為5’-CGAAGCCCTGAAAGCG-3’,下游為5’-GGCTGTCCGACTTTGA-3’;GAPDH 上游為5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’,下游為5’-TGTAGACCATGTA GTTGAGGTCA-3’。用Sequence Detection Software(version 1.4.0.25)分析軟件,以2- ΔΔCt法計算各基因在標本中的表達量。

1.4生物信息學分析方法 為了明確調(diào)控HIF-1ɑ的上游miRNA,將HIF-1ɑ分別輸入 miRDB(http://mirdb.org)、TargetScan(https:// www.targetscan. org)和miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)網(wǎng)站(三大網(wǎng)站均是預測哺乳動物mRNA和miRNA靶基因的在線工具)篩選參與調(diào)控HIF-1ɑ的靶miRNA,得到的靶miRNA通過FunRich軟件(version3.1.3)進行韋恩圖分析,采用Cytoscape軟件(version3.9.1)進行PPI圖繪制。

2 結(jié) 果

2.12組娩新生兒體重及胎盤組織中HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p表達情況 子癇前期組新生兒體重660～4 200 g,健康組新生兒體重2 555～4 260 g;子癇前期組胎盤組織中HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p相對表達量均明顯高于健康組(P均<0.05),Pearson分析發(fā)現(xiàn)二者呈正相關(guān)(r=0.466,P<0.05)。見圖1。

圖1 健康組和子癇前期組胎盤組織中HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p表達情況及二者相關(guān)性

2.2HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p表達與子癇前期預后的關(guān)系 將年齡、孕周、HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p作為協(xié)變量,新生兒體重作為因變量進行Logistics多因素分析,結(jié)果HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p高表達、孕周為子癇前期并發(fā)不良后果的風險因子(P均<0.05),其中HIF-1ɑ、miR-20ɑ-5p高表達子癇前期者發(fā)生新生兒低體重的風險分別是非HIF-1ɑ、miR-20ɑ-5p高表達者的2.351倍和2.074倍,見圖2。將新生兒體重作為子癇前期不良因素的預測指標,結(jié)果HIF-1ɑ、miR-20ɑ-5p均為子癇前期預后不良的預測因子,二者靈敏度和特異度分別為99.1%,94.6%和100%,94.4%,見圖3。

圖2 HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p預測子癇前期并發(fā)不良后果的風險評估

圖3 HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p對子癇前期并發(fā)不良后果的預測價值

2.3HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p相關(guān)性及其機制miRDB、TargetScan和miRWalk網(wǎng)站調(diào)控HIF-1ɑ表達的miRNA分別有36個、1 101個和1 842個,三者共有的miRNA有22個,分別為miR-18ɑ-5P、miR-18b-5p、miR-493-5p、miR-589-3p、miR-580-3p、miR-20ɑ-5P、miR-93-5P、miR-106ɑ-5P、miR-17-5p、miR-330-3p、miR-155-5p、miR-338-5p等,其中miR-20ɑ-5P的上調(diào)是導致子癇前期孕婦胎兒生長受限的因素之一,可作為其早期篩查的生物標志物,見圖4及圖5。通過TargetScan網(wǎng)站分析,HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5P的結(jié)合位點是miR-20ɑ-5p第2-8nt與HIF-1ɑ 3’UTR完全配對,見圖6。

圖4 miRDB、TargetScan和miRWalk工具中HIF-1ɑ靶向miRNA的韋恩圖

圖5 miRDB、TargetScan和miRWalk工具中HIF-1ɑ共同靶向miRNA的PPI圖

圖6 HIF-1ɑ和靶miR-20ɑ-5p的結(jié)合位點

3 討 論

子癇前期是妊娠相關(guān)的并發(fā)癥之一,缺氧、免疫和炎癥相關(guān)通路在子癇前期發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［9］。慢性缺氧可導致子宮胎盤血管阻力增加,誘發(fā)血壓的變化,促進子癇前期進展［10］。且胎盤缺氧后復氧會導致滋養(yǎng)細胞自噬-溶酶體間關(guān)鍵因子的失衡,加重滋養(yǎng)層細胞的損傷［11］。HIF-1ɑ的過表達提示細胞內(nèi)缺氧,也是缺氧的重要標志之一［12］。多項研究發(fā)現(xiàn),HIF-1ɑ高表達可介導胎盤的氧化損傷和胎盤應激反應途徑的激活,這可能與胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池的擴張和抗血管生成因子的表達增加有關(guān),致使血管生成失衡［13-14］。本研究結(jié)果顯示,子癇前期組胎盤組織中HIF-1ɑ表達量明顯高于健康組,且HIF-1ɑ的高表達是導致子癇前期預后不良的風險因素,同時可作為子癇前期新生兒低體重的預測指標,說明缺氧的持續(xù)存在不僅誘導子癇前期的發(fā)生,而且是導致子癇前期相關(guān)不良并發(fā)癥的潛在風險因素。

miRNA是一類內(nèi)源性具有調(diào)控功能的非編碼RNA,參與基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯［15］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),miR-20ɑ-5p/HIF-1ɑ軸的上調(diào)可促進結(jié)直腸癌細胞的增殖及其有氧糖酵解［16］;在視網(wǎng)膜血管病變中,miR-20ɑ-5p通過介導HIF-1ɑ的表達,進而誘導血管內(nèi)皮細胞分泌VEGF,促進血管生成［17］;在子癇前期患者中,miR-20ɑ-5p顯著上調(diào),其可作為妊娠相關(guān)并發(fā)癥,特別是心血管疾病的危險因子,機制可能與其介導內(nèi)皮功能障礙有關(guān)［18］。本研究發(fā)現(xiàn),子癇前期組胎盤組織中miR-20ɑ-5p表達量明顯高于健康組,提示其上調(diào)可能是導致子癇前期發(fā)生的重要因素,與多項研究結(jié)果一致［19-20］;相關(guān)性分析顯示,miR-20ɑ-5p的上調(diào)與HIF-1ɑ高表達有關(guān),二者存在正相關(guān)性;通過三大預測靶基因的網(wǎng)站分析,顯示miR-20ɑ-5p可調(diào)控HIF-1ɑ的表達。當然本研究還有些局限性,HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p僅檢測mRNA的水平,還需要深入研究其蛋白水平;HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p的相關(guān)性還需要進一步驗證。

綜上所述,子癇前期孕婦胎盤組織中HIF-1ɑ和miR-20ɑ-5p呈高表達,且二者呈正相關(guān)性,可作為子癇前期預后不良的預測因子,miR-20ɑ-5p可能通過調(diào)控HIF-1ɑ的表達參與子癇前期的發(fā)生發(fā)展。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。